河南省2021年境外輸入SARS-CoV-2全基因組測(cè)序分析

毋碧聰,宋 云,盧世棟,胡 曉,朱 琳,范 威,李 懿,張白帆,李東曉,衛(wèi)海燕,李金月,潘靜靜,許玉玲,葉 瑩,黃學(xué)勇,郭萬(wàn)申,馬紅霞

河南省疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所河南省傳染病病原生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450016

新型冠狀病毒SARS-CoV-2引起的新冠肺炎是以肺部病變?yōu)橹鞯募毙院粑纻魅静?病毒不斷變異進(jìn)化,傳染性、致病性等特點(diǎn)也均發(fā)生變化。河南省自2020年3月11日?qǐng)?bào)告首例境外輸入病例開(kāi)始,防范境外輸入病例導(dǎo)致的本地?cái)U(kuò)散流行成為疫情防控的重點(diǎn)。2021年國(guó)內(nèi)多地相繼出現(xiàn)境外輸入病例及陽(yáng)性物品引發(fā)的本土聚集性疫情[1-4]。本研究對(duì)河南省2021年85份境外輸入陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行了全基因組測(cè)序,分析其病毒株基因組變異和遺傳進(jìn)化特征,報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源收集2021年1月至12月符合測(cè)序條件的83例河南省境外輸入新冠肺炎確診病例的鼻/咽拭子標(biāo)本,以及2份境外輸入SARS-CoV-2陽(yáng)性物品標(biāo)本,共獲得85株病毒,送至河南省疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行基因測(cè)序。本研究符合2013年修訂的《赫爾辛基宣言》的要求。

1.2 病毒全基因組測(cè)序及序列分析按照病毒RNA/DNA核酸提取試劑盒(西安天隆科技有限公司)說(shuō)明書(shū)操作,提取病毒總RNA,并置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用ULSEN超靈敏度SARS-CoV-2全基因組捕獲試劑盒(V-090418-1型,北京微未來(lái)公司)進(jìn)行全基因組特異性擴(kuò)增,采用QIAquick PCR 純化試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)純化PCR 產(chǎn)物。應(yīng)用Nextera XT DNA Library Preparation試劑盒(美國(guó)Illumina公司)說(shuō)明書(shū)操作構(gòu)建DNA 測(cè)序文庫(kù),使用Illumina 測(cè)序平臺(tái)的Miseq測(cè)序儀進(jìn)行雙端測(cè)序。應(yīng)用CLC Genomics Workbench 20軟件對(duì)測(cè)序原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行序列拼接,并對(duì)核苷酸和氨基酸突變進(jìn)行分析,利用Pangolin 在線分型平臺(tái)(https://pangolin.cog?uk.io)和Nextclade在線分析平臺(tái)(https://clades.nextstrain.org/)進(jìn)行基因組分型。

1.3 生物信息學(xué)分析以GISAID平臺(tái)上的EPI_ISL_402119作為參考序列,應(yīng)用MAFFT在線比齊工具(https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/index.html)基于鄰近法對(duì)85株病毒的全基因組序列數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。Bootstrap 值設(shè)置為1 000。

2 結(jié)果

2.1 病毒株的基本信息85株病毒輸入來(lái)源于10個(gè)國(guó)家。根據(jù)Pangolin分型,85條序列分屬于18個(gè)進(jìn)化分支。非關(guān)切變異株(variants of concern,VOC)共4株(4.71%);Alpha變異株9株(10.59%),Beta變異株2株(2.35%),Omicron變異株5株(5.88%),Delta變異株65株(76.47%);未發(fā)現(xiàn)Gamma變異株。65株Delta變異株分屬12個(gè)亞分支,其中B.1.617.2 最多(19株)。根據(jù)Nextstrain分型法,85株分為20B、20I、20H、21A、21I、21J和21K等7種基因型。具體見(jiàn)表1。

表1 85株境外輸入SARS-CoV-2基本信息

2.2 病毒全基因組測(cè)序及分析結(jié)果核苷酸和氨基酸突變情況見(jiàn)表2。其中累計(jì)核苷酸和氨基酸突變數(shù)最多的是Delta株,Beta株最少。共享核苷酸和氨基酸突變位點(diǎn)最多的是Omicron株,非VOC病毒株最少。85株均存在C241T、C3037T、C14408T和A23403G核苷酸突變和P4715L、D614G氨基酸突變。如圖1所示,各類型病毒株共享S區(qū)A23403G核苷酸突變和D614G氨基酸突變。

圖1 各類型病毒株基因組S區(qū)共享核苷酸和氨基酸變異情況

表2 85株SARS-CoV-2核苷酸和氨基酸變異情況

2.3 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖2。85條基因組序列形成多個(gè)不同的進(jìn)化分支。與武漢參考株相比,非VOC、Alpha、Beta、Delta和Omicron株各自形成進(jìn)化分支。9株Alpha變異株位于同一進(jìn)化分支,主要是從6月柬埔寨入境的病例中分離的病毒株。2株Beta變異株位于同一進(jìn)化分支,均來(lái)自菲律賓。5株Omicron變異株位于同一進(jìn)化分支,均來(lái)自加拿大。65株Delta變異株又細(xì)分為多個(gè)亞分支,各亞分支具有明顯的地域特征,與入境地一致。

紫色:B.1.617.2;紅色:AY.23及AY.23.1;黃色:AY.122;藍(lán)色:AY.30;綠色:AY.31;粉色:AY.108

3 討論

對(duì)境外輸入SARS-CoV-2基因組的監(jiān)測(cè)可以及時(shí)了解世界范圍內(nèi)該病毒的變異情況、變異率及地域分布,對(duì)于新冠疫苗和抗病毒藥物的研發(fā)以及防控政策的制定有著重要意義。本研究對(duì)符合測(cè)序條件的2021年河南省境外輸入病例及陽(yáng)性物品進(jìn)行病毒測(cè)序,共獲得85株;Pangolin分型顯示85株分屬于18個(gè)不同的進(jìn)化分支,具有明顯的基因型多樣性;85株在核苷酸和氨基酸水平上均發(fā)生不同程度的突變,突變數(shù)量和突變位點(diǎn)呈現(xiàn)隨機(jī)性和多樣性;85株輸入來(lái)源國(guó)主要是緬甸、新加坡、菲律賓、俄羅斯、巴基斯坦、柬埔寨等與我國(guó)相鄰或接壤的國(guó)家,與我省2020年境外輸入來(lái)源國(guó)保持一致[5]。

2020年1月,SARS-CoV-2首次出現(xiàn)S 蛋白D614G突變;2021年11月,WHO認(rèn)定的VOC有5個(gè),分別為Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron[6]。在本研究中,85株中95.29%為VOC,主要是Alpha、Beta、Delta和Omicron,其中以Delta/B.1.617.2(22.53%)最多;所有病毒株均出現(xiàn)S 蛋白D614G突變,9株Alpha變異株S蛋白還存在A570D、P681H、T716I和S982A關(guān)鍵突變,部分具有L452R、T478K、N501Y和D1118H突變。研究[7]表明,D614G和N501Y可增強(qiáng)病毒與細(xì)胞受體ACE2的親和力,從而導(dǎo)致病毒致病性增強(qiáng)。2株Beta變異株S蛋白均存在A27S、D80A、D215G、K417N、E484K、N501Y和A701V突變,研究[8]證實(shí)K417N和E484K可增強(qiáng)病毒的免疫逃逸能力。65株Delta變異株累計(jì)核苷酸和氨基酸突變數(shù)為288個(gè)和171個(gè),但僅共享9個(gè)核苷酸變異和8個(gè)氨基酸變異,也反映了Delta變異株基因型具有多樣性;其S蛋白均存在P681R和D950N突變,部分還存在Q14H、T19R、G142D、R158G、L452R、T478K和N556K突變。研究[9]表明L452R、T478K及P681R可增強(qiáng)病毒的傳播力和免疫逃逸能力。然而,5株Omicron變異株的核苷酸及氨基酸突變數(shù)增加,核苷酸突變超過(guò)60個(gè),S蛋白區(qū)具有多達(dá)30個(gè)氨基酸變異。目前已有研究[10-12]表明,Omicron變異株具有N501Y、D614G、K417N、E484A、T478K關(guān)鍵突變,初步模型研究表明,相比Delta株,Omicron變異株具有更高的傳染性。

系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)顯示,65株Delta變異株占據(jù)絕大部分并形成不同的亞分支,而且各亞分支來(lái)源具有明顯的地域特征,尤其是9～11月期間的AY.23及AY.23.1分支均來(lái)自新加坡。然而,自2021年11月在南非出現(xiàn)新的變異株Omicron以來(lái),該變異株在世界各地的流行性逐步上升,我省在12月加拿大入境的病例中陸續(xù)檢出Omicron。

綜上所述,我省2021年境外輸入病毒株主要以VOC為主。結(jié)合全球毒株流行情況,持續(xù)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)我省境外輸入病毒株的進(jìn)化和變異特征,繼續(xù)完善我省境外輸入病毒基因庫(kù),可為疫情溯源提供科學(xué)依據(jù)。