超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定化妝品中13種α-羥基酸的含量

高天陽,蔣亞奇,林鈺鎵,劉春霖,冉金鳳,李啟艷

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院,國(guó)家藥品監(jiān)督管理局化妝品原料質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,濟(jì)南 250101)

α-羥基酸是一類羥基位于α位的羧酸[1],包括葡糖醛酸、羥基乙酸、扁桃酸等,它們可使皮膚光滑、細(xì)嫩、柔軟,具有除皺、保濕、抗衰老等作用[2-3],因而被廣泛應(yīng)用于化妝品中。但過量使用α-羥基酸會(huì)對(duì)皮膚產(chǎn)生較強(qiáng)的刺激性[4],還會(huì)減弱皮膚對(duì)紫外線的抵抗力,甚至造成皮膚灼傷,因此α-羥基酸的安全性逐漸受到重視。

為有效控制α-羥基酸的使用量,《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)明確規(guī)定化妝品中α-羥基酸總量不得超過6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))[5]。隨后,國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局于2019年在第12號(hào)通告中發(fā)布了《化妝品中10 種α-羥基酸的高效液相色譜測(cè)定法》[6],并以此作為標(biāo)準(zhǔn)方法控制α-羥基酸的總量。除標(biāo)準(zhǔn)方法外,文獻(xiàn)報(bào)道中關(guān)于α-羥基酸的檢測(cè)方法有液相色譜法[7-8]、氣相色譜法[9]、離子色譜法[10]、毛細(xì)管電泳法[11]、液相色譜-質(zhì)譜法[12]等。然而,現(xiàn)有的液相色譜-質(zhì)譜法中僅測(cè)定了酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、乙醇酸5 種α-羥基酸的含量[13]。葡萄糖酸、乳糖酸和α-羥基癸酸作為新一代果酸,因具有刺激性小、保濕效果強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而被越來越多的添加到化妝品中,增加對(duì)這些α-羥基酸的測(cè)定有利于得到更準(zhǔn)確的α-羥基酸總量測(cè)定結(jié)果。目前,尚未見葡萄糖酸、乳糖酸和α-羥基癸酸的含量測(cè)定方法的相關(guān)報(bào)道。鑒于此,本工作提出了超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定化妝品中葡萄糖酸、乳糖酸、α-羥基癸酸等13種α-羥基酸含量的方法,以期為化妝品中α-羥基酸的質(zhì)量控制提供參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

島津Nexera X2 型超高效液相色譜儀和LCMS-8050 型三重四極桿質(zhì)譜儀聯(lián)用系統(tǒng);MS105DU 型電子天平;A10型超純水儀;Universal 320R 型高速冷凍離心機(jī);XK 96-B 型渦旋混勻器;KQ-500DE型超聲波清洗器。

單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:分別精密稱取葡糖醛酸、葡萄糖酸、乳糖酸、酒石酸、羥基乙酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、2-羥基丁酸(由DL-2-羥基丁酸鈉折算)、扁桃酸、羥基辛酸、二苯乙醇酸、α-羥基癸酸標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg,用水溶解,分別轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中,用水定容,配制成質(zhì)量濃度均為1 g·L－1的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別精密移取單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量,混勻,用水稀釋,配制成羥基辛酸、二苯乙醇酸、α-羥基癸酸的質(zhì)量濃度為0.1 mg·L－1,羥基乙酸、乳酸的質(zhì)量濃度為10 mg·L－1,其余8種α-羥基酸的質(zhì)量濃度為1 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,用水逐級(jí)稀釋,配制成羥基辛酸、二苯乙醇酸、α-羥基癸酸的質(zhì)量濃度分別為2,5,10,20,50,100μg·L－1,羥基乙酸、乳酸的質(zhì)量濃度分別為0.2,0.5,1,2,5,10 mg·L－1,其余8種α-羥基酸的質(zhì)量濃度分別為20,50,100,200,500,1 000μg·L－1為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

葡糖醛酸、葡萄糖酸、乳糖酸、酒石酸、羥基乙酸、蘋果酸、檸檬酸、DL-2-羥基丁酸鈉、扁桃酸、羥基辛酸、二苯乙醇酸、α-羥基癸酸標(biāo)準(zhǔn)品的純度均大于97%;乳酸標(biāo)準(zhǔn)品的純度大于90%;甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨均為色譜純;異丙醇為分析純;試驗(yàn)用水為自制超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Agilent Zorbax RRHD SB-Aq C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm);柱溫40 ℃;進(jìn)樣量5μL;流量0.3 mL·min－1;流動(dòng)相A 為0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:0～4.0 min時(shí),B 為0;4.0～10.0 min時(shí),B 由0升至95%,保持2.0 min;12.0～12.1 min,B由95%跳轉(zhuǎn)至0,保持2.9 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子(ESI)源,負(fù)離子掃描模式,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;霧化氣流量3.0 L·min－1,加熱氣流量10.0 L·min－1,干燥氣流量10.0 L·min－1;接口溫度300 ℃,加熱模塊溫度500 ℃,脫溶劑溫度250 ℃;碰撞氣為高純氬氣。13種α-羥基酸的其他質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中“*”表示定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗(yàn)方法

精密稱取樣品0.2 g,置于10 mL 具塞比色管中,加水至10 mL(若樣品不易在水中分散,先加1 mL異丙醇渦旋使分散均勻,再加水至10 mL),渦旋混合30 s,于60 ℃超聲提取30 min,放冷至室溫后,以轉(zhuǎn)速8 000 r·min－1離心5 min,上清液經(jīng)0.22μm 濾膜過濾,按照儀器工作條件測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)分別以乙腈、甲醇為有機(jī)相,在水相中分別添加0.1%甲酸溶液、0.01 mol·L－1乙酸銨溶液,考察了不同流動(dòng)相對(duì)13種α-羥基酸的分離效果和質(zhì)譜響應(yīng)的影響。結(jié)果顯示:以乙腈為有機(jī)相時(shí),13種α-羥基酸的分離效果較好;水相中添加乙酸銨可改善大部分化合物的峰形和質(zhì)譜響應(yīng),但乳糖酸、羥基乙酸和乳酸的質(zhì)譜響應(yīng)低,乳酸的峰形較差;水相中添加甲酸時(shí),13種α-羥基酸的分離效果和質(zhì)譜響應(yīng)均較佳。因此,試驗(yàn)最終選用乙腈-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相。

在優(yōu)化的儀器工作條件下,13種α-羥基酸的提取離子色譜圖見圖1。

圖1 13種α-羥基酸的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of the 13 α-hydroxy acids

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

試驗(yàn)采用ESI源分別在正、負(fù)離子掃描模式下對(duì)13種α-羥基酸進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描,確定母離子。對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,選擇至少2個(gè)特征碎片離子(除扁桃酸外,扁桃酸只有一個(gè)響應(yīng)較高的離子碎片),響應(yīng)最高的碎片離子作為定量離子,響應(yīng)次高的碎片離子作為定性離子。結(jié)果表明,正離子掃描模式下,大部分化合物的分子離子峰響應(yīng)較低,部分化合物無法找到二級(jí)特征碎片離子;負(fù)離子掃描模式下,13種化合物均可優(yōu)選出豐度較高的離子。因此,試驗(yàn)選擇負(fù)離子掃描模式。

選用質(zhì)量濃度為1.0 mg·L－1的單標(biāo)準(zhǔn)溶液,結(jié)合LCMS-8050 軟件的MRM 電壓自動(dòng)優(yōu)化功能,優(yōu)化目標(biāo)化合物的母離子、子離子、碰撞能量及采集時(shí)間等。同時(shí)分析的目標(biāo)化合物較多時(shí),質(zhì)譜采集點(diǎn)數(shù)和離子對(duì)駐留時(shí)間均影響其響應(yīng)和定量準(zhǔn)確度[14],試驗(yàn)依據(jù)各化合物的保留時(shí)間±1.5 min進(jìn)行分段,減少冗余采集通道的浪費(fèi),在兼顧質(zhì)譜采集點(diǎn)數(shù)的同時(shí),保證各化合物的駐留時(shí)間,提高其響應(yīng)靈敏度和定量準(zhǔn)確度。具體的質(zhì)譜條件見1.2.2節(jié)。

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

因?yàn)棣?羥基酸易溶于水、難溶于非極性有機(jī)溶劑,樣品以水為溶劑進(jìn)行超聲提取,而對(duì)于油包水型等在水中不易分散的樣品,先加異丙醇分散樣品,再加水超聲提取,此步驟與標(biāo)準(zhǔn)方法[6]一致,但在標(biāo)準(zhǔn)方法中,樣品先置于“90 ℃水浴中30 min以去除揮發(fā)性有機(jī)溶劑”,經(jīng)考察發(fā)現(xiàn),省去此步驟也不影響質(zhì)譜定量的準(zhǔn)確度和精密度,故簡(jiǎn)化此步驟,可縮短樣品前處理時(shí)間。具體的樣品前處理?xiàng)l件見1.3節(jié)。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(ME)是指色譜分離時(shí)共洗脫的物質(zhì)改變了待測(cè)成分的離子化效率,進(jìn)而引起信號(hào)的抑制或增強(qiáng)[15]。在液質(zhì)聯(lián)用分析時(shí),基質(zhì)效應(yīng)是普遍存在的問題,往往會(huì)降低方法的靈敏度和影響方法的準(zhǔn)確度[16-17]。

試驗(yàn)采用空白基質(zhì)溶液工作曲線斜率與空白溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的百分比來考察基質(zhì)效應(yīng)[18-19]。市售宣稱美白祛斑、保濕滋潤(rùn)功效的化妝品的基質(zhì)類型以水劑、乳液和膏霜居多,因此選取上述3種基質(zhì)的陰性化妝品,按試驗(yàn)方法處理,制得空白基質(zhì)溶液。再分別以空白溶劑和空白基質(zhì)溶液為稀釋溶劑,配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,進(jìn)樣分析,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和工作曲線,得到線性回歸方程,參照ME＝k1/k2(其中k1為空白基質(zhì)溶液工作曲線的斜率,k2為空白溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)計(jì)算基質(zhì)效應(yīng),結(jié)果見圖2。

圖2 13種α-羥基酸的基質(zhì)效應(yīng)Fig.2 Matrix effects of the 13α-hydroxy acids

由圖2 可知,3 種基質(zhì)化妝品的基質(zhì)效應(yīng)為85.0%～120%,說明這3種基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的測(cè)定干擾較小,因此試驗(yàn)方法中以空白溶劑稀釋制備混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

按照儀器工作條件測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以α-羥基酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。13種α-羥基酸的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測(cè)定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

取樣品0.2 g,加水10 mL進(jìn)行提取,離心過濾后測(cè)定,分別以3倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限(3S/N),以10倍信噪比計(jì)算測(cè)定下限(10S/N),結(jié)果見表2。

結(jié)果表明:13種α-羥基酸的質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)與對(duì)應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均不小于0.999 0;羥基辛酸、二苯乙醇酸、α-羥基癸酸的檢出限為0.030μg·g－1,羥基乙酸、乳酸的檢出限為3.0μg·g－1,其余8 種α-羥基酸的檢出限均為0.30μg·g－1,該方法中α-羥基酸的檢出限均低于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法(葡糖醛酸150μg·g－1、酒石酸60μg·g－1、羥基乙酸40μg·g－1、蘋果酸40μg·g－1、乳酸100μg·g－1、檸檬酸40μg·g－1、2-羥基丁酸80μg·g－1、扁桃酸2μg·g－1、羥基辛酸40μg·g－1、二苯乙醇酸1μg·g－1)[6]和文獻(xiàn)[20]報(bào)道(酒石酸20μg·g－1、蘋果酸60μg·g－1、乳酸90μg·g－1、檸檬酸40 μg·g－1、2-羥基丁酸400μg·g－1、扁桃酸2μg·g－1、羥基辛酸200μg·g－1、二苯乙醇酸1μg·g－1)的檢出限。

2.6 精密度和回收試驗(yàn)

分別以水劑、乳液、膏霜等3種基質(zhì)的陰性化妝品為研究對(duì)象,按各化合物的測(cè)定下限(低)、5倍測(cè)定下限(中)和10倍測(cè)定下限(高)等3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平測(cè)定6個(gè)平行樣品,按試驗(yàn)方法進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算每種基質(zhì)中各化合物的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表3。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

結(jié)果顯示,13種α-羥基酸的回收率為85.1%～114%,測(cè)定值的RSD 為0.80%～9.7%,表明方法準(zhǔn)確度和精密度能滿足檢測(cè)要求。

2.7 樣品分析

隨機(jī)選取20批市售化妝品,按照試驗(yàn)方法測(cè)定樣品中13種α-羥基酸的含量,結(jié)果見表4。

表4 樣品分析結(jié)果Tab.4 Analytical results of the samples

結(jié)果顯示:20批樣品均未檢出2-羥基丁酸、羥基辛酸、二苯乙醇酸和α-羥基癸酸;9批樣品中檢出乳酸,檢出率最高;檢出α-羥基酸的總量為20～6 800 mg/100 g,有1批樣品檢出α-羥基酸總量占比大于6%,超出《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015 年版)限值規(guī)定,該批樣品檢出了標(biāo)準(zhǔn)方法中未涉及的葡萄糖酸和乳糖酸,若按標(biāo)準(zhǔn)方法中列出的10 種α-羥基酸計(jì)算總量,該樣品符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,該結(jié)果驗(yàn)證了標(biāo)準(zhǔn)方法以10 種α-羥基酸計(jì)算總量并不完善。

本工作提出了超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定化妝品中13種α-羥基酸含量的方法。該方法克服了液相色譜法干擾多、靈敏度低的缺點(diǎn),完善了標(biāo)準(zhǔn)方法中α-羥基酸的測(cè)定種類,操作簡(jiǎn)便、快速,精密度和準(zhǔn)確度良好,可用于化妝品中13種α-羥基酸的含量測(cè)定。