雷公藤紅素通過下調(diào)FAT10抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖促進(jìn)凋亡的研究

王雪麗 張昱 郝榮榮 胡英男 王建偉 張威

結(jié)直腸癌（CRC）是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居全球新發(fā)癌癥的第三位，約為10.2%，死亡率位列全球第二，約為9.2%［1］。近年，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率還在逐年上升，且呈現(xiàn)年輕化趨勢，已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題［2］。研發(fā)新型治療藥物有望使我國CRC患者在臨床治療中有更大獲益，并且減輕醫(yī)療和社會的負(fù)擔(dān)。人白細(xì)胞抗原F位點相鄰轉(zhuǎn)錄本10（FAT10）是一種類泛素樣蛋白，其功能類似于泛素化蛋白，是蛋白酶體靶向的標(biāo)簽［3］。有研究表明FAT10在多種腫瘤中高表達(dá)，例如膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、胰腺癌和胃腸道癌，表明其可能參與癌癥發(fā)展的途徑［4-5］。然而，F(xiàn)AT10與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和進(jìn)展之間的聯(lián)系尚未確定。雷公藤紅素（Cel）是一種從雷公藤植物中分離的一種活性成分，具有廣泛的生物學(xué)特性，如抗腫瘤、免疫抑制和減肥活性［6-7］?！禖ell》雜志曾將Cel評價為最有可能開發(fā)為現(xiàn)代藥物的天然化合物之一［8］。然而，Cel對FAT10表達(dá)的影響并未報道，本文旨在研究Cel在結(jié)直腸癌中的作用，尤其是對FAT10的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 材料 人源結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480、HCT116，購買自武漢普諾賽生命科技有限公司；Cel，批號（HC020128），純度＞98%，購買自辰光生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素、胰蛋白酶，全購自美國HyClone公司；胎牛血清購自以色列Biolnd公司；FAT10一抗、GAPDH一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記兔二抗，購自中國杭州華安生物公司；細(xì)胞計數(shù)試劑-8（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒、RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF），購自碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞凋亡試劑盒，購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混試劑盒和SYBR Green qPCR試劑盒購自湖南艾科瑞生物公司；ECL發(fā)光液購自弗德生物科技有限公司。

1.2 方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：SW480和HCT116細(xì)胞在含10%胎牛血清、1%青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)介質(zhì)中，細(xì)胞傳代后放置在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。（2）Cel溶液配制：精確稱取Cel約45.0609 mg溶于精密移取的1 mL DMSO溶液中配置成100 mM的母液，分裝凍存于-20℃。（3）細(xì)胞毒性實驗：將狀態(tài)良好的處于對數(shù)生長期的SW480、HCT116細(xì)胞消化后鋪在96孔板中（5,000個/孔），細(xì)胞貼壁后用梯度稀釋法配制不同濃度的Cel（0、0.315、0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L）處理，Cel作用24 h后，吸除舊培養(yǎng)基，每孔添加90 μL新鮮DMEM和10 μL CCK8溶液，37℃避光孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度（A）值。細(xì)胞活力（%）=［A（加藥組）-A（空白組）］/［A（對照組）-A（空白組）］×100%。（4）細(xì)胞凋亡檢測：將細(xì)胞培養(yǎng)于12孔板，加入不同濃度的Cel和不含藥物組，待藥物作用24 h后，按照凋亡試劑盒說明書用Annexin V-FITC/PI染色，然后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡情況。（5）實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測FAT10的表達(dá)：采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，之后按照說明書步驟用逆轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液合成cDNA。以該cDNA為模板，使用SYBR Green進(jìn)行實時熒光定量PCR實驗，采用2-ΔΔCt法計算FAT10 mRNA的相對表達(dá)量。FAT10引物：正向序列為 5′-CTTGTGGAGTCAGGTGATG-3’，反向序列為5′-CCATTGCAAGTCACAATCTG-3’。GAPDH引物：正向序列為5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，反向序列為5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。（6）Western Blot實驗：采用RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白并BCA定量。10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離等量的蛋白樣品，然后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別用相應(yīng)的一抗4 ℃孵育過夜，F(xiàn)AT10單抗（18 kDa；1∶1,000）、GAPDH抗體（36 kDa；1∶10,000）。室溫下與HRP結(jié)合的二級抗體孵育1 h。TBST洗滌3次后，用ECL發(fā)光液檢測，并使用Bio-Rad圖像系統(tǒng)獲取蛋白質(zhì)條帶。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 每種實驗均重復(fù)≥3次，并采用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計繪圖分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FAT10在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá) 在mRNA水平上檢測了正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460和5個結(jié)直腸癌細(xì)胞系中FAT10的表達(dá)。FAT10 mRNA在這些細(xì)胞系中表達(dá)不同，在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞（P＜0.01，見圖1）。結(jié)果表明，F(xiàn)AT10基因在結(jié)直腸癌中高表達(dá)并且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 RT-qPCR分析腸上皮細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞中FAT10 mRNA的表達(dá)（注：*P＜0.05，**P＜0.01）

2.2 Cel對SW480和HCT116細(xì)胞增殖的影響 用不同濃度Cel（0、0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L）分別作用SW480、HCT116細(xì)胞24 h后，相對于對照組的0 μmol/L，隨著藥物濃度增加細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.05，見圖2）。根據(jù)Cel對SW480和HCT116細(xì)胞的毒性影響，當(dāng)藥物濃度＞10 μmol/L時，其抑制作用可以到達(dá)90%以上。計算IC50各自為3.03、1.63 μmol/L。后續(xù)實驗的藥物劑量根據(jù)IC50做參考，SW480選用0、1.25、5 μmol/L而HCT116選用0、1.25、2.5 μmol/L。

圖2 不同濃度的Cel對SW480和HCT116細(xì)胞增殖的影響（注：*P＜0.05，**P＜0.01）

2.3 Cel對SW480和HCT116細(xì)胞凋亡的影響 用貝克曼流式細(xì)胞儀，檢測1.25、5 μmol/L Cel處理SW480和1.25、2.5 μmol/L Cel處理HCT116細(xì)胞24 h后的凋亡情況，SW480細(xì)胞與對照組的晚期凋亡率5.35%相比，給藥組的晚期凋亡率分別為25.2%、75%（P＜0.01，見圖3A、B），HCT116細(xì)胞的凋亡占比也隨著Cel濃度的增高而增大（P＜0.01，見圖3A、C）。說明Cel能顯著誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。

圖3 不同濃度的Cel對SW480和HCT116細(xì)胞凋亡的影響（注：*P＜0.05，**P＜0.01）

2.4 Cel對FAT10表達(dá)的影響 有研究發(fā)現(xiàn)FAT10在幾種癌癥中呈高表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)可能是一種潛在的癌癥治療手段。因此，在本研究中作者檢測了Cel是否對FAT10表達(dá)產(chǎn)生影響。以SW480和HCT116細(xì)胞為研究對象，RT-qPCR結(jié)果表明，與Cel未處理的細(xì)胞相比，F(xiàn)AT10 mRNA在Cel處理的細(xì)胞中表達(dá)下降，而當(dāng)Cel濃度為1.25 μmol/L時，F(xiàn)AT10 mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05，見圖4A、B）。為了進(jìn)一步研究Cel是否會對FAT10產(chǎn)生作用，通過Western blot實驗，檢測其蛋白的表達(dá)情況。圖4C、D的Western blot條帶顯示隨著藥物濃度升高，F(xiàn)AT10條帶的灰度值隨之下降，說明Cel對FAT10蛋白有抑制作用。這與FAT10 mRNA表達(dá)的趨勢是一致的。以上研究結(jié)果提示Cel可能通過觸發(fā)FAT10的下調(diào)導(dǎo)致的結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡。

圖4 不同濃度的Cel對FAT10表達(dá)的影響（注：*P＜0.05，**P＜0.01）

3 討論

研究表明，泛素樣修飾劑FAT10直接參與調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)展途徑［9-10］。最近報道，F(xiàn)AT10在胰腺癌中的表達(dá)增加與TNM晚期和總生存期降低有關(guān)，并通過功能實驗表明，下調(diào)FAT10的表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腫瘤化療的耐藥性［11］。此外，F(xiàn)AT10是癌癥和炎癥研究和治療的重要靶標(biāo)，涉及FAT10對炎癥誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生的潛在作用。由于FAT10與炎癥信號通路之間的聯(lián)系，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的發(fā)展［12］。REN等［13］發(fā)現(xiàn)，TNF-α激活NF-κB通路，該通路導(dǎo)致細(xì)胞中的FAT10基因表達(dá)并導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。沉默F(xiàn)AT10顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力［14］。這些研究強(qiáng)烈表明FAT10可用作腫瘤疾病的預(yù)后標(biāo)志物，并且是潛在的治療靶點。值得注意的是，F(xiàn)AT10可以通過改變凋亡途徑在促生存途徑中發(fā)揮作用。DONG等［15］報道了FAT10直接結(jié)合并穩(wěn)定Survivin蛋白，從而通過抑制泛素介導(dǎo)的降解來促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，揭示了FAT10通過直接穩(wěn)定膀胱癌中的Survivin蛋白來促進(jìn)腫瘤增殖的新機(jī)制。同時，F(xiàn)AT10在染色體穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，F(xiàn)AT10表達(dá)的失調(diào)將導(dǎo)致G2/M細(xì)胞周期階段控制的失調(diào)，從而導(dǎo)致細(xì)胞分裂過程中染色體的異常分布，增強(qiáng)癌細(xì)胞的存活、增殖及轉(zhuǎn)移［16］。

目前，可以有效治療CRC的潛在藥物正在不斷探索中。有文獻(xiàn)記載的古代草藥的有用性使得藥用植物成為藥物發(fā)現(xiàn)的潛在來源。許多由植物分離物制備的重要化療藥物已被用于治療各種類型的癌癥。因此，草藥植物提取物可能是開發(fā)抗癌藥物的一個有前途的來源。此前已經(jīng)證明，Cel對多種癌癥產(chǎn)生有益作用，表明可能使用其來開發(fā)潛在的抗癌治療方法［17］。在各種腫瘤模型中，Cel已被證明通過抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡和抑制血管生成來調(diào)節(jié)腫瘤生長。CHEN等［18］研究發(fā)現(xiàn)Cel對過氧化還原酶-2（PRDX2）的抑制增加了細(xì)胞活性氧（ROS）水平，并導(dǎo)致ROS依賴性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，線粒體功能障礙和胃癌細(xì)胞凋亡。LIU等［19］報道了Cel通過神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的ROS/JNK和AKT/mTOR信號通路介導(dǎo)自噬和凋亡。ZHANG等［20］報道了Cel增強(qiáng)了轉(zhuǎn)錄因子EB（TFEB）介導(dǎo)的自噬和溶酶體生物發(fā)生，改善了微管相關(guān)蛋白tau病理學(xué)，表明Cel是治療阿爾茨海默病有前途的候選藥物。此外，Cel可以通過靶向過氧化還原酶-1（PRDX1）抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，PRDX1的抑制導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS升高以及細(xì)胞周期停滯和凋亡增加［21］。然而，關(guān)于Cel在CRC中的潛在抗癌作用及其作用機(jī)制仍存在許多尚不明確的問題。先前揭示的靶點和機(jī)制表明，Cel通過不同癌細(xì)胞中的不同靶點發(fā)揮抗腫瘤功效，但是Cel對FAT10表達(dá)的影響尚未見報道。因此，本研究旨在評估Cel對CRC的治療作用，重點是對FAT10的調(diào)控。

在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)Cel對結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，而且還能明顯促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡。值得注意的是，進(jìn)一步通過RT-qPCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，Cel能夠下調(diào)FAT10的表達(dá)。本研究證實了雷公藤素能夠抑制CRC的發(fā)展，這可能是通過抑制FAT10基因表達(dá)來逆轉(zhuǎn)的。雖然這項研究取得了有價值的結(jié)果，但仍存在不足和局限性。本研究結(jié)論主要是基于對CRC細(xì)胞分子水平的研究，需要更多體內(nèi)和體外實驗相結(jié)合來探究FAT10蛋白發(fā)揮的獨(dú)特功能和機(jī)制。

總之，本研究證明了FAT10在CRC細(xì)胞中的表達(dá)水平升高，Cel能夠抑制CRC細(xì)胞的增殖促進(jìn)凋亡，其作用的機(jī)制可能與下調(diào)FAT10表達(dá)有關(guān)，這是以前在文獻(xiàn)中未報道過的。深入探索FAT10與Cel作用之間的關(guān)系，了解Cel誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，將為開發(fā)Cel作為治療CRC的潛在候選藥物提供了新的見解?？傊?，本研究為FAT10抑制作用對Cel誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞活性抑制的發(fā)生提供了初步證據(jù)，并且表明Cel可能作為開發(fā)FAT10抑制劑的先導(dǎo)化合物。