單核細(xì)胞增生李斯特氏菌內(nèi)化素InlJ對(duì)噬菌體敏感性及生物被膜形成的影響

劉半紅，胡梁斌，陸 睿，吳立婷，包紅朵，周 艷，王 冉，張 輝,

（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，江蘇 南京 210014；3.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

李斯特菌屬（Listeriaspp.）是一類能夠引起動(dòng)物和人李斯特菌病的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（G+），其中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（L.monocytogenes，Lm）是最重要的食源性人獸共患病原菌，感染者主要表現(xiàn)為腸胃炎、流產(chǎn)、腦炎及腦膜炎等，住院率可達(dá)91%，死亡率20%～30%，在新生兒中死亡率高達(dá)50%[1]。Lm在自然界中廣泛分布，常存在于人和蠕蟲類動(dòng)物的腸道、土壤、水以及新鮮蔬菜中[2]，據(jù)美國(guó)FoodNet數(shù)據(jù)顯示，2017—2020年間，Lm在全美共引發(fā)食品中毒事件553 起，病死率高達(dá)16.25%[3]。作為一種胞內(nèi)寄生菌，Lm在感染過程中，侵入細(xì)胞的主要毒力因子是其表面的內(nèi)化素引發(fā)的，通過內(nèi)化素進(jìn)入、生存并在吞噬和非吞噬細(xì)胞內(nèi)呈指數(shù)增殖[4]。此外，Lm為了在環(huán)境中生存，通過形成豐富的生物被膜黏附于生物或非生物表面[5]，由于生物被膜具有特殊的多層立體結(jié)構(gòu)，可作為細(xì)菌的保護(hù)機(jī)制，幫助細(xì)菌逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的清除和藥物的殺滅[6]。

已有研究表明，約80%細(xì)菌感染與生物被膜形成有關(guān)，60%食源性食物中毒暴發(fā)事件均是由食源性致病菌生物被膜引起[7]。內(nèi)化素InlA是最早鑒定出與宿主細(xì)胞特異性受體結(jié)合介導(dǎo)Lm進(jìn)入非吞噬細(xì)胞的毒力因子[8]，比較基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)內(nèi)化素InlJ與內(nèi)化素InlA結(jié)構(gòu)相同[9]，C-末端包含Leu-ProX-Thr-Gly（LPXTG）基序元件，N-末端為L(zhǎng)RR，通過分選酶Sort A識(shí)別共價(jià)結(jié)合到細(xì)胞壁肽聚糖上[10]。但有關(guān)InlJ功能的研究報(bào)道相對(duì)較少，目前僅有研究表明inlJ基因缺失可導(dǎo)致其毒力降低[9]，因而明確InlJ功能將有助于揭示擁有LPXTG及LRR結(jié)構(gòu)域蛋白的新功能。Capestany等[11]發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌inlJ基因的缺失減少了生物被膜的形成，表明inlJ基因?qū)ι锉荒ば纬删哂兄匾饔?。噬菌體被視為細(xì)菌克星之一，能夠有效裂解宿主菌并抑制生物被膜形成。研究表明，噬菌體能夠很好地抑制和清除銅綠假單胞菌[12]、沙門氏菌[13]和大腸桿菌等生物被膜的形成，并在生物被膜相關(guān)的尿路感染、骨科感染和口腔感染[14]等得到很好地應(yīng)用。肽聚糖是在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁上發(fā)現(xiàn)的最豐富的糖聚合物，其介導(dǎo)噬菌體的相互作用[15]。InlJ是Lm細(xì)胞壁表面蛋白家庭成員，能夠共價(jià)結(jié)合到細(xì)胞壁肽聚糖上，從而可能參與噬菌體與宿主的相互作用。為了進(jìn)一步解析inlJ基因功能，本研究利用同源重組方法構(gòu)建inlj基因缺失菌株，并對(duì)缺失株的生物學(xué)特性、噬菌體敏感性以及生物被膜形成進(jìn)行研究，以期更有效地揭示inlJ基因在噬菌體與Lm相互作用中的調(diào)節(jié)功能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LmNJ05（1/2a血清型）和噬菌體vB-LmoM-NJ05均由江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地保存和鑒定分離鑒定并保存；pKSV7溫度敏感型穿梭載體由揚(yáng)州大學(xué)朱國(guó)強(qiáng)教授惠贈(zèng)。

瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒、細(xì)菌總RNA提取試劑盒生工生物工程（上海）股份有限公司；T4DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶 美國(guó)Thermo Fisher公司；DNA Marker、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京擎科生物科技股份有限公司；氯霉素 上海源葉生物公司；牛腦心浸出液（brian heart infusion，BHI）養(yǎng)基 海博生物技術(shù)公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SM830立式壓力蒸汽滅菌器 日本Yamato公司；SW-CJ-1F超凈臺(tái) 蘇州真田潔凈設(shè)備有限公司；Ultrospec-10-pro細(xì)胞密度計(jì) 美國(guó)Amersham Biosciences公司；PowerPac HC電泳儀、MicroPulserTM電穿孔儀、Universal Hood II凝膠成像系統(tǒng)、C1000Touch梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Bio-Rad公司；多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；5810R高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取LmNJ05基因組DNA。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)

參考Gen Bank 中標(biāo)準(zhǔn)菌株EDG-e 基因組序列（NC_003210.1），并比對(duì)同源性及分析最大開放閱讀框后，利用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)引物和分子鑒定引物（表1），引物P1和P2用于擴(kuò)增inlJ基因片段確定上下游同源臂，分別于引物P3和P4的5’端及3’端加BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基。實(shí)驗(yàn)引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列Table l Primer sequences designed in this study

1.3.3 重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-ΔinlJ的構(gòu)建

以LmNJ05 DNA為模板，通過引物P1和P2擴(kuò)增，由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。經(jīng)Overlap PCR擴(kuò)增上、下游同源臂純化產(chǎn)物，將融合產(chǎn)物與pUC57載體，命名為pUC57-ΔinlJ，通過大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化后測(cè)序；以引物P3和P4擴(kuò)增陽(yáng)性克隆并測(cè)序鑒定。將穿梭質(zhì)粒pKSV7和ΔinlJ目的條帶分別用BamHI和KpnI于37 ℃酶切，然后用T4DNA連接酶16 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物用熱激轉(zhuǎn)化法（42 ℃），轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有氨芐青霉素（50 μg/mL）的LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。隨機(jī)挑取疑似陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性菌，并送公司測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證以獲得構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pKSV7-ΔinlJ。

1.3.4LmNJ05-ΔinlJ缺失株的構(gòu)建、篩選和鑒定

根據(jù)Parsons等[16]方法制備LmNJ05感受態(tài)細(xì)胞。取1 μg pKSV7-ΔinlJ加入100 μLLmNJ05感受態(tài)細(xì)胞中并混勻，隨后電擊轉(zhuǎn)化（2.5 kV/cm、4.8 ms），涂布到含有氯霉素（10 μg/mL）的BHI固體平板上，30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h，隨機(jī)挑取單菌落接種到含氯霉素（10 μg/mL）的BHI液體培養(yǎng)基中，在氯霉素和溫度（42 ℃）雙重壓力下進(jìn)行同源重組，并以P3和P4為引物，PCR擴(kuò)增（反應(yīng)條件同上）篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。在30 ℃無氯霉素壓力條件下傳代培養(yǎng)約10 代完成質(zhì)粒pKSV7消殺過程，將末代菌液涂布BHI平板，挑取單菌落再次進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定，最終獲得無氯霉素抗性的LmNJ05-ΔinlJ缺失株。

1.3.5LmNJ05-ΔinlJ缺失株生長(zhǎng)特性

將LmNJ05、LmNJ05-ΔinlJ劃線于BHI固體平板，37 ℃倒置過夜培養(yǎng)。次日，挑取單菌落到BHI液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（OD600nm約為0.6），再按體積比為1∶100接入到新鮮BHI液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔30 min取出測(cè)定OD600nm，用OriginPro 8.5軟件繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.6LmNJ05-ΔinlJ缺失株對(duì)細(xì)胞的黏附和侵襲性

將培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7經(jīng)胰蛋白酶消化后移至48 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至細(xì)胞密度約為5.0×105Cell/mL。棄去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）將細(xì)胞漂洗3 遍，加入無抗改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco，DMEM）。每孔加入LmNJ05-ΔinlJ缺失株培養(yǎng)液0.5 mL（5×107CFU/mL）培養(yǎng)1 h，PBS洗滌細(xì)胞3 次，加入300 μL 0.2% Triton X-100和胰蛋白酶作用15 min，吸取各孔懸液，稀釋后涂板計(jì)數(shù)測(cè)定黏附細(xì)菌的數(shù)量。每孔中細(xì)胞用PBS洗滌2 次，并重新懸浮在含有慶大霉素（100 μg/mL）的1 mL DMEM培養(yǎng)基中，以測(cè)定侵襲細(xì)菌的數(shù)量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.7LmNJ05-ΔinlJ缺失株噬菌體成斑率（efficiency of plaquing，EOP）分析

取過夜培養(yǎng)LmNJ05和LmNJ05-ΔinlJ菌液，調(diào)整各菌液OD600nm值為1.0（108CFU/mL），分別與相同濃度的vB-LmoM-NJ05噬菌體進(jìn)行雙層平板EOP實(shí)驗(yàn)，記錄噬菌斑數(shù)量，計(jì)算LmNJ05-ΔinlJ突變體的EOP，判斷噬菌體與突變體的反應(yīng)敏感性。計(jì)算公式如下：

式中：A為測(cè)試菌株（LmNJ05-ΔinlJ）噬菌斑形成量/（PFU/mL）；B為標(biāo)準(zhǔn)菌株（LmNJ05）噬菌斑形成量/（PFU/mL）。

1.3.8 噬菌體對(duì)LmNJ05-ΔinlJ缺失株裂解活性

分別調(diào)整LmNJ 05 和LmNJ 05-ΔinlJ菌液至OD600nm=1.0，取500 μL菌液加入48 孔板中，以最佳感染復(fù)數(shù)為1加入500 μL噬菌體，并設(shè)置相應(yīng)菌株對(duì)照組，每隔30 min通過酶標(biāo)儀測(cè)定OD600nm值，直至10 h。

1.3.9 噬菌體對(duì)生物被膜抑制和清除能力測(cè)定

噬菌體vB-LmoM-NJ05對(duì)LmNJ05和LmNJ05-ΔinlJ生物被膜的抑制和清除能力實(shí)驗(yàn)方法如下：BHI瓊脂平板劃線復(fù)蘇菌株，分別挑取單菌落至5 mL BHI肉湯，37 ℃振蕩過夜培養(yǎng)16 h，調(diào)整到OD600nm至0.1，加入100 μL菌液到96 孔板中，分成兩組：A組抑制生物被膜實(shí)驗(yàn)，加入100 μL不同濃度的噬菌體vB-LmoM-NJ05（105、106、107、108PFU/mL），37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，之后結(jié)晶紫染色；B組清除生物被膜實(shí)驗(yàn)，菌液培養(yǎng)48 h后，除去各孔的浮游菌，并用PBS洗滌3 次，加入100 μL不同滴度的噬菌體vB-LmoM-NJ05（104、105、106、107、108PFU/mL）與生物被膜在37 ℃孵育12 h，然后結(jié)晶紫染色，酶標(biāo)儀測(cè)定OD590nm。

1.3.10 RNA提取、cDNA合成及逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR（reverse transcription real-time PCR，RT-real-time PCR）

為了闡明內(nèi)化素InlJ在生物被膜形成及其在噬菌體敏感性中的作用，利用RT-real-time PCR分析生物被膜相關(guān)基因（hpt、agrD、yneA、agrA、degU、luxS、flaA和recA）轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，引物信息建表2。簡(jiǎn)而言之，將1 mLLmNJ05和LmNJ05-ΔinlJ（108CFU/mL）分別與1 mL噬菌體vB-LmoM-NJ05（108PFU/mL）37 ℃靜置2 h，將混合物10000×g離心5 min，將LmNJ05和LmNJ05-ΔinlJ作為對(duì)照組。根據(jù)產(chǎn)品說明提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。real-time PCR體系[17]：2 μL cDNA、0.5 μL上下游引物、10 μL SYBR Green qPCR Supermix和7.5 μL RNase-free H2O進(jìn)行real-time PCR，反應(yīng)終體積為20 μL。real-time PCR的循環(huán)參數(shù)如下：95 ℃預(yù)變性30 s、95 ℃變性10 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s，40 個(gè)循環(huán)。

表2 RT-real-time PCR引物Table 2 RT-real-time PCR primers

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間差異采用t檢驗(yàn)。采用OriginPro 8.5和GraphPad Prism 9.0.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-ΔinlJ的鑒定

對(duì)穿梭載體pKSV7和基因片段ΔinlJ酶切，T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化至DH5α，挑選陽(yáng)性克隆，測(cè)序結(jié)果表明，ΔinlJ缺失序列分別由上游222 bp和下游239 bp組成，全長(zhǎng)共461 bp。電泳結(jié)果和預(yù)期大小相符，測(cè)序結(jié)果比對(duì)一致，表明重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-ΔinlJ構(gòu)建成功（圖1）。

圖1 重組質(zhì)粒pKSV7-ΔinlJ鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pKSV7-ΔinlJ

2.2 Lm NJ05-ΔinlJ構(gòu)建、篩選與鑒定

如圖2所示，pKSV7-ΔinlJ質(zhì)粒和inlJ基因缺失株擴(kuò)增產(chǎn)物均為332 bp，未擴(kuò)增出inlJ序列；而LmNJ05野生株擴(kuò)增產(chǎn)物為2888 bp的inlJ基因序列（圖2），表明inlJ基因完全缺失，成功構(gòu)建穩(wěn)定的inlJ基因缺失株，命名為L(zhǎng)mNJ05-ΔinlJ。

圖2 缺失株Lm NJ05-ΔinlJ鑒定Fig.2 Identification of Lm NJ05-ΔinlJ

2.3 Lm NJ05-ΔinlJ生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將LmNJ05和LmNJ05-ΔinlJ在37 ℃條件下培養(yǎng)10 h，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)其OD600nm值，根據(jù)結(jié)果繪制生長(zhǎng)曲線見圖3，顯示缺失株LmNJ05-ΔinlJ與野生株LmNJ05在0～3 h時(shí)間段內(nèi)均處于適應(yīng)期，3～7 h時(shí)間段內(nèi)處于對(duì)數(shù)期，生長(zhǎng)趨勢(shì)無顯著差異，由此可見，inlJ基因的缺失對(duì)其生長(zhǎng)特性無顯著影響。

圖3 Lm NJ05-ΔinlJ缺失株生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of Lm NJ05-ΔinlJ

2.4 黏附性與侵襲性

通過RAW264.7細(xì)胞分析缺失株LmNJ05-ΔinlJ對(duì)細(xì)胞黏附和侵襲活性的變化，由圖4可知，LmNJ05和LmNJ05-ΔinlJ對(duì)RAW264.7細(xì)胞的黏附率分別為33.5%和20.05%（圖4），LmNJ05-ΔinlJ的黏附能力顯著降低（P＜0.05）。對(duì)RAW264.7細(xì)胞的侵襲性結(jié)果表明，LmNJ05和LmNJ05-ΔinlJ對(duì)RAW264.7細(xì)胞的侵襲力分別為8.25%和4.42%（圖5），缺失株侵襲力顯著下降（P＜0.01）。綜上所述，inlJ基因缺失對(duì)細(xì)胞的黏附和侵襲性均減弱。

圖4 Lm NJ05和Lm NJ05-ΔinlJ對(duì)細(xì)胞的黏附能力Fig.4 Cell adhesion of Lm NJ05 and Lm NJ05-ΔinlJ

圖5 Lm NJ05和Lm NJ05-ΔinlJ對(duì)細(xì)胞的侵襲能力Fig.5 Cell invasion of Lm NJ05 and Lm NJ05-ΔinlJ

2.5 Lm NJ05-ΔinlJ對(duì)噬菌體vB-LmoM-NJ05敏感性

通過EOP分析LmNJ05和LmNJ05-ΔinlJ對(duì)噬菌體的敏感性。結(jié)果表明，LmNJ05-ΔinlJEOP較LmNJ05高至2.72 倍（表3），表明inlJ基因缺失會(huì)影響噬菌體和宿主菌株之間的敏感性，成斑效果增強(qiáng)。此外，與野生株LmNJ05相比，缺失株LmNJ05-ΔinlJ形成的噬菌體斑更加清晰透明（圖6），進(jìn)一步表明缺失inlJ基因能夠增強(qiáng)其與噬菌體的敏感性。

圖6 Lm NJ05（A）和Lm NJ05-ΔinlJ（B）EOP分析Fig.6 EOP analysis of Lm NJ05 (A) and Lm NJ05-ΔinlJ (B)

表3 噬菌體vB-LmoM-NJ05的EOPTable 3 EOP of phage vB-LmoM-NJ05

2.6 Lm NJ05-ΔinlJ對(duì)噬菌體vB-LmoM-NJ05裂解活性

由圖7可知，噬菌體vB-LmoM-NJ05對(duì)LmNJ05-ΔinlJ抑制效果更顯著。在作用2 h內(nèi)，噬菌體對(duì)LmNJ05和LmNJ05-ΔinlJ作用效果相似，但在2 h后至10 h，噬菌體對(duì)LmNJ05-ΔinlJ的敏感性明顯增強(qiáng)，與LmNJ05相比呈顯著差異。由此可見，inlJ基因缺失能夠增強(qiáng)其對(duì)噬菌體vB-LmoM-NJ05裂解活性。

圖7 噬菌體對(duì)Lm NJ05和Lm NJ05-ΔinlJ體外裂解活性Fig.7 Lytic activity of phage on Lm NJ05 and Lm NJ05-ΔinlJ

2.7 噬菌體對(duì)Lm生物被膜抑制及清除效果

由圖8可知，inlJ基因缺失之后，LmNJ05-ΔinlJ生物被膜形成能力顯著降低（P＜0.01），當(dāng)噬菌體vB-LmoM-NJ05以105PFU/mL作用Lm，能夠有效抑制生物被膜的形成，且對(duì)LmNJ05-ΔinlJ抑制能力更強(qiáng)（P＜0.05），同樣以106～108PFU/mL噬菌體作用后，能夠完全抑制生物被膜形成。利用噬菌體清除生物被膜的結(jié)果表明，當(dāng)以108PFU/mL噬菌體作用時(shí)，能夠完全清除LmNJ05-ΔinlJ形成的生物被膜，與LmNJ05呈顯著差異（圖9，P＜0.001）。由此可見，inlJ基因的缺失，使其生物被膜的形成能力減弱，從而使噬菌體對(duì)其清除力更為顯著。

圖8 噬菌體對(duì)Lm NJ05和Lm NJ05-ΔinlJ生物被膜抑制能力Fig.8 Biofilm inhibitory effect of phage against Lm NJ05 and Lm NJ05-ΔinlJ

圖9 噬菌體對(duì)Lm NJ05和Lm NJ05-ΔinlJ生物被膜清除能力Fig.9 Biofilm removal capacity of phage against Lm NJ05 and Lm NJ05-ΔinlJ

2.8 生物被膜形成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄分析

flaA、degU、agrA、agrD和luxS等基因參與早期生物被膜形成，而yneA、recA和hpt等基因作用于生物被膜成熟階段[18]。RT-real-time PCR的結(jié)果表明，與LmNJ05相比，LmNJ05-ΔinlJ編碼生物被膜相關(guān)基因degU、agrA、agrD、luxS、yneA、recA和hpt的轉(zhuǎn)錄水平均下降（圖10）。當(dāng)噬菌體vB-LmoM-NJ05作用缺失株后，生物被膜相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平下降極為明顯，均呈下調(diào)趨勢(shì)。由此可見，inlJ基因缺失負(fù)調(diào)控生物被膜形成相關(guān)基因的表達(dá)，降低生物被膜的形成能力。此外，當(dāng)噬菌體作用后，生物被膜形成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)極為顯著，從而缺失株生物被膜形成能力減弱，噬菌體對(duì)其更具清除能力。

圖10 生物被膜形成相關(guān)基因的表達(dá)分析Fig.10 Relative expression levels of biofilm formation-related genes

3 討論

Lm表面蛋白是細(xì)菌代謝、群體感應(yīng)、生物被膜形成和毒力基因表達(dá)調(diào)控的重要調(diào)節(jié)因子，與細(xì)菌致病性密切相關(guān)。由于表面蛋白的存在使Lm能夠在低溫環(huán)境中[19]復(fù)制增殖，并且侵染多種真核細(xì)胞[20]。迄今為止，在Lm基因組中發(fā)現(xiàn)了41 個(gè)編碼LPXTG蛋白的基因[21]，inlA是最早被發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)Lm入侵宿主細(xì)胞的LPXTG表面蛋白基因，其主要作用機(jī)制是與宿主細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合，誘導(dǎo)非吞噬細(xì)胞將菌體內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部寄生，許多研究表明inlA在穿透腸道屏障的過程中發(fā)揮重要作用[22]。inlJ是編碼LPXTG蛋白的基因之一，任靜靜等[23]發(fā)現(xiàn)，inlJ缺失株對(duì)小鼠的感染能力和毒力均降低。本研究中，LmNJ05-ΔinlJ對(duì)RAW264.7細(xì)胞侵襲和黏附均顯著降低，由此表明，inlJ參與了Lm的毒力作用機(jī)制。

噬菌體作為天然生物抑菌劑已在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注[24]，由于其在去除致病菌污染[25]和消除生物被膜[26]的形成的優(yōu)勢(shì)，已被嘗試用于水果、即食食品[27]、奶酪和牛奶[28]等食品的保鮮抑菌和人類疾病的臨床治療中[29]。細(xì)菌可以通過多種方式避免被噬菌體感染[30]，例如吸附阻斷和阻礙噬菌體DNA的進(jìn)入。在本研究中，重點(diǎn)分析了食源性LmNJ05中inlJ基因作用特性，結(jié)果表明inlJ基因缺失使其對(duì)噬菌體vB-LmoM-NJ05的敏感性增強(qiáng)。缺失株LmNJ05-ΔinlJ對(duì)噬菌體的EOP增加到2.72 倍，噬菌斑更清晰透明，且噬菌體對(duì)LmNJ05-ΔinlJ抑制活性更強(qiáng)。由此可見inlJ基因參與Lm與噬菌體的相互作用。

生物被膜能夠保護(hù)微生物在不利環(huán)境中持續(xù)生長(zhǎng)，使環(huán)境各介質(zhì)之間反復(fù)交叉污染[31]。王少輝等[32]研究表明，inlK基因的缺失會(huì)導(dǎo)致Lm生物被膜形成能力顯著降低。本研究中inlJ基因的缺失降低了Lm生物被膜的形成，這可能是InlJ與InlK一樣同屬于Lm表面蛋白，與細(xì)菌胞外蛋白或組織表面的物質(zhì)發(fā)生相互作用，有利于Lm黏附在物體表面促進(jìn)生物被膜的形成。此外，本研究發(fā)現(xiàn)噬菌體vB-LmoM-NJ05也能夠很好地抑制和清除Lm生物被膜，特別是對(duì)于LmNJ05-ΔinlJ缺失株，抑制效果更為明顯，這可能與InlJ表面蛋白的缺失導(dǎo)致生物被膜的形成能力降低，噬菌體vB-LmoM-NJ05對(duì)LmNJ05-ΔinlJ敏感性增強(qiáng)相關(guān)。Lm生物被膜的形成與很多因素相關(guān)，例如鞭毛糖蛋白相關(guān)因子FlaA、DegU，群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)因子Agr、LuxS和胞外基質(zhì)相關(guān)因子yneA、Hpt等[33-36]。本研究發(fā)現(xiàn)inlJ基因的缺失導(dǎo)致參與生物被膜形成的相關(guān)基因表達(dá)降低，并且在LmNJ05-ΔinlJ與噬菌體vB-LmoMNJ05相互作用后，使這些基因幾乎無應(yīng)答。由此表明，inlJ基因缺失影響生物被膜基因表達(dá)，降低Lm生物被膜的形成能力，與噬菌體作用之后，生物被膜形成相關(guān)基因表達(dá)持續(xù)降低，以此抑制和清除生物被膜。綜上所述，LPXTG蛋白會(huì)參與噬菌體與Lm間的識(shí)別及互作，目前暫未見相關(guān)報(bào)道，但其為L(zhǎng)PXTG蛋白在噬菌體敏感性中的功能揭示將為噬菌體對(duì)抗菌和治療中提供重要的理論支撐。

4 結(jié)論

通過同源重組技術(shù)成功構(gòu)建了缺失株LmNJ05-ΔinlJ，inlJ基因缺失對(duì)細(xì)胞的黏附和侵襲性下降，減弱了生物被膜形成能力，但對(duì)噬菌體的敏感性顯著增強(qiáng)，進(jìn)而使噬菌體對(duì)缺失株LmNJ05-ΔinlJ生物被膜的抑制和清除能力得到了顯著提高，生物被膜形成相關(guān)基因的表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)。由此可見，作為L(zhǎng)PXTG蛋白成員的InlJ參與噬菌體與Lm間的識(shí)別及相互作用，這為L(zhǎng)PXTG蛋白新功能的揭示奠定了重要依據(jù)，為噬菌體的生物防治提供了新的理論依據(jù)。