脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體在皮膚傷口愈合過(guò)程中的作用

胡曉強(qiáng),張麗君,王 乙,連福治,張 燕

(杭州師范大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,浙江 杭州 311121)

皮膚是覆蓋于人體表面最大的器官,由表皮和真皮組成,在抵抗微生物入侵、紫外線輻射以及防止水分丟失、調(diào)節(jié)體溫等方面發(fā)揮著重要作用。皮膚具有一定的自我修復(fù)能力,一般損傷后能夠自動(dòng)愈合。然而糖尿病等慢性疾病患者的皮膚傷口往往較難愈合,不僅影響皮膚正常功能的發(fā)揮,而且還會(huì)影響美觀,給患者生理和心理上造成雙重影響[1]。皮膚傷口愈合過(guò)程可以分為3個(gè)既連續(xù)又重疊的階段——止血/炎癥期、增生期和重塑期[2],脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體(adipose-derived stem cells-derived exosomes, ADSCs-Exo)在傷口愈合的不同階段發(fā)揮著不同的作用。ADSCs-Exo不僅具有調(diào)節(jié)炎癥的作用,還可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移、分化等功能促進(jìn)傷口的愈合。本文主要對(duì)ADSCs-Exo在皮膚傷口愈合過(guò)程中的作用進(jìn)行綜述。

1 ADSCs-Exo的來(lái)源及優(yōu)點(diǎn)

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose derived stem cells, ADSCs)是一類脂肪基質(zhì)內(nèi)的干細(xì)胞群,是一種能夠自我更新并具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs),能夠在體外分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等。ADSCs主要來(lái)源于脂肪細(xì)胞,可以利用抽脂術(shù)或從切除的脂肪中獲得。與其他類型的MSCs相比,ADSCs的優(yōu)勢(shì)在于易獲取、數(shù)量多(1 g脂肪組織提供的干細(xì)胞比1 g骨骼所提供的干細(xì)胞多500倍),并且具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)功能。ADSCs不僅可以通過(guò)上調(diào)表皮生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的分泌水平來(lái)促進(jìn)皮膚的再生,還可用于修復(fù)缺損的骨組織、軟骨和軟組織等[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),ADSCs修復(fù)組織的過(guò)程實(shí)際上是依靠旁分泌作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的,外泌體正是其旁分泌的主要產(chǎn)物。外泌體是一種通過(guò)內(nèi)體途徑分泌到細(xì)胞間隙的細(xì)胞外囊泡,直徑為30～100 nm,密度為1.13～1.19 g/mL,由Johnstone等首次在綿羊血清中分離發(fā)現(xiàn),含有蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA、DNA等多種物質(zhì),目前發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞、B細(xì)胞、血小板、間充質(zhì)干細(xì)胞等均能夠分泌外泌體,血液、尿液、乳汁等體液中也均富含外泌體[4-5]。

2 ADSCs-Exo在傷口愈合中的作用

2.1 止血/炎癥期 在皮膚受損后,暴露的組織因子和膠原等會(huì)激活血小板聚集[6],釋放趨化因子和生長(zhǎng)因子,在傷口形成凝塊以止血;另一方面,大量的細(xì)胞也被募集到傷口周圍。首先出現(xiàn)在損傷部位的是中性粒細(xì)胞,它浸潤(rùn)傷口并通過(guò)釋放蛋白水解酶和氧自由基來(lái)清除細(xì)胞碎片和細(xì)菌以防止傷口感染[7],而后會(huì)以凋亡的方式被清除;之后,血液來(lái)源的單核細(xì)胞遷移至傷口部位并轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞,起到吞噬細(xì)菌、細(xì)胞殘?bào)w和壞死組織的作用[8],同時(shí),吞噬細(xì)胞還會(huì)釋放大量的酶和細(xì)胞因子,刺激成纖維細(xì)胞和角化細(xì)胞從而促進(jìn)血管生成。

在該階段,皮膚主要通過(guò)建立一種免疫屏障來(lái)防止外界微生物的入侵,而炎癥因子的水平是其中重要的因素之一。已有研究證明,ADSCs-Exo能夠顯著降低特應(yīng)性皮炎小鼠中各種炎性細(xì)胞因子的表達(dá),例如白介素(interleukin, IL)-4、IL-23、IL-31等[9]。此外,ADSCs-Exo還可以通過(guò)誘導(dǎo)神經(jīng)酰胺的合成,顯著降低IL-5、腫瘤壞死因子α等炎癥細(xì)胞因子的水平,進(jìn)而促進(jìn)特異性皮炎的表皮屏障修復(fù)[10]。Cao等[11]在小鼠皮膚損傷模型中發(fā)現(xiàn),ADSCs-Exo中的miR-19b可以通過(guò)調(diào)控趨化因子CC基序配體(chemokine CC motif ligands, CCL)/TGF-β軸信號(hào)通路,促進(jìn)TGF-β1的表達(dá)以促進(jìn)傷口的愈合。鞘氨醇1-磷酸(sphingosine 1-phosphate, S1P)介導(dǎo)的信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖和遷移、炎性因子的浸潤(rùn)、血管生成等許多生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),ADSCs-Exo可以通過(guò)激活S1P/鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1, SK1)/鞘氨醇1-磷酸受體1(sphingosine 1-phosphate receptor 1, S1PR1)信號(hào)通路,促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化(M2是典型的抗炎類型[12]),從而發(fā)揮抗炎作用[13]。Zhao等[14]發(fā)現(xiàn)ADSCs-Exo處理可以增加巨噬細(xì)胞M2和IL-10的mRNA的表達(dá),并通過(guò)其攜帶的活性信號(hào)傳感器和轉(zhuǎn)錄激活劑3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)激活精氨酸酶-1,從而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2極化,抑制相關(guān)的炎癥反應(yīng)。

由此可見(jiàn),ADSCs-Exo可以通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子的水平來(lái)達(dá)到抗炎、改善創(chuàng)面環(huán)境的效果,從而促進(jìn)皮膚傷口的愈合。

2.2 增生期 該期可以分為3個(gè)階段。第一階段,傷口邊緣的成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞向愈合區(qū)遷移,成纖維細(xì)胞在傷口處增殖并產(chǎn)生基質(zhì)蛋白纖維連接蛋白、蛋白多糖和Ⅰ型及Ⅲ型前膠原[6,15],而膠原蛋白是傷口內(nèi)細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)形成的基礎(chǔ)。Hu等[16]發(fā)現(xiàn),成纖維細(xì)胞可以將ADSCs-Exo吸收并內(nèi)化,進(jìn)而刺激細(xì)胞的遷移、增殖和合成,從而加快傷口的愈合。Zhang等[17]的實(shí)驗(yàn)表明,ADSCs-Exo可以使膠原蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1, MMP-1)的表達(dá)增加,并活化磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶(protein kinase B, Akt)信號(hào)通路,而PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)ADSCs-Exo促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移具有重要作用;Choi等[18]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ADSCs-Exo含有的miRNA可抑制NPM1、PDCD4、CCL5和NUP62等基因的表達(dá),從而刺激真皮成纖維細(xì)胞的增殖和遷移。此外,有學(xué)者通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)和細(xì)胞劃痕試驗(yàn)證實(shí),ADSCs-Exo也能顯著促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的體外增殖和遷移[19]。

第二階段,內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)多種血管因子產(chǎn)生應(yīng)答,其中包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)和成纖維生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor, FGF),其中FGF和VEGF起主要調(diào)控作用[20]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),ADSCs-Exo攜帶的miRNA(miR-126、miR-130a、miR-132、miR378a-3P)[21-22],不僅可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移,還能通過(guò)增加血管內(nèi)皮細(xì)胞中的VEGF、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)以及FGF等多種生長(zhǎng)因子的水平而促進(jìn)血管生成[23-24]。此外,Bai等[25]在小鼠皮瓣暴露導(dǎo)致的缺血/再灌注損傷模型中發(fā)現(xiàn),ADSCs-Exo可以顯著增加皮瓣的存活率和毛細(xì)血管密度,減少皮瓣的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡,促進(jìn)新生血管的形成。

第三階段,巨噬細(xì)胞、增殖的成纖維細(xì)胞和血管化的間質(zhì)與膠原基質(zhì)、纖維蛋白原、纖維連接蛋白的透明質(zhì)酸一起構(gòu)成臨時(shí)基質(zhì)[15],并隨著膠原蛋白的積累,傷口處的肉芽組織逐漸成熟,鄰近的角化細(xì)胞作為上皮細(xì)胞遷移到傷口邊緣并完成上皮化。從宏觀角度來(lái)講,這一過(guò)程可以看作是大量肉芽組織的形成。有學(xué)者研究了ADSCs-Exo對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移的影響,發(fā)現(xiàn)ADSCs-Exo很容易被內(nèi)皮化,從而促進(jìn)這些細(xì)胞在體內(nèi)的增殖、遷移和血管生成,更重要的是,ADSCs-Exo刺激了這些細(xì)胞中的Akt和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, EPK)信號(hào)通路,在傷口局部注射ADSCs-Exo后,可顯著提高傷口再上皮化、膠原沉積和新生血管形成的能力,從而加速傷口的愈合[26]。

在傷口增生階段中,ADSCs-Exo能夠通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和分化以及血管再生,幫助傷口完成上皮化,進(jìn)而促進(jìn)皮膚傷口的愈合。

2.3 重塑期 在增生期的基礎(chǔ)上,角化細(xì)胞從傷口邊緣轉(zhuǎn)移到臨時(shí)基質(zhì)中并釋放細(xì)胞因子傳遞皮膚損傷的信息[27]。隨后,整合素和細(xì)胞骨架成分重新排列,肉芽組織停止生長(zhǎng),膠原蛋白的合成和分解以及細(xì)胞外基質(zhì)的重塑不斷發(fā)生,成纖維細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用,使傷口邊緣更加緊密[28]。傷口愈合后,成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在細(xì)胞凋亡的作用下進(jìn)一步減少[29],隨著時(shí)間推移,毛細(xì)血管不再生長(zhǎng),傷口部位的代謝活動(dòng)減弱,最終形成完全成熟的瘢痕[30]。

2017年,Wang等[31]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ADSCs-Exo可以通過(guò)激活MAPK絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)/ERK通路,調(diào)節(jié)Ⅲ型膠原∶Ⅰ型膠原、TGF-27a3∶TGF-27a1、基質(zhì)金屬蛋白酶3∶基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1(matrix metalloproteinases-1, TIP1)的比值,抑制成纖維細(xì)胞的分化,從而抑制肉芽組織的形成,最終實(shí)現(xiàn)皮膚傷口無(wú)疤痕修復(fù)。2019年,Ma等[32]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在H2O2誘導(dǎo)的損傷模型中,角質(zhì)形成細(xì)胞HaCat經(jīng)過(guò)H2O2處理后加入ADSCs-Exo,凋亡細(xì)胞明顯減少,說(shuō)明ADSCs-Exo能夠顯著抑制細(xì)胞凋亡;Wnt蛋白/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路對(duì)調(diào)節(jié)皮膚傷口大小有著重要作用[33],進(jìn)一步通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ADSCs-Exo能夠提高β-catenin的表達(dá),促進(jìn)Wnt的分泌和運(yùn)輸[34],從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。He等[35]也發(fā)現(xiàn),ADSCs-Exos可顯著降低H2O2對(duì)HaCat及人真皮成纖維細(xì)胞(human dermal fibroblasts, HDF)的增殖、遷移和凋亡的抑制作用。

在重塑期階段, ADSCs-Exo一方面可以通過(guò)調(diào)節(jié)膠原蛋白的比值抑制肉芽組織的形成,另一方面也可抑制細(xì)胞的凋亡,從而有助于傷口處組織的重建,實(shí)現(xiàn)傷口的無(wú)瘢痕愈合。

3 結(jié)語(yǔ)

總之,ADSCs-Exo在傷口愈合過(guò)程的不同階段均發(fā)揮著積極的作用。在止血/炎癥期,ADSCs-Exo能夠調(diào)節(jié)傷口各類炎癥因子的水平;在增生期,ADSCs-Exo可以促進(jìn)血管的生成,促進(jìn)傷口中各類細(xì)胞的增殖、遷移、分化;在傷口愈合的最后階段——重塑期,ADSCs-Exo還通過(guò)抑制肉芽組織的形成和細(xì)胞的凋亡,幫助傷口處組織的重建,最終完成傷口的愈合。因此,ADSCs-Exo有望成為促進(jìn)難愈合傷口愈合的新型藥物。