超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)養(yǎng)殖用非規(guī)范藥品及水中撲草凈、阿維菌素和伊維菌素的殘留量

陳永平 ,包 艷 ,許文龍 ,成振華 ,王 輝 ,韓現(xiàn)芹 ,時(shí)文博,王愿寧

(1.天津市農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心,天津 300193;2.中國(guó)科學(xué)院 青島生物能源與過(guò)程研究所,青島 266101)

在養(yǎng)殖用地不斷收縮、因地下水開采限制需養(yǎng)殖用水循環(huán)使用的形勢(shì)下,為了滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的水產(chǎn)品的需求,水產(chǎn)品高密度養(yǎng)殖成為增加產(chǎn)品供應(yīng)量的主要途徑之一。其中,閉環(huán)養(yǎng)殖是高密度養(yǎng)殖的常見(jiàn)模式,但閉環(huán)養(yǎng)殖易導(dǎo)致水質(zhì)惡化和水生物疾病頻發(fā),從而加劇藥物控制的依賴。促生長(zhǎng)劑、殺蟲劑、除雜劑和環(huán)境改良劑等非規(guī)范藥品因具有抗病、殺蟲、除草、促生長(zhǎng)等功能,備受養(yǎng)殖者的青睞。有些養(yǎng)殖者專門用撲草凈清除養(yǎng)殖水體中的絲狀藻類、大型草類及有毒藻類[1-2],用阿維菌素、伊維菌素殺滅單養(yǎng)和混養(yǎng)池塘水體中、增殖水體中,以及與魚體體表寄生的錨頭鳋、中華鳋、魚鲺、線蟲、指環(huán)蟲、三代蟲等寄生蟲及松藻蟲、水蜈蚣等水生昆蟲等[3-5],致使?jié)O業(yè)養(yǎng)殖水環(huán)境受到撲草凈、阿維菌素、伊維菌素等殘留污染。非規(guī)范藥品殘留會(huì)對(duì)水生生物及浮游生物產(chǎn)生嚴(yán)重影響,也會(huì)通過(guò)食物鏈富集。當(dāng)人類食用含有撲草凈的水產(chǎn)品后,會(huì)引起人體免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)異常[6-7];食用少量阿維菌素、伊維菌素會(huì)產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)失調(diào)、呼吸緩慢、DNA 損傷等,過(guò)量會(huì)導(dǎo)致重度昏迷甚至死亡[8-11]。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部制定《2020年水產(chǎn)養(yǎng)殖用獸藥及其他投入品安全隱患排查計(jì)劃》,加大了對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖用非規(guī)范藥品中藥物的監(jiān)督及排查力度。由于非規(guī)范藥品為新型投入品,相關(guān)學(xué)者對(duì)其中藥物檢測(cè)技術(shù)研究較少,尚無(wú)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)或方法依據(jù)可參考,這給非規(guī)范藥品中藥物的監(jiān)督、監(jiān)測(cè)造成較大困難,因此開發(fā)非規(guī)范藥品中藥物檢測(cè)技術(shù)十分必要。

目前阿維菌素的主要檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法[12-14]、液相色譜法[15-22]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[23-30],液相色譜法靈敏度低,干擾影響因素多,而采用熒光檢測(cè)器時(shí)涉及衍生化處理,操作復(fù)雜,而高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有高選擇性和高靈敏度,應(yīng)用較為廣泛。撲草凈的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[31-32]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[33]、氣相色譜法[34]、氣相色譜-質(zhì)譜法[35-36]和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法[1]等,但水產(chǎn)養(yǎng)殖用非規(guī)范藥品及水中上述藥物的同時(shí)測(cè)定方法還未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此,本工作采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)養(yǎng)殖用非規(guī)范藥品及水中撲草凈、阿維菌素和伊維菌素的殘留量。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

AB 5500 Qtrap 型三重四極桿質(zhì)譜儀;SHIMAD LC-30AD 型超高效液相色譜儀;SIMGA 3-18KS型高速冷凍離心機(jī);IKA-T25型高速組織勻漿機(jī);MS1 Mini-shaker型渦輪振蕩器;Milli-Q 型純水器;NPO HLB固相萃取柱(6 mL/500 mg)。

單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:100 mg·L－1,準(zhǔn)確稱取撲草凈、阿維菌素、伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg,分別用甲醇溶解并定容至100 mL,配制成質(zhì)量濃度為100 mg·L－1的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,于－18 ℃避光保存。同法配制內(nèi)標(biāo)(撲草凈-d6)儲(chǔ)備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:取撲草凈標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.1 mL,阿維菌素、伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各1.0 mL,用含0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液溶解并定容至100 mL,配制成撲草凈質(zhì)量濃度為0.1 mg·L－1,阿維菌素、伊維菌素的質(zhì)量濃度均為1.0 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

內(nèi)標(biāo)溶液:1.0 mg·L－1,移取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液1.0 mL,用含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液稀釋并定容至100 mL,配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg·L－1的內(nèi)標(biāo)溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:移取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以及內(nèi)標(biāo)溶液,用含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液稀釋,配制成撲草凈的質(zhì)量濃度為0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,15.0μg·L－1,阿維菌素、伊維菌素的質(zhì)量濃度為2.0,5.0,10.0,20.0,50.0,100.0,150.0μg·L－1,內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為10μg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

撲草凈、阿維菌素、伊維菌素、撲草凈-d6標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于98%;甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨均為色譜純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC C18色譜柱(100.0 mm×2.1 mm,1.7μm);流量0.2 mL·min－1;柱溫40℃;進(jìn)樣體積5.0μL;流動(dòng)相A 為含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液,B 為甲醇。梯度洗脫程序:0～6.0 min時(shí),B 由30%降至0,保持4.0 min;10.0～10.1 min時(shí),B由0跳轉(zhuǎn)至30%,保持2.9 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子(ESI)源,正離子(ESI＋)掃描模式;離子源溫度550 ℃;氣簾氣壓力138 k Pa;碰撞誘導(dǎo)解離(CAD)設(shè)置Medium;噴霧電壓4 500 V;輔助氣1壓力344 k Pa;輔助氣2壓力344 k Pa;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1,其中“*”代表定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的前處理

水產(chǎn)養(yǎng)殖用非規(guī)范藥品固態(tài)樣品處理:準(zhǔn)確稱取水產(chǎn)養(yǎng)殖用非規(guī)范藥品固態(tài)樣品1.00 g,加入1.0 mg·L－1撲草凈-d6溶液10μL 和水20 mL,經(jīng)均質(zhì)、超聲處理后離心5 min,取上清液用水定容至100 mL。

水產(chǎn)養(yǎng)殖用非規(guī)范藥品液態(tài)樣品處理:準(zhǔn)確稱取水產(chǎn)養(yǎng)殖用非規(guī)范藥品液態(tài)樣品1.00 g,加入1.0 mg·L－1撲草凈-d6溶液10μL 和水20 mL,經(jīng)渦旋振蕩混勻后離心5 min,取上清液用水定容至100 mL。

養(yǎng)殖水樣品處理:養(yǎng)殖水樣品經(jīng)0.45μm 濾膜過(guò)濾,取濾液200 mL,然后加入1.0 mg·L－1撲草凈-d6溶液10μL,振蕩混勻。

1.3.2 樣品的凈化

用5 mL甲醇、5 mL水活化NPO HLB固相萃取柱,充分浸潤(rùn)填料,以清洗固相萃取柱上的干擾雜質(zhì)以及溶劑殘留。將100 mL待凈化的樣品溶液以1滴/s的流量過(guò)已活化的NPO HLB 固相萃取柱,用5 mL水淋洗。用洗耳球?qū)⒐滔噍腿≈鶅?nèi)的淋洗液吹干,然后用6 mL甲醇洗脫于15 mL離心管中,再用洗耳球吹干。將洗脫液于40℃氮吹至近干,加入體積比3∶7 的甲醇-含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液(定容溶劑)1.0 mL,渦旋1 min,超聲振蕩1 min,轉(zhuǎn)入1.5 mL 離心管中,以轉(zhuǎn)速20 000 r·min－1離心5 min,所得溶液過(guò)0.2μm 濾膜,按照儀器工作條件測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動(dòng)相

為同時(shí)使撲草凈、阿維菌素、伊維菌素獲得理想的靈敏度與分離效果,試驗(yàn)選取了乙腈-含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液、甲醇-含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液、甲醇-水、乙腈-水等4種不同的流動(dòng)相體系進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明,與甲醇-水、乙腈-水流動(dòng)相體系相比,乙腈-含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液、甲醇-含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液流動(dòng)相體系可明顯提高離子化程度,在同等條件下,甲醇-含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液作為流動(dòng)相體系時(shí)目標(biāo)物的信號(hào)更強(qiáng),因此試驗(yàn)選擇甲醇-含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液作為流動(dòng)相體系。

2.1.2 色譜柱

保持其他條件不變,試驗(yàn)考察了Shim-pack XR-ODS C8柱(75.0 mm×2.1 mm,2.2μm)、Thermo C18柱(100.0 mm×2.1 mm,5.0μm)和Waters ACQUITY UPLC C18柱(100.0 mm×2.1 mm,1.7μm)等不同色譜柱對(duì)目標(biāo)物分離效果的影響,結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同色譜柱下目標(biāo)物的分離效果Fig.1 Separation effect of targets on different chromatographic columns

由圖1可知:以Shim-pack XR-ODS C8柱作為分離柱,阿維菌素、伊維菌素峰形較差,響應(yīng)強(qiáng)度較低;以Thermo C18柱作為分離柱,阿維菌素、伊維菌素半峰寬較寬,響應(yīng)強(qiáng)度較低;以Waters ACQUITY UPLC C18柱作為分離柱,目標(biāo)物峰形好,響應(yīng)強(qiáng)度高。因此,試驗(yàn)選擇Waters ACQUITY UPLC C18柱(100.0 mm×2.1 mm,1.7μm)作為色譜分離柱。

2.2 掃描模式的選擇

為獲得撲草凈、阿維菌素、伊維菌素較理想的信號(hào)強(qiáng)度,比較了ESI＋與電噴霧離子源負(fù)離子(ESI－)掃描模式下目標(biāo)物的響應(yīng)強(qiáng)度。結(jié)果表明:在ESI－掃描模式下,阿維菌素、伊維菌素響應(yīng)強(qiáng)度較低,按不小于3倍信噪比(S/N)計(jì)算,撲草凈的檢出限為5μg·kg－1,阿維菌素、伊維菌素的檢出限為100μg·kg－1;在ESI＋掃描模式下,以體積比3∶7的甲醇-含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液作為定容溶劑,各目標(biāo)物母離子[M＋NH4]＋響應(yīng)強(qiáng)度增大,按不小于3倍信噪比計(jì)算,撲草凈的檢出限可達(dá)到0.2μg·kg－1,阿維菌素、伊維菌素的檢出限可達(dá)到2.0μg·kg－1。因此,試驗(yàn)選擇ESI＋模式掃描。

2.3 固相萃取柱的選擇

試驗(yàn)分別以NPO HLB 柱、Waters OASIS HLB柱和CNW HLB 柱等3個(gè)品牌HLB 固相萃取柱(500 mg/6 mL)作為目標(biāo)物凈化提取柱,考察了不同HLB固相萃取柱對(duì)非規(guī)范藥品中3種目標(biāo)物的提取效果,結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同固相萃取柱下非規(guī)范藥品中3種目標(biāo)物的回收率Fig.2 Recovery of 3 targets in non-standard drugs by different solid phase extraction columns

結(jié)果表明:在相同條件下,Waters OASIS HLB柱凈化效果較好,但過(guò)柱時(shí)間長(zhǎng);NPO HLB柱過(guò)柱速率最快,回收效果好,但柱凈化效果稍差;CNW HLB柱過(guò)柱速率較快,凈化效果較好,但回收效果不理想。綜合考慮,大批量樣品處理采用NPO HLB柱作為固相萃取柱,同時(shí)滿足高效、準(zhǔn)確度高的要求。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

按儀器工作條件測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,撲草凈、阿維菌素、伊維菌素均以撲草凈-d6為內(nèi)標(biāo),用儀器自帶工作站按內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行自動(dòng)計(jì)算,以目標(biāo)物質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度的比值為橫坐標(biāo),以目標(biāo)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得目標(biāo)物的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。按不小于3倍信噪比分別計(jì)算非規(guī)范藥品和水樣中各目標(biāo)物的檢出限,按不小于10倍信噪比分別計(jì)算非規(guī)范藥品和水樣中各目標(biāo)物的測(cè)定下限,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測(cè)定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.5 精密度和回收試驗(yàn)

選取空白非規(guī)范藥品固態(tài)樣品和液態(tài)樣品、水樣為基質(zhì),分別進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平制備6個(gè)平行樣品,計(jì)算回收率及測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見(jiàn)表3和表4。

表3 在非規(guī)范藥品樣品基質(zhì)中的精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery in non-standard drug sample matrices(n＝6)

表4 在水樣基質(zhì)中的精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery in water sample matrix(n＝6)

結(jié)果表明:目標(biāo)物的回收率為84.8%～105%,測(cè)定值的RSD 為2.9%～8.4%。說(shuō)明方法適合水產(chǎn)養(yǎng)殖非規(guī)范藥品及水中撲草凈、阿維菌素、伊維菌素的殘留測(cè)定。

2.6 樣品分析

按照試驗(yàn)方法分析天津市場(chǎng)的80個(gè)非規(guī)范藥品與水樣(包括殺蟲劑、促生長(zhǎng)劑、水質(zhì)改良劑、底質(zhì)改良劑、微生態(tài)制劑、水產(chǎn)養(yǎng)殖用飼料等)。結(jié)果顯示,1個(gè)非規(guī)范藥品樣品中檢出阿維菌素,其殘留量為718 mg·kg－1,1個(gè)水樣中檢出撲草凈,其殘留量為3.2 ng·L－1,其他樣品均未檢出。

本工作提出了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)養(yǎng)殖用非規(guī)范藥品及水中撲草凈、阿維菌素、伊維菌素殘留量的方法。本方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確且簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn),可滿足實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范的技術(shù)要求。