N端非催化結構域對微泡菌ALW1褐藻膠裂解酶AlgL7酶學性質的影響

黃小藝，李鶴賓，陳艷紅,3,4，姜澤東,3,4，倪 輝,3,4，李清彪,3,4，朱艷冰,3,4,

（1.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.廈門醫(yī)學院藥學系，福建 廈門 361023；3.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021；4.廈門市食品生物工程技術研究中心，福建 廈門 361021）

褐藻是一種廣泛分布在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的大型藻類。褐藻膠是褐藻細胞壁中一種主要的線性多糖，占褐藻干質量的40%[1]。褐藻膠由D-甘露糖醛酸（β-Dmannuronic acid，M）和L-古羅糖醛酸（α-L-guluronic acid，G）通過1,4-糖苷鍵連接形成[2]。研究發(fā)現(xiàn)，褐藻膠降解成褐藻膠寡糖后，生物利用性和生物活性顯著提高，包括抗凋亡、抗腫瘤、免疫調節(jié)、抗炎、抗菌和抗氧化等[3]。利用酶法制備褐藻膠寡糖具有反應特異性高、反應條件溫和、降低環(huán)境污染等優(yōu)點，在褐藻膠寡糖的制備中更具有優(yōu)勢[4]。

褐藻膠裂解酶通過β-消除機制作用于褐藻膠的1,4-糖苷鍵，最終在產(chǎn)物末端六元環(huán)C4和C5位生成不飽和雙鍵，產(chǎn)生非還原端不飽和的褐藻膠寡糖[5-6]。褐藻膠裂解酶來源廣泛，包括細菌、真菌、病毒和軟體動物[5]。根據(jù)一級結構差異，褐藻膠裂解酶可分為15 個多糖裂解酶家族；根據(jù)裂解方式不同，可分為內(nèi)切型和外切型褐藻膠裂解酶；根據(jù)底物特異性，可分為D-聚甘露糖醛酸鈉（polyM）偏好型、L-聚古羅糖醛酸鈉（polyG）偏好型和雙功能型褐藻膠裂解酶[7]。褐藻膠裂解酶的酶學性質與其來源生物體和生存環(huán)境有一定關系[1]，非催化結構域可能影響褐藻膠裂解酶的催化性質[2,8]。與其他多糖裂解酶一樣，褐藻膠裂解酶是一種包含催化和非催化多結構域的裂解酶。褐藻膠裂解酶常見的非催化結構域包括碳水化合物結合模塊（carbohydrate-binding module，CBM）[9-10]和F5/8 C型結構域。通常來說，催化結構域在識別、結合、降解底物方面扮演重要角色[11]，而非催化模塊影響酶的生化特性[12]。

大多數(shù)褐藻酸裂解酶的活性和穩(wěn)定性較低[13]，限制了該酶的廣泛應用。褐藻膠裂解酶非催化結構域的截短或重組可能改良酶催化性質[7,14-16]。研究組前期從腐爛的海帶中分離得到海洋微泡菌ALW1（Microbulbifersp.ALW1）[17]，基因組分析發(fā)現(xiàn)含有1 個預測為PL7家族的褐藻膠裂解酶AlgL7的編碼基因，該酶包含2 個非催化模塊CBM和F5/8 C型結構域。為了解該酶非催化結構域的功能，通過基因截短、蛋白質表達和純化，研究非催化模塊對褐藻膠裂解酶AlgL7酶學性質的影響，旨在解析該酶非催化結構域與酶性質的構效關系，為酶的實踐應用提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

微泡菌ALW1、大腸桿菌BL21（DE3）為本實驗室保存。

海藻酸鈉、polyM、polyG 國藥集團化學試劑有限公司；EcoRI、BamHI、XhoI、T4DNA連接酶日本TaKaRa公司；細菌基因組提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）、卡那霉素生工生物工程（上海）股份有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑、2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉（bicinchoninic acid kit，BCA）試劑盒廈門市淘爍生物科技有限公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow美國GE Healthcare Life Sciences公司；其他化學試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.2 儀器與設備

Sorvall LYNX 4000高速冷凍離心機 美國賽默飛世爾科技有限公司；恒溫振蕩搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；水浴鍋 冠森生物科技有限公司；Epoch2T微量酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）基因擴增儀伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司；鼓風干燥箱 深圳市愛特爾電子科技有限公司；核酸電泳儀 美國GE Healthcare Life Sciences公司。

1.3 方法

1.3.1 褐藻膠裂解酶AlgL7的生物信息學分析

利用ExPAsy網(wǎng)站中ProtParam工具對褐藻膠裂解酶AlgL7的氨基酸組成、理論分子質量和等電點等理化性質進行預測。使用Clustal X2進行多序列比對，MEGA 11.0軟件構建褐藻膠裂解酶AlgL7的系統(tǒng)發(fā)育樹。利用NCBI的保守結構域模塊進行蛋白質的結構域分析。

1.3.2 褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體基因工程菌株構建

參照細菌基因組提取試劑盒方法提取菌株ALW1的基因組DNA，以該基因組為模板，基于AlgL7保守結構域的預測結果，利用PCR分別擴增褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體（包括CD1和CD2）基因，引物序列如表1所示。獲得PCR產(chǎn)物后，CD1基因利用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI進行酶切，AlgL7和CD2基因利用EcoRI和XhoI進行酶切，然后利用T4DNA連接酶分別將目的基因連接到pET-28a載體后，轉化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞。利用含卡那霉素的平板篩選和菌落PCR鑒定后，重組質粒送至廈門鉑瑞生物科技有限公司測序。

表1 用于擴增AlgL7及其截短體的引物Table 1 Primers used for the amplification of AlgL7 and its truncations

1.3.3 褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體的表達與純化

將測序成功的褐藻膠裂解酶AlgL 7 及其截短體基因工程菌株按1%接種量接種至LB液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素），37 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)，當OD600nm值達到0.6～0.8后加入IPTG（終濃度0.1 mmol/L），16 ℃誘導表達18～24 h。將發(fā)酵液4 ℃、5000×g離心10 min，棄上清液，加入緩沖液（50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、30 mmol/L咪唑，pH 8.0）懸浮菌體，在冰浴條件下進行超聲破碎，條件為超聲5 s、間隙5 s，總時間15 min，功率300 W。將處理液4 ℃、12000×g離心20 min，得到粗酶液。參照Ni Sepharose 6 Fast Flow使用說明書，利用親和層析對重組酶進行分離純化。利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析目的蛋白的純度和分子質量，利用BCA試劑盒進行蛋白質定量。

1.3.4 褐藻膠裂解酶活力的測定

采用DNS法[18]。反應體系為5 μL酶液（0.11 mg/mL）加入200 μL 5 mg/mL海藻酸鈉底物溶液（溶于50 mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，pH 7.0），在最適溫度下溫浴15 min后，加入200 μL DNS試劑，沸水浴10 min，冷卻至室溫后，利用酶標儀在波長540 nm測定吸光度。褐藻膠裂解酶的活力定義為：在一定條件下，每分鐘生成1 μmoL還原糖所需的酶量為1 個酶活力單位（U）。

1.3.5 褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體的底物特異性

分別配制質量濃度為5 mg/mL海藻酸鈉、polyM、polyG溶液測定重組酶的活力，研究褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體的底物特異性。不同的底物與酶在最適溫度下孵育15 min后，利用DNS法測定酶活力。

1.3.6 溫度對褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體活性和穩(wěn)定性的影響

在不同溫度（20～60 ℃）下分別測定褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體的活力，研究酶的最適反應溫度。分別將褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體在不同溫度（20～40 ℃）下放置15 min后，立即置于冰浴5 min，測定酶的殘余活力，研究酶的溫度穩(wěn)定性，以未經(jīng)熱處理的酶活力為100%。

1.3.7 pH值對褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體活性和穩(wěn)定性的影響

在不同pH值條件下分別測定褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體的活力，研究酶的最適反應pH值。分別將褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體在不同pH值條件下25 ℃處理30 min后，測定酶的殘余活力，研究酶的pH值穩(wěn)定性，以未經(jīng)處理的酶活力為100%。所用緩沖液為50 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液（pH 3.0～6.0）、NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH 6.0～8.0）、Tris-HCl緩沖液（pH 8.0～9.0）和甘氨酸-NaOH緩沖液（pH 9.0～11.0）。

1.3.8 褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體的動力學參數(shù)測定

在不同海藻酸鈉底物質量濃度（0.5～5 mg/mL）下測定褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體的活力，利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，計算酶的米氏親和常數(shù)（Km）和最大反應速率（Vmax）。

1.3.9 褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體的酶解產(chǎn)物鑒定

50 mL 5 mg/mL海藻酸鈉、polyG和polyM不同底物溶液中分別加入3 U褐藻膠裂解酶，于30 ℃條件下反應，每小時取樣一次，利用DNS法測定還原糖的釋放量；孵育8 h后，向反應混合液中添加3 U褐藻膠裂解酶，繼續(xù)反應9 h，還原糖的釋放量不再發(fā)生變化時，將反應物沸水浴滅活10 min，4 ℃、11100×g離心20 min，收集上清液。加入3 倍體積無水乙醇，4 ℃靜置2 h后，4 ℃、18000×g離心20 min，取上清液，凍干得到褐藻膠寡糖產(chǎn)物。參照Li Zhipeng等[19]報道的液相色譜-質譜方法鑒定酶解產(chǎn)物。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 褐藻膠裂解酶AlgL7的序列分析

微泡菌ALW1的褐藻膠裂解酶AlgL7基因（GenBank收錄號OM831233）有1893 個堿基對，預測編碼630 個氨基酸殘基的蛋白質，理論等電點（pI）為4.40，理論分子質量為71.5 kDa。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，AlgL7與來自PL7家族的褐藻膠裂解酶處于同一分支（圖1a），表明該褐藻膠裂解酶屬于PL7家族。保守結構域分析顯示，AlgL7含有CBM結構域（Ile55～Tyr158）、F5/8 C型結構域（Ala202～Val322）和C端催化結構域（Phe364～His630）（圖1b）。C端催化結構域命名為CD1，包含F(xiàn)5/8 C型結構域和C端催化結構域的截短酶命名為CD2（圖1b）。此外，序列比對確定了微泡菌ALW1來源的AlgL7中含有QIH（Gln497～His499）、RTELREMLR（Arg428～Arg436）和YFKAG（Tyr600～Gly604）3 個保守區(qū)域，推測它們與促進底物識別和酶功能有關[20]。

圖1 褐藻膠裂解酶AlgL7的系統(tǒng)發(fā)育（a）和結構域（b）分析Fig.1 Phylogenetic analysis (a) and domain analysis (b) of alginate lyase AlgL7

2.2 褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體的表達與純化

成功構建了AlgL7、截短體CD1和CD2的基因工程菌株，利用IPTG進行誘導表達后，進行重組蛋白的純化，SDS-PAGE分析顯示，目的蛋白成功純化，AlgL7、CD1和CD2的分子質量分別約為71.5、32.0 kDa和60.0 kDa（圖2a），與蛋白質的理論分子質量吻合。酶活力分析結果表明，以海藻酸鈉為底物，AlgL7、CD1和CD2的比活力分別為125.1、125.9 U/mg和183.9 U/mg（圖2b）。AlgL7和CD2的酶活力相比，CBM結構域截短會顯著增強酶的催化活性，CD2是AlgL7全長酶活力的1.47 倍，來自Vibrio natriegensSK42.001褐藻膠裂解酶Aly01FL的CBM截短體也顯示出類似酶活力增強的現(xiàn)象[21]，來自Marinimicrobiumsp.H1褐藻膠裂解酶AlgH-I的CBM截短體顯示出酶活力降低的影響結果[16]。CD1和CD2酶活力相比，F(xiàn)5/8 C型結構域截短會降低酶的催化活性，F(xiàn)lammeovirgasp.MY04來源褐藻膠裂解酶Aly5的F5/8 C截短體對海藻酸鈉的酶活力也低于野生型酶[22]，說明F5/8 C型結構域在維持酶活力方面具有重要作用。催化活性是酶應用的一個重要指標，高活性褐藻膠裂解酶在工業(yè)上具有更大的應用價值。

圖2 褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體的SDS-PAGE（a）和酶活力（b）分析Fig.2 SDS-PAGE (a) and enzymatic activity (b) analysis of alginate lyase AlgL7 and its truncations

2.3 褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體的底物特異性

利用海藻酸鈉、polyM和polyG 3 種多糖作為底物進行酶的底物特異性研究。如圖3所示，AlgL7、CD1和CD2對海藻酸鈉、polyM和polyG 3 種底物均有活性，說明非催化結構域CBM和F5/8 C型結構域未影響酶的底物特異性，它們對底物的催化活性不是必需，這與Yan Junjun等[16]報道的結果類似，底物特異性并沒有因為刪除CBM和F5/8 C型結構域而發(fā)生變化。另外，與AlgL7相比，CD2對ployG的酶活力顯著提高，CD1和CD2對polyM的酶活力顯著降低，CD2對海藻酸鈉的酶活力顯著提高，說明非催化結構域CBM和F5/8 C型結構域影響了酶對不同底物的催化活性。

圖3 褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體的底物特異性Fig.3 Substrate specificity of alginate lyase AlgL7 and its truncations

CBM為碳水化合物活性酶內(nèi)的連續(xù)氨基酸序列，大多數(shù)獨立形成β-三明治形狀的折疊區(qū)，參與酶與底物的結合與識別，以及產(chǎn)物的釋放[23-24]。與本研究結果不同，來自Agarivoranssp.L11褐藻膠裂解酶AlyL2的CBM13使該酶易于降解M-block底物[25]。與本研究結果類似，來源于Vibrio natriegensSK42.001褐藻膠裂解酶Aly01FL的CBM模塊缺失導致酶對PolyM催化活性降低[21]。本研究中，去除CBM結構域的CD1和CD2截短酶對polyM酶活力顯著降低（圖3），說明非催化結構域CBM可能影響了AlgL7對PolyM底物的結合與識別。據(jù)報道，PL7家族褐藻膠裂解酶的底物特異性與保守區(qū)的蛋白質序列有關[26]。PL7家族的褐藻膠裂解酶包含3 個高度保守的區(qū)域（R/E）（S/T/N）EL、Q（I/V）H和YFKAG（V/I）YNQ，這些保守區(qū)域形成了β-三明治形狀的空腔結合底物。本研究中，褐藻膠裂解酶AlgL7包含QIH保守結構域，是一個對polyM和polyG都起作用的雙功能褐藻膠裂解酶。

F5/8 C型結構域被稱為discoidin（DS）結構域，它可以通過增強酶與底物的相互作用能提高糖苷水解酶的水解活性[27]。本研究中，與CD2相比，去除F5/8 C型結構域的CD1截短酶對PolyG和海藻酸鈉的酶活力顯著降低（圖3），說明F5/8 C型結構域可能影響了AlgL7對PolyG底物的相互作用。

2.4 溫度對AlgL7及其截短體活性和穩(wěn)定性的影響

如圖4a所示，AlgL7和CD2在40 ℃時催化活性最高，CD1的最適反應溫度為30 ℃，說明CBM對酶的最適反應溫度無影響，F(xiàn)5/8 C型結構域去除降低了酶的最適反應溫度。大部分PL7家族褐藻膠裂解酶的最適反應溫度為30～45 ℃，例如Serratia marcescensNJ-07來源褐藻膠裂解酶AlgNJ-07[28]、Flammeovirgasp.strain MY04來源褐藻膠裂解酶Aly2[29]和Vibrio furnissiiH1來源褐藻膠裂解酶AlyH1[30]的最適反應溫度均為40 ℃。根據(jù)Meng Qing等[21]的研究報道，移除CBM結構域并不改變褐藻膠裂解酶Aly01的最適反應溫度。而褐藻膠裂解酶AlyL2中，截短CBM13結構域，酶的最適反應溫度降低了10 ℃[25]。另外，與本研究結果類似，來自Flammeovirgasp.MY04褐藻膠裂解酶Aly5中F5/8 C型結構域的去除降低了酶的最適反應溫度[22]，表明F5/8 C型結構域在酶的生化特性中與酶最適反應溫度緊密相關。

圖4 溫度對褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體酶活力（a）和穩(wěn)定性（b）的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity (a) and stability (b) of alginate lyase AlgL7 and its truncations

如圖4b所示，相較于AlgL7，截短酶CD2的熱穩(wěn)定性顯著增強，在20～35 ℃下孵育15 min，殘余酶活力保持在45%以上，表明非催化結構域CBM的截短提高了酶的熱穩(wěn)定性。截短褐藻膠裂解酶的非催化結構域后，該酶可能具有緊湊的三維結構，更有利于抵抗熱變性條件[7]。與本研究結果不同，褐藻膠裂解酶AlyL2的CBM提高了酶熱穩(wěn)定性[25]。另外，在20～35 ℃范圍內(nèi)，截短酶CD1的溫度穩(wěn)定性低于截短酶CD2，說明F5/8 C型結構域的去除降低了酶的溫度穩(wěn)定性。酶的溫度穩(wěn)定性提高有利于酶的工業(yè)應用[31]。

2.5 pH值對AlgL7及其截短體活性和穩(wěn)定性的影響

如圖5a所示，AlgL7及其截短體的最適反應pH值均為7.0，說明CBM和F5/8 C型結構域對酶的最適反應pH值無影響。褐藻膠裂解酶AlgH結構中F5/8 C型結構域也不改變酶的最適反應pH值[16]。如圖5b所示，截短體CD2在pH 3.0～6.0和8.0～11.0范圍內(nèi)的pH值穩(wěn)定性高于AlgL7，表明CBM的去除提高了酶在酸性和堿性條件下穩(wěn)定性。對褐藻膠裂解酶AlyL2-FL去除C端的CBM結構域，最適反應pH值由8.6降低至7.0，在pH 3.0～6.0范圍內(nèi)去除CBM的截短體保留酶活力遠低于原始型酶。對褐藻膠裂解酶VxAly7B去除N端的CBM結構域，酶的最適反應pH值提高了0.6，在pH 3.0～6.0范圍內(nèi)殘余酶活力略高于原始型酶[32]。另外，本研究中截短酶CD2相較于CD1在pH 3.0～6.0和10.0～11.0范圍內(nèi)pH值穩(wěn)定性高于CD1（圖5b），表明F5/8 C型結構域提高了酶在酸性和堿性條件下的穩(wěn)定性。

圖5 pH值對褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體酶活力（a）和穩(wěn)定性（b）的影響Fig.5 Effects of pH on the activity (a) and stability (b) of alginate lyase AlgL7 and its truncations

2.6 褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體的動力學參數(shù)

如表2所示，以海藻酸鈉為底物，AlgL7的Km和Vmax值最低，CD2的Km和Vmax值最高，表明CBM結構域降低了酶的最大反應速率，但提高了酶與底物之間的親和力，促進AlgL7與海藻酸鈉的結合；F5/8 C型結構域提高了酶的最大反應速率，但降低了酶與底物之間的親和力。相似的研究結果出現(xiàn)在Marinimicrobiumsp.H1來源褐藻膠裂解酶AlgH中，不含CBM的截短酶Km和Vmax值增大[16]。然而，在不同褐藻膠裂解酶中，CBM表現(xiàn)出不同的影響，例如CBM32降低了褐藻膠裂解酶VxAly7B對海藻酸鈉的親和力[32]。

表2 褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體對海藻酸鈉的動力學參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of alginate lyase AlgL7 and its truncations on sodium alginate

2.7 褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體的酶解產(chǎn)物分析

利用液相色譜-質譜分析AlgL7、CD1和CD2降解海藻酸鈉、polyG和polyM的終產(chǎn)物組成。如圖6所示，AlgL7能夠將海藻酸鈉降解生成聚合度為2、3和4的寡糖，降解polyG和polyM的主要產(chǎn)物為二糖和三糖（圖6a～c），表明AlgL7是一種內(nèi)切型褐藻膠裂解酶。CD1和CD2降解海藻酸鈉、polyM和polyG的產(chǎn)物均為二糖和三糖（圖6d～i）。上述結果表明，CBM和F5/8 C型結構域對酶解產(chǎn)物沒有顯著差異，表明非催化結構域在底物降解模式中沒有發(fā)揮重要作用。

圖6 褐藻膠裂解酶AlgL7及其截短體酶解產(chǎn)物的質譜分析Fig.6 Mass spectra of the enzymatic hydrolysates obtained using AlgL7 and its truncations

3 結論

克隆表達了微泡菌ALW1來源的褐藻膠裂解酶全長酶AlgL7及其兩個截短酶CD1（催化結構域）、CD2（包含F(xiàn)5/8 C型結構域和催化結構域）。酶學性質的比較分析顯示，CBM結構域降低了酶的催化活性、熱穩(wěn)定性和Vmax值，但提高了酶與底物的親和力；F5/8 C型結構域提高了酶的催化活性、最適反應溫度、熱穩(wěn)定性和Vmax值，但降低了酶與底物的親和力。截短體CD2的酶活力和熱穩(wěn)定性得到顯著提高，能降解海藻酸鈉生成聚合度低的褐藻膠寡糖二糖、三糖和四糖。本研究明確了非催化模塊CBM和F5/8 C型結構域對褐藻膠裂解酶AlgL7酶學性質的影響，獲得了具有優(yōu)良性質的截短酶CD2，擴大該褐藻膠裂解酶的應用范圍。