基于分子印跡的表面等離子共振傳感器在食品安全檢測中的應(yīng)用

閆楓蕾，婁婷婷，王淞，吳子健，溫華蔚，宋文軍，馬興，章驊，肖亞兵，張宏宇

（1.天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院 天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134；2.天津海關(guān)動植物與食品檢測中心，天津 300461）

食品極易暴露在外界環(huán)境而被農(nóng)獸藥殘留、致病菌以及生物毒素等污染，被污染后的食品一旦被人體攝入極易引發(fā)嚴(yán)重的食品安全事故，而傳統(tǒng)食品安全檢測技術(shù)存在處理時間長、操作復(fù)雜以及設(shè)備價格昂貴等問題。因此，亟待開發(fā)高效、精確且可用于現(xiàn)場實時監(jiān)測的食品安全檢測技術(shù)[1]。目前，常用的食品安全檢測技術(shù)主要有色譜分析法[2]、免疫分析法[3]、熒光分析法[4]和傳感器技術(shù)[5]。傳感器技術(shù)是目前發(fā)展較為迅速的技術(shù)，其中表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）傳感器具有快速響應(yīng)、精確檢測等優(yōu)點[6]，不僅能檢測出被分析物的濃度、特異性以及動力學(xué)常數(shù)等信息，還能對分析物進(jìn)行現(xiàn)場監(jiān)測[7]。

分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）是基于分子印跡技術(shù)制備而成的高分子聚合物，可通過三維空間結(jié)構(gòu)和分子間作用力如氫鍵作用力、范德華力、靜電作用力和疏水作用力等對模板分子或模板分子類似物進(jìn)行專一性識別[8]，現(xiàn)已成功應(yīng)用于食品中活性成分的分離、農(nóng)獸藥殘留的檢測以及模擬酶催化危害物降解等多個方面[9-10]。分子印跡技術(shù)與表面等離子共振技術(shù)聯(lián)用可以集成兩種技術(shù)的優(yōu)點，兼具分子印跡的特異性識別和表面等離子共振傳感器高靈敏度的優(yōu)勢，因此在食品安全檢測等風(fēng)險評估的光學(xué)傳感領(lǐng)域具有巨大潛力和應(yīng)用前景。

本文旨在概述基于分子印跡的表面等離子共振傳感器特異性識別食品中有害化學(xué)因子的原理及應(yīng)用，總結(jié)基于分子印跡的表面等離子共振傳感器在檢測食品中農(nóng)獸藥、毒素以及其他有害物質(zhì)殘留的研究進(jìn)展，綜合分析該領(lǐng)域目前所面臨的挑戰(zhàn)，并對未來的發(fā)展方向提出思考和建議。

1 分子印跡技術(shù)與表面等離子共振傳感器技術(shù)

1.1 分子印跡技術(shù)的基本原理

MIP 是一種人工合成、具有分子識別能力的新型高分子材料，基本原理與抗原-抗體特異性結(jié)合理論相類似，可特異性識別目標(biāo)分子或模板分子。其制備過程（圖1）[11]：模板分子與功能單體在溶液中通過共價或非共價鍵作用相互結(jié)合形成絡(luò)合物，在高濃度交聯(lián)劑和引發(fā)劑條件下通過聚合反應(yīng)與該絡(luò)合物結(jié)合，通過溶劑萃取或化學(xué)斷裂的方法破壞聚合物-模板相互作用后，得到分子印跡聚合物。分子印跡聚合物結(jié)構(gòu)中存在著可與模板分子大小、形狀和官能團(tuán)特異性互補的位點。因此，MIP 對模板分子有特異性識別的能力，且具有高度選擇性。

圖1 分子印跡聚合物制備Fig.1 Preparation of molecularly imprinted polymer

1.2 表面等離子共振傳感器的基本原理

SPR 是一種靈敏的表面分析技術(shù)，一束P 偏振光入射到棱鏡端面會在棱鏡與金屬膜表面發(fā)生全反射，形成消逝波進(jìn)入到光疏介質(zhì)中，并引發(fā)金屬薄膜中的自由電子形成表面等離子體。表面等離子體集體振蕩會產(chǎn)生一種沿著界面?zhèn)鞑サ臋M向電磁波，即表面等離子波。當(dāng)兩波波矢量相等時，則會引起金屬膜內(nèi)自由電子產(chǎn)生共振，即發(fā)生表面等離子共振。表面等離子共振會導(dǎo)致檢測到的反射光強大幅度減弱，此時能量由光子轉(zhuǎn)移到表面等離子，入射光的大部分能量被表面等離子波吸收，使反射光的能量急劇減少，反射光完全消失的角就是SPR 角，SPR 角會隨金屬薄膜表面折射率的改變而改變，故其可檢測出附著在金屬薄膜表面物質(zhì)的量以及構(gòu)型的改變[7]（圖2）。

圖2 SPR 傳感器原理Fig.2 Schematic diagram of a SPR sensor

1.3 基于分子印跡的表面等離子共振傳感器的技術(shù)優(yōu)勢

基于分子印跡的表面等離子共振（molecularly imprinted polymer -surface plasmon resonance，MIP -SPR）傳感器是通過物理吸附、原位聚合、電聚合等方法在傳感器芯片表面沉積或合成一層均勻、厚度較薄的分子印跡聚合物，形成能與待測物質(zhì)發(fā)生特異性識別的生物或化學(xué)敏感層，當(dāng)通入溶液中存在與膜特異性結(jié)合的待測物時，便會引起SPR 角度變化并被SPR 檢測器記錄。MIP-SPR 傳感器結(jié)合了分子印跡高選擇性識別和表面等離子共振傳感器高靈敏性的優(yōu)點，能夠特異性檢測多種食品中常見的農(nóng)獸藥殘留和污染物，可實現(xiàn)高靈敏度、高特異性且快速的現(xiàn)場檢測與篩查[12]。MIP 技術(shù)修飾的SPR 芯片經(jīng)過特定方法洗滌可重復(fù)檢測，從而可實現(xiàn)食品安全檢測領(lǐng)域樣品檢測的快速、準(zhǔn)確、靈敏和低成本。

2 MIP-SPR 傳感器在食品安全檢測中的應(yīng)用

Lai 等[13]成功制備了檢測茶堿、黃嘌呤和咖啡的MIP-SPR 傳感器，發(fā)現(xiàn)茶堿MIP-SPR 傳感器對結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)無交叉反應(yīng)性，且可同時保證SPR 快速分析和與待分析物的特異性結(jié)合。這是首次使用MIP-SPR傳感器進(jìn)行檢測分析的報道，此后，MIP-SPR 傳感技術(shù)在食品中農(nóng)獸藥殘留、生物毒素等的檢測中獲得了迅速發(fā)展。

2.1 MIP-SPR 傳感器在農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用

由于農(nóng)藥的大量使用，農(nóng)藥殘留問題逐漸成為影響食品安全的重要因素[14]。目前，運用MIP-SPR 傳感器檢測農(nóng)藥殘留已取得了較好的效果，其種類主要包括生長素[15]、三嗪[16-18]、雜環(huán)類[19]有機除草劑、有機磷[20-24]以及氨基甲酸酯類殺蟲劑[23]等（表1）。

表1 MIP-SPR 傳感器在農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用Table 1 Application of MIP-SPR sensors in detection of agricultural chemical residues

Tan 等[22]通過熱引發(fā)在SPR 傳感器芯片表面聚合了具有特異性識別甲基對硫磷的分子印跡膜，該傳感器在10-13～10-10mol/L 范圍表現(xiàn)出良好的線性響應(yīng)且檢測限低至10-13mol/L，通過評估該印跡膜對敵草隆、殺蟲畏和殺螟硫磷的檢測效果，進(jìn)一步證實了印跡膜的高度靈敏性和選擇性。Saylan 等[16]基于紫外聚合反應(yīng)制備了靈敏檢測氰草津、西瑪津和阿特拉津的MIPSPR 傳感器，該傳感器對氰草津、西瑪津和阿特拉津的檢測限分別達(dá)到了0.095、0.031、0.091 nmol/L，運用該方法改變模板分子也可以檢測其他農(nóng)藥。

除了使用金膜和玻璃棱鏡折射作為MIP-SPR 傳感器元件外，Agrawal 等[18]開發(fā)了一種銀光纖代替昂貴金膜，將阿特拉津分子印跡涂覆在覆蓋了40 nm 厚銀膜的長光纖上進(jìn)行特異性檢測，其最低檢測限可至1.92×10-14mol/L。此外，Agrawal 等[18]在阿特拉津分子印跡與覆銀光纖之間引入10 nm 厚的鋁層，這對提高傳感器靈敏度有顯著幫助，為MIP-SPR 傳感體系的創(chuàng)新提供了新思路。Chen 等[24]使用銀膜代替金膜傳感器用于甲基對硫磷的檢測，由于銀對折射率的變化更敏感且等離子共振帶比金反射更獨特，因此該傳感器精確度良好且檢測限達(dá)到了13.8 mg/L。

納米粒子具有較高的比表面積，可為印跡模板提供更多的識別位點，因此常采用納米分子印跡聚合物（nanoMIP）增加分析物和識別位點的結(jié)合效率，如借助Fe3O4磁敏性制備nanoMIP 用于農(nóng)藥殘留的檢測，可達(dá)到借助磁場分離并放大信號的目的。Yao 等[20]將水溶液中的多巴胺自聚合于Fe3O4NPs 表面形成磁性nanoMIP，并利用SPR 傳感器對毒死蜱進(jìn)行特異性檢測，該體系在0.001～10 μmol/L 濃度范圍內(nèi)與SPR 信號線性關(guān)系良好，SPR 傳感器檢出限為0.76 nmol/L。Cakir 等[15]制備聚乙二醇二丙烯酸-N-甲基丙烯酰（L）-色氨酸甲酯納米膜，并用于2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）的選擇性檢測，經(jīng)液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的方法對比驗證，該體系可成功檢測蘋果樣品中的2，4-D。

2.2 MIP-SPR 傳感器在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用

食品中獸藥殘留的危害主要包括毒性危害、過敏反應(yīng)以及三致危害。目前，應(yīng)用MIP-SPR 傳感器檢測的獸藥殘留主要包括磺胺類[25-26]、青霉素類[27-30]、四環(huán)素類[31-32]、喹諾酮類[14，33-35]、大環(huán)內(nèi)酯類[36]、氨基糖苷類[37]、糖肽類[38]抗生素等（表2）。

表2 MIP-SPR 傳感器在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用Table 2 Application of MIP-SPR sensors in the detection of veterinary drug residues

磺胺類抗生素常被用作家畜的食品添加劑以增加產(chǎn)量，但其嚴(yán)重威脅人類生活中水和食物的安全，Kur?等[25]用滴鑄涂覆的方法制備了可特異性識別磺胺甲惡唑的甲基丙烯酸-甲基丙烯酸羥乙酯-二甲基丙烯酸乙二醇酯聚合膜，該MIP-SPR 傳感體系檢測限低至0.0034 g/L。MIP-SPR 傳感器在青霉素類抗生素如阿莫西林等檢測中的應(yīng)用較為廣泛，Ayankojo 等[27]合成了對阿莫西林（amoxicillin，AMO）具有選擇性的有機-無機雜化分子印跡膜，采用溶膠-凝膠法制備薄膜并用旋涂技術(shù)與SPR 傳感器連接，可特異性檢測緩沖液和自來水中的AMO 且最低檢測限為73 pmol/L。Bereli 等[28]合成了阿莫西林（甲基丙烯酸羥乙酯-甲基丙烯酸）聚合膜應(yīng)用于表面等離子共振傳感器，已用于雞蛋中AMO 的檢測且檢測限低至0.000 5 ng/mL。

nanoMIP-SPR 傳感體系也是檢測獸藥殘留常用的方法，Sullivan 等[34]利用固相分子印跡技術(shù)，合成了對環(huán)丙沙星具有選擇性的高親和力納米粒子，在牛奶和河水中的檢測限分別為66.8 nmol/L 和39.3 nmol/L。Luo 等[35]則是以原位光引發(fā)聚合法制備的納米分子印跡聚合物膜為識別元件，實現(xiàn)對環(huán)丙沙星的選擇性檢測，檢測限可至10-11mol/L。Safran 等[29]制備的MIP-SPR傳感體系可選擇性地檢測水溶液和牛奶中的青霉素G，其制備的半胱氨酸甲酯-金納米粒子-N-甲基丙烯酰-L-苯丙氨酸甲酯（AuNPs@MIP）分子印跡納米膜選擇性是非印跡納米膜的9.78 倍。?elik 等[30]制備了甲基丙烯酸羥乙酯-氧化石墨烯-N-甲基丙烯酰-L-苯丙氨酸nanoMIP-SPR 傳感器芯片，應(yīng)用于牛奶樣品中青霉素的檢測，檢測限低至0.021 ng/mL，并通過高效液相色譜驗證了該體系檢測準(zhǔn)確性。

此外，Tang 等[26]報道了基于MIP-SPR 傳感器的間接抑制免疫分析方法，并將其應(yīng)用于磺胺甲惡唑的檢測，采用原位聚合技術(shù)在柔性石英毛細(xì)管中合成了磺胺甲惡唑（sulfamethoxazole，SMX）分子印跡聚合物涂層，MIP 包被抗SMX 單克隆抗體與SMX 特異性結(jié)合，可實現(xiàn)SMX 的痕量檢測。Altintas[38]首次通過計算機設(shè)計nanoMIP-SPR 芯片用于檢測牛奶樣品中的萬古霉素，通過建模目標(biāo)分子和每種單體分子之間相互作用可視化，從而篩選出與萬古霉素最合適的功能單體，極大地減少了篩選時間，降低了試驗成本。

2.3 MIP-SPR 傳感器在生物毒素殘留檢測中的應(yīng)用

生物毒素又稱天然毒素，是動物、植物以及微生物產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，其種類繁多且復(fù)雜。目前，可通過SPR-MIP 檢測的生物毒素主要包括黃曲霉毒素[5]、赭曲霉毒素[39-40]、展青霉素[41]、嘔吐毒素[42]等真菌毒素以及細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素[43-44]等（表3）。

表3 MIP-SPR 傳感器在毒素殘留檢測中的應(yīng)用Table 3 Application of MIP-SPR sensors in the detection of toxin residues

Akg?nüllü 等[5]建立了靈敏檢測黃曲霉素B1（aflatoxin B1，AFB1）的SPR 傳感體系，將AFB1和N-甲基丙烯酰-L-苯丙氨酸分別作為模板分子和功能單體進(jìn)行預(yù)復(fù)合，然后將采用Turkevich 方法[45]合成的納米金分子印跡聚合物涂覆在SPR 金芯片表面，形成可特異性檢測AFB1的nanoMIP-SPR 傳感體系，該傳感體系檢測限低至1.04 pg/mL。

MIP-SPR 傳感器在制備印跡膜時可聯(lián)用電化學(xué)方法，利用聚吡咯（polypyrrole，PPy）等高分子材料進(jìn)行電化學(xué)聚合，在工作電極表面上形成PPy 薄膜。Yu 等[39]通過電化學(xué)聚合將分子印跡聚吡咯（molecularly imprinted polypyrrole，MIPPy） 膜與SPR 裝置集成用于檢測小麥和葡萄酒提取物中的赭曲霉素，并采用脈沖洗脫法對MIPPy 膜進(jìn)行再生。Choi 等[42]通過電聚合吡咯在裸金芯片上制備了可特異性檢測嘔吐毒素的MIPPy膜，其檢測限大于1 ng/mL，該體系為合成具有靶向選擇性的傳感元件提供了一種簡單、快速的思路。

除與電化學(xué)聚合聯(lián)用外，通過計算機模擬設(shè)計同樣可以設(shè)計出檢測靈敏、結(jié)合牢固的MIP 膜，且減少昂貴的分析物和模板使用。Altintas 等[43]利用計算模擬大腸桿菌內(nèi)毒素和單體間相互作用，優(yōu)選出衣康酸、甲基丙烯酸和丙烯酰胺作為功能單體，成功合成出表面帶有可結(jié)合官能團(tuán)的納米芯片，且該體系檢測限低至0.44 ng/mL。

2.4 MIP-SPR 傳感器在其他有害物檢測方面的應(yīng)用

除農(nóng)獸藥殘留和生物毒素外，MIP-SPR 傳感器還被應(yīng)用到檢測食品中其他有害物質(zhì)，如重金屬離子[12]、非法添加物[46-48]、致病菌[49-51]和有毒物質(zhì)[52-60]等（表4）。

表4 MIP-SPR 傳感器在其他有害物質(zhì)殘留檢測中的應(yīng)用Table 4 Application of MIP-SPR sensors in the detection of other harmful substance residues

Bakhshpour 等[12]對基于3 種不同傳感芯片聚甲基丙烯酸羥乙酯薄膜、聚合物納米粒子膜和金納米粒子膜測鎘離子（Cd2＋）的MIP-SPR 傳感體系進(jìn)行了比對分析，發(fā)現(xiàn)Poly-NPs 和AuNPs 傳感體系檢測限低至0.01 μg/L，顯著增強了SPR 傳感器信號強度，為使用納米顆粒檢測金屬離子提供了一種新策略。

目前采用MIP-SPR 傳感體系可檢測的非法添加物包括孔雀石綠[48]、三聚氰胺[48]和蘇丹紅[46]等。Tang[47]等報道了基于MIP-SPR 傳感體系的間接抑制免疫分析方法，以去氧腎上腺素為虛擬模板，以1-烯丙基-3-乙基咪唑溴化物為助功能單體合成的MIP 可特異性識別痕量克倫特羅并用于其檢測。Xu[46]等通過表面引發(fā)的原位聚合的方法在裸金SPR 芯片上制備了厚度為（75±5）nm 的nanoMIP 用于特異性檢測蘇丹染料，檢測限低至30 ng/mL，具有快速吸附和解吸附的特點。

食品或者水源中可能存在由直接或間接方式引入的食源致病菌，一旦攝入人體便存在食物中毒等隱患，而制備納米分子印跡SPR 傳感器芯片可準(zhǔn)確在線檢測致病菌，目前利用該方法可檢測的食源致病菌包括糞腸球菌[49]、大腸桿菌[50]和假單胞菌等[51]。Erdem 等[49]報道了一種MIP-SPR 特異性檢測糞腸球菌的方法，采用微乳液法制備糞腸球菌納米顆粒并應(yīng)用SPR 進(jìn)行檢測，其檢測范圍為2×104～2×108CFU/mL，該傳感體系對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌檢測具有高度選擇性。

食品中存在的其他有害物質(zhì)如食品加工的副產(chǎn)物，食品加工過程產(chǎn)生的污染物，農(nóng)畜產(chǎn)品機體產(chǎn)生的有毒有害物質(zhì)等亦可通過MIP-SPR 傳感器進(jìn)行檢測。例如，可采用模板分子-功能單體-引發(fā)劑體系檢測苯并芘[53]、雙酚A[58]以及組胺[55]等。采用納米MIPSPR 傳感器用于有害物質(zhì)的檢測，Shaikh 等[59]制備了聚乙二醇二甲基丙烯酸酯-N-甲基丙烯酰-L-苯丙氨酸-乙烯基咪唑分子印跡聚合膜檢測雙酚A。Rahtuvanolu 等[56]利用微乳液法制備了納米印跡膜檢測組胺。Cennamo 等[60]和Zeni 等[57]報道的基于D 形塑料光纖（plastic optical fiber，POF）面等離子共振傳感體系，即MIP 受體被沉積在一個POF 上，上面覆蓋著光刻膠緩沖層和一層金薄膜，該體系可分別特異性檢測全氟辛酸鹽和糠醛。

3 討論

經(jīng)過幾十年的發(fā)展與應(yīng)用，MIP-SPR 傳感體系作為一種新型化學(xué)傳感器取得了前所未有的進(jìn)展，給食品安全檢測技術(shù)研究領(lǐng)域帶來了新的機遇，其檢測方法得到了進(jìn)一步的發(fā)展。從模板分子-功能單體體系到與納米技術(shù)和電化學(xué)技術(shù)聯(lián)用，MIP-SPR 傳感體系具有檢測靈敏度高、選擇性強、檢測迅速以及操作簡單等諸多優(yōu)點，但在實際應(yīng)用過程中仍面臨重大挑戰(zhàn)，存在一定的局限性，包括檢測目標(biāo)物容易受干擾、應(yīng)用范圍不廣、成本較高和分析物單一等問題，且MIP-SPR 傳感器在食品安全檢測中應(yīng)用的商業(yè)化體系開發(fā)較少，大多數(shù)應(yīng)用仍停留在實驗室研究階段，縮小實驗室研究和實際應(yīng)用之間的差距是未來研究的焦點。因此在今后的研究中，可著力于以下5 個方面：（1）設(shè)計新型的防污材料，用于消除表面等離子共振芯片表面的污染，以提高識別元件的固定和特異性結(jié)合，進(jìn)而提高M(jìn)IP-SPR 傳感器可利用次數(shù)和精確度；（2）開發(fā)經(jīng)濟(jì)和小型化便攜設(shè)備，用于從實驗臺到現(xiàn)場檢測；（3） 加強MIP-SPR 傳感器與其他傳感器或分析方法的聯(lián)合應(yīng)用，以獲得大量樣品的高度可靠的結(jié)果；（4）創(chuàng)新芯片材料，引入可重復(fù)使用的傳感器芯片，以降低檢測成本；（5）發(fā)展多通道方法，滿足多種分析物同時檢測的要求。相信隨著納米技術(shù)、膜技術(shù)、電化學(xué)技術(shù)和光纖技術(shù)等高新技術(shù)的集成與應(yīng)用，必將進(jìn)一步提高M(jìn)IP-SPR 傳感器的分析效率和適用性，從而使SPR 技術(shù)在食品安全領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。