WHAMM在食管鱗狀細胞癌組織中的表達及對EC109和KYSE510細胞生物學行為的影響

韓 娜,張 芳,劉小小,楊笑天,趙文超

1)鄭州大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450014 2)鄭州大學河南醫(yī)學院 鄭州 450052 3)鄭州大學基礎醫(yī)學院生理學與神經(jīng)生物學系 鄭州 450001

食管癌是世界上常見的惡性腫瘤之一,病理類型包括食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和腺癌[1-2]。在我國,90%以上的食管癌為ESCC[3-4]。ESCC患者的早期臨床癥狀并不典型,確診時往往處于中晚期,預后較差,5 a生存率較低[5-6]。維斯科特-奧爾德里奇綜合征蛋白(Wiskott-Aldrich syndrome protein,WASP)是一類肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白,可協(xié)助肌動蛋白相關蛋白2/3復合物(actin-related protein2/3 complex,Arp2/3)促進微絲的聚合,參與肌動蛋白細胞骨架的維持[7-8],調(diào)控細胞的吞噬、胞質(zhì)分裂、胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運和遷移等[9-10]。研究[11-12]表明,WASP家族的多個成員參與了宮頸癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌以及前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。肌動蛋白、細胞膜和微管相關的WASP同源物(WASP homolog associated with actin,membranes and microtubules,WHAMM)是WASP家族成員之一,在腫瘤中的作用尚未闡明。本研究觀察WHAMM在ESCC組織中的表達及對ESCC細胞生物學行為和患者預后的影響,探討WHAMM對ESCC發(fā)生發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標本的獲取選擇2020年11月1日至2021年12月30日于鄭州大學第二附屬醫(yī)院進行手術(shù)治療的ESCC患者22例,收集切除的ESCC組織以及配對的癌旁正常食管黏膜組織(距離腫瘤邊緣≥5 cm)標本。患者術(shù)前均未進行抗腫瘤治療。TNM分期按照國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合會食管癌分期標準(2017年第8版):Ⅰ期4例,Ⅱ期11例,Ⅲ期6例,Ⅳ期1例?；颊咧心?6例,女6例,年齡47～76歲,中位年齡65.5歲。本研究經(jīng)該院倫理委員會審查后批準,患者或家屬知情同意。

1.2 細胞和主要試劑人ESCC細胞系EC109和KYSE510購自上海中科院細胞庫。RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司。攜帶WHAMM過表達載體的慢病毒及攜帶空載體的對照病毒購自中國吉瑪基因公司。胎牛血清購自美國Gibco公司。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司。PrimeScript RT reagent反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。WHAMM一抗購自中國百遠生物公司,二抗購自美國Proteintech公司,CCK-8試劑購自中國索萊寶公司。Transwell小室購自美國康寧公司。

1.3 ESCC和癌旁正常食管黏膜組織中WHAMM mRNA的表達

1.3.1數(shù)據(jù)庫信息 收集基因表達綜合數(shù)據(jù)庫相關數(shù)據(jù)集(GSE67269和GSE161533)中ESCC組織和癌旁正常食管黏膜組織WHAMM mRNA表達的數(shù)據(jù)(n=75和28)并分析兩種組織中WHAMM mRNA表達的差異。收集癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中的有生存狀況的84例ESCC患者的相關數(shù)據(jù),分析WHAMM mRNA的表達與ESCC患者預后的關系。

1.3.2ESCC和癌旁正常食管黏膜組織中WHAMM mRNA表達的qRT-PCR檢測 ESCC和癌旁正常食管黏膜組織研磨后采用Trizol裂解,加入氯仿放置3 min后離心取上清,異丙醇沉淀RNA,體積分數(shù)75%的乙醇洗滌RNA沉淀兩次,無酶水溶解RNA后采用miScript Ⅱ RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。采用qRT-PCR檢測組織中WHAMM mRNA的表達。WHAMM上游引物序列5’-TATTGCAGCCATT TAGGGCTATG-3’,下游引物序列5’-GGCAACTAC CCTTCTAGGACC-3’。GAPDH上游引物序列5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’,下游引物序列5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。反應體系:10 μL熒光染料,終濃度為0.4 μmol/L的上、下游引物各4 μL,cDNA 0.4 μL,添加無酶水至總體積20 μL。反應條件:94 ℃預變性10 min;94 ℃ 10 s,60 ℃ 10 s,72 ℃ 10 s,40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,計算2-ΔΔCt,作為基因的表達水平。

1.4 細胞實驗

1.4.1細胞分組 取對數(shù)生長期的EC109和KYSE510細胞接種至24孔板(5×104個/孔),當細胞融合至80%時分兩組:過表達組細胞加入攜帶WHAMM過表達的慢病毒,陰性對照組加入攜帶空載體的對照病毒。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后加入嘌呤霉素(1 mg/L)篩選,采用熒光顯微鏡觀察細胞熒光。當感染效率達到80%以上時,用于以下實驗。

1.4.2WHAMM蛋白的Western blot檢測 PBS清洗各組細胞后加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液,冰上放置30 min后12 000 ×g離心10 min,提取上清后二喹啉甲酸法測定蛋白濃度,加入5×上樣緩沖液后煮沸5 min備用。制備濃縮膠和分離膠(80 g/L的SDS-PAGE),蛋白上樣后于150 mV電泳1.5 h,230 mV轉(zhuǎn)膜1.5 h,50 g/L脫脂牛奶封閉1 h后加入一抗4 ℃孵育過夜,清洗后50 g/L脫脂牛奶封閉1 h,加入二抗孵育1 h,加入增強型化學發(fā)光液后上機顯影。Image J分析各條帶灰度,以WHAMM和β-actin條帶的灰度值比值代表WHAMM蛋白表達水平。實驗重復3次。

1.4.3細胞增殖的CCK-8法檢測 取對數(shù)生長期的EC109和KYSE510細胞消化后重懸,接種于96孔板(4×103個/孔),于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于第1、2、3和4天棄去舊培養(yǎng)基,加入CCK-8試劑與無血清培養(yǎng)基(體積比為1∶9),培養(yǎng)箱中放置1.5 h后采用酶標儀測定450 nm處的吸光度。實驗重復3次。

1.4.4細胞遷移和侵襲能力檢測 處于對數(shù)生長期的EC109和KYSE510細胞消化后采用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基重懸,取200 μL細胞懸液(含5×104個細胞)加入Transwell上室,在Transwell下室加入600 μL培養(yǎng)基(體積分數(shù)10%FBS)培養(yǎng),24 h后固定30 min,結(jié)晶紫染色30 min,生理鹽水清洗后棉簽擦拭小室上層,100倍顯微鏡下觀察并拍照。侵襲實驗中,Transwell上室加入100 μL的基質(zhì)膠并放置24 h。采用Image J分析遷移或侵襲細胞數(shù)。實驗重復3次。

1.5 統(tǒng)計學處理應用SPSS 21.0分析數(shù)據(jù)。采用配對資料的t檢驗比較ESCC組織和癌旁正常食管黏膜組織中WHAMM mRNA的表達水平。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,Log-rank檢驗分析WHAMM mRNA的表達與患者預后的關系。兩組細胞WHAMM mRNA和蛋白的相對表達量,吸光度值、遷移和侵襲細胞數(shù)的比較采用兩獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ESCC組織和癌旁正常食管黏膜組織中WHAMM mRNA的表達GSE67269、GSE161533數(shù)據(jù)集和本研究收集標本中,ESCC組織中WHAMM mRNA的表達高于癌旁正常食管黏膜組織(表1)。

表1 ESCC組織和癌旁正常食管黏膜組織中WHAMM的表達

2.2 WHAMM的表達與ESCC患者生存的關系根據(jù)WHAMM mRNA表達的中位數(shù)8.964,將TCGA-ESCC數(shù)據(jù)集中的84例ESCC患者分為WHAMM低表達組(≤8.964)和WHAMM高表達組(>8.964),兩組生存曲線比較見圖1。WHAMM低表達組的生存狀況好于高表達組(χ2=5.155,P=0.023)。

圖1 WHAMM低表達組和高表達組患者的生存曲線

2.3 兩組EC109和KYSE510細胞中WHAMM蛋白的表達與陰性對照組比較,過表達組EC109和KYSE510細胞中WHAMM蛋白表達增加,見表2。

表2 兩組EC109和KYSE510細胞中WHAMM蛋白表達的比較

2.4 兩組EC109和KYSE510細胞增殖情況與陰性對照組比較,過表達組EC109和KYSE510細胞的增殖能力增加,見表3、4。

表3 兩組EC109細胞的吸光度值比較

表4 兩組KYSE510細胞的吸光度值比較

2.5 兩組EC109和KYSE510細胞的遷移和侵襲情況與陰性對照組比較,過表達組EC109和KYSE510細胞的遷移和侵襲能力增加,見表5。

表5 兩組EC109和KYSE510細胞的遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)比較

3 討論

微絲是細胞骨架的主要成分之一,參與細胞器的轉(zhuǎn)運、細胞形態(tài)的維持、大分子物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運以及細胞遷移等[13-14]。WASP家族蛋白是一類成核促進因子,其C末端的結(jié)構(gòu)域能夠與Arp2/3和肌動蛋白單體結(jié)合,促進微絲的成核反應,最終參與細胞的多種生物學功能[7,15]。WASP家族成員包括神經(jīng)元型WASP(neuronal-WASP,N-WASP)、WASP家族富含脯氨酸同源蛋白1(WASP family verprolin-homologous protein 1,WAVE1)、WAVE2、WAVE3以及WHAMM等[10]。研究發(fā)現(xiàn), N-WASP可促進宮頸癌細胞的遷移和侵襲[11],WAVE1可增加卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力等[16]。

本研究結(jié)果顯示ESCC組織中WHAMM mRNA表達高于癌旁正常食管黏膜組織,WHAMM高表達患者的生存時間較短,提示W(wǎng)HAMM可能促進了ESCC的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果亦顯示W(wǎng)HAMM促進了ESCC細胞的增殖、遷移和侵襲。這一作用同WAVE1在卵巢癌的作用類似[16]。WHAMM可促進視網(wǎng)膜上皮細胞內(nèi)自噬體的形成[17],而自噬可以影響細胞的增殖[18]。作者推測WHAMM可能通過促進自噬來增強ESCC細胞的增殖能力。微絲是組成細胞骨架的重要成分,其動態(tài)變化不僅是細胞遷移運動的基礎,也具有調(diào)節(jié)細胞侵襲功能的作用[19-20]。作者推測WHAMM可能通過促進微絲的聚合來促進ESCC細胞的遷移和侵襲,但是這些推測均需要進一步的實驗驗證。

綜上所述,WHAMM促進了ESCC細胞的增殖、遷移和侵襲,與患者的預后相關。