豌豆分離蛋白/普魯蘭/大蒜素復(fù)合靜電紡絲納米纖維材料的制備及抑菌性

賈惜文，劉九陽(yáng)，王靜杰，劉 騫，王 浩，孔保華，王 輝,

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083）

隨著社會(huì)發(fā)展和人們生活水平的提高，食品安全問題受到越來(lái)越多的關(guān)注，采用適當(dāng)?shù)陌b可以在一定程度上保證食品的質(zhì)量安全。然而，傳統(tǒng)包裝材料難降解甚至不可降解，僅能起到阻隔作用，在改善食品品質(zhì)、延長(zhǎng)貨架期方面不具備優(yōu)勢(shì)。因此，開發(fā)綠色、安全、可降解且能保持食品品質(zhì)并延長(zhǎng)食品貨架期的包裝材料有助于減少因食品腐敗而造成的資源浪費(fèi)，對(duì)我國(guó)食品安全建設(shè)十分重要。

抗菌包裝可通過其含有的抗菌成分抑制或殺滅食品表面微生物，達(dá)到延長(zhǎng)食品貨架期的目的[1]?？咕b形式眾多，例如揮發(fā)性抗菌包裝，此方法雖然便捷，但是抑菌效果一般且對(duì)食品具有選擇性[2]；涂膜法雖然效果好，但是貯藏期短且要求抗菌劑必須耐高溫[3]；化學(xué)鍵合型抗菌包裝抗菌劑的釋放速度和擴(kuò)散濃度較低，無(wú)法實(shí)現(xiàn)較好的抑菌效果[4]。隨著材料科學(xué)和納米技術(shù)的迅速興起，靜電紡絲技術(shù)制備納米纖維抗菌材料已經(jīng)成為近幾年的研究熱點(diǎn)。

靜電紡絲技術(shù)具有易于操作、成本低廉、條件溫和以及負(fù)載量高等諸多優(yōu)點(diǎn)，是負(fù)載抗菌物質(zhì)制備納米包裝材料的理想方式[5]?？紤]到食品抗菌包裝材料的安全性和環(huán)境保護(hù)問題，天然聚合物如蛋白質(zhì)和多糖因其具有可食性和易降解等優(yōu)點(diǎn)成為靜電紡絲納米纖維的理想壁材。豌豆分離蛋白（pea protein isolate，PPI）是一種高附加值的蛋白質(zhì)資源，具有良好的分散性和穩(wěn)定性等特征，可與多糖復(fù)配用于功能性食品和生物材料領(lǐng)域[6]。普魯蘭多糖（pullulan，PUL）是一種優(yōu)異的天然助紡材料，具有良好的黏合性和優(yōu)異的成膜性[7]。將PPI與PUL復(fù)合可提高電紡溶液的可紡性和成膜性[8]。

大蒜素（allicin，AC）是大蒜中廣泛存在的一種具有抑菌活性的有機(jī)硫化合物。研究表明AC對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都具有明顯的抑制效果[9]。AC可以通過與含巰基的酶發(fā)生氧化反應(yīng)或通過抑制生物膜的形成起到抑菌作用[10]。但是AC穩(wěn)定性差，容易受到氧化劑、光和熱等因素的影響而分解[11]。而納米技術(shù)可以用來(lái)提高AC的穩(wěn)定性、溶解度及生物利用率[12]。Wang Yufeng等[13]研究了AC微膠囊對(duì)豆腐、面包、雞肉和豬肉等常規(guī)食品的保鮮效果，結(jié)果表明AC負(fù)載型微膠囊對(duì)這些常規(guī)食品的抑菌保鮮效果顯著。然而，目前鮮見關(guān)于利用靜電紡絲技術(shù)包覆AC的相關(guān)報(bào)道。

基于前期工作[8]，本研究利用靜電紡絲技術(shù)成功制備具有抑菌效果的PPI/PUL/AC復(fù)合納米纖維材料，重點(diǎn)考察AC添加量對(duì)納米纖維結(jié)構(gòu)特性、形貌特征、直徑分布以及抑菌效果的影響。制備工藝操作簡(jiǎn)便、條件溫和、綠色高效，為新型活性食品包裝材料的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PPI（純度80%）宿州市皖神面制品有限公司；PUL（純度90%）天津北洋百川生物技術(shù)有限公司；AC（純度99%）上海源葉生物有限公司；葡萄糖國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；供試菌株實(shí)驗(yàn)所用菌株分別為大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 13565，均保存于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；所用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

DFS-001靜電紡絲設(shè)備 北京鎧為信技術(shù)有限公司；SN-3400場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）日本日立有限公司；ALPHA-T傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 德國(guó)布魯克科技有限公司；TA-XT plus型質(zhì)構(gòu)儀 日本島津有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PPI/PUL/AC復(fù)合納米纖維的制備

稱取一定量的PPI和PUL，按照質(zhì)量比20∶80，用蒸餾水（pH 6.91）配制成總聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.5%的溶液。然后，將AC加入上述聚合物溶液，AC添加量為5%、10%、15%和20%（基于聚合物溶液的質(zhì)量），室溫（25 ℃）、500 r/min攪拌2～3 h，得到均一溶液。

使用高壓靜電紡絲裝置制備納米纖維，具體參數(shù)如下：電壓18 kV，流速0.4 mL/h，不銹鋼針頭直徑為0.8 mm，接收板到注射器針尖的距離為10 cm，紡絲溫度25 ℃，相對(duì)濕度50%。將制備的靜電紡絲納米纖維收集在接收板的錫紙上，35 ℃真空干燥12 h后備用。具體工藝流程如圖1所示。

圖1 PPI/PUL/AC復(fù)合納米纖維膜的制備工藝Fig.1 Preparation process of PPI/PUL/AC composite nanofiber films

1.3.2 PPI/PUL/AC復(fù)合納米纖維紅外光譜的測(cè)定

為確定纖維組分之間的組成和相互作用，使用FTIR記錄纖維的紅外光譜數(shù)據(jù)。光譜掃描范圍為4000～600 cm-1，波數(shù)分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為16 次。

1.3.3 PPI/PUL/AC復(fù)合納米纖維微觀形貌的觀察

利用SEM觀察靜電紡絲納米纖維的形貌結(jié)構(gòu)。參照J(rèn)ia Xiwen等[8]的方法，首先將制備的納米纖維膜樣品裁剪成2 mm×3 mm的矩形小片，將其用導(dǎo)電膠粘貼到樣品臺(tái)上，然后進(jìn)行噴金處理，最后放置于機(jī)器中進(jìn)行樣品觀察和分析。其中放大倍數(shù)為2000～10000 倍，加速電壓5.0 kV，工作距離11.5 mm。另外，采用Image J-Diameter J圖像分析軟件測(cè)量纖維直徑。

1.3.4 PPI/PUL/AC復(fù)合納米纖維力學(xué)性能測(cè)定

參照王博等[14]的方法利用TA.XT Plus型質(zhì)構(gòu)儀對(duì)納米纖維膜的力學(xué)性能（彈性模量、拉伸強(qiáng)度、斷裂伸長(zhǎng)率）進(jìn)行測(cè)定。將膜樣品裁剪為5 cm×2 cm的長(zhǎng)方形，設(shè)定拉伸強(qiáng)度參數(shù)為1 mm/min。用壓敏膠帶將膜樣品固定在拉伸探頭（A/SPR）上，按下啟動(dòng)按鈕，使探頭慢慢將膜向上拉，直至膜斷裂。每個(gè)膜樣品做3 個(gè)平行。膜拉伸強(qiáng)度按式（1）計(jì)算，斷裂伸長(zhǎng)率按式（2）計(jì)算：

式中：F為最大張力/N；S為伸長(zhǎng)距離/mm；L為膜斷裂時(shí)標(biāo)線之間的距離/mm；ΔL為斷裂時(shí)膜被拉伸的長(zhǎng)度/mm。

1.3.5 PPI/PUL/AC復(fù)合納米纖維抑菌性能的測(cè)定

參照Shojaee-Aliabadi[15]和Yang Yufan[16]等的方法并稍作修改，采用抑菌圈法研究納米纖維膜對(duì)常見食源性微生物（金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）的抑菌性能。具體操作步驟如下：菌種（金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）活化，傳代2～3 次，接種后37 ℃培養(yǎng)18 h，然后對(duì)菌懸液梯度進(jìn)行稀釋，平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)，制成濃度為1×107～1×108CFU/mL的菌懸液。其次，用打孔器將制得的抗菌膜打出大小均勻一致的直徑為1 cm的圓片，稱量每個(gè)圓片的質(zhì)量，并放在紫外燈下滅菌2 h；最后，分別將0.1 mL上述兩種菌懸液加入到制備的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯平板中，涂布均勻，得到含菌平板；將上述已滅菌的抗菌膜貼于含菌平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈并記錄其大小。

參照Aytac[17]和Yang Yufan[16]等的方法并稍作修改，通過活細(xì)胞計(jì)數(shù)法評(píng)估納米纖維膜抑菌活性。首先將0.1 mL的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌種接種于100 mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯中，活化2～3 代，使細(xì)菌濃度達(dá)到1011CFU/mL。然后，取活化后的菌液1 mL添加到無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯（0.8%）中，并進(jìn)行十進(jìn)制稀釋至濃度為103～106CFU/mL。將納米纖維膜樣品（直徑為10 mm，紫外燈滅菌2 h）分別放入金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的稀釋營(yíng)養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。最后取培養(yǎng)后的菌液0.1 mL涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，記錄菌落總數(shù)，生長(zhǎng)抑制率按式（3）計(jì)算：

式中：A為未經(jīng)納米纖維膜處理的菌落總數(shù)/（CFU/mL）；B為納米纖維膜處理組的菌落總數(shù)/（CFU/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。數(shù)據(jù)使用Statistix 8.1（Analysis Software，St Paul，MN，USA）進(jìn)行分析，并以表示。采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析，判斷均數(shù)之間的顯著差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同AC添加量PPI/PUL/AC復(fù)合納米纖維紅外光譜分析

如圖2所示，首先，PPI/PUL/AC復(fù)合納米纖維中顯示了PUL特征峰，3342 cm-1對(duì)應(yīng)于O—H的拉伸振動(dòng)，該吸收譜帶受分子間或分子內(nèi)氫鍵影響較大[8]；2926 cm-1對(duì)應(yīng)C—H鍵的伸縮振動(dòng)。其次，1533 cm-1和1350 cm-1分別是蛋白酰胺II帶和酰胺III帶的特征峰[8]，且這些特征峰在所有復(fù)合膜中均存在，表明復(fù)合膜中蛋白和多糖之間存在相互作用，并較好地復(fù)合在一起。此外，純AC的FTIR光譜在920、1017、1423、1633、3080 cm-1處顯示出特征峰，分別對(duì)應(yīng)于官能團(tuán)是C—H彎曲、C—O伸縮振動(dòng)、C—N伸縮振動(dòng)、C＝O伸縮振動(dòng)、O—H伸縮振動(dòng)[18]。與此同時(shí)，在PPI/PUL/AC共混體系中，同樣觀察到了920、1017、1423、1633 cm-1的AC特征峰，表明AC與PPI/PUL共混溶液之間存在分子間或者分子內(nèi)的相互作用，證實(shí)這3 種物質(zhì)在納米纖維中同時(shí)存在。

圖2 不同AC添加量PPI/PUL/AC納米纖維膜的紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra of allicin and PPI/PUL/AC nanofibers with different contents of allicin

2.2 不同AC添加量PPI/PUL/AC復(fù)合納米纖維形貌及直徑分布

研究表明，小分子物質(zhì)的加入會(huì)對(duì)纖維形貌產(chǎn)生一定的影響[19]。圖3和表1為復(fù)合納米纖維膜的微觀形貌及其直徑分布情況。由圖3可以看出，納米纖維呈隨機(jī)定向分布，隨著溶液中AC添加量增大，納米纖維的直徑呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢(shì)（P＜0.05），而“球形”結(jié)構(gòu)逐漸增多且尺寸也逐漸增大（P＜0.05）。這是由于靜電紡絲過程中溶劑的迅速蒸發(fā)，導(dǎo)致纖維中形成“球形”結(jié)構(gòu)，這也證實(shí)了AC成功被包裹在PPI/PUL納米纖維中，形成核-殼結(jié)構(gòu)。研究表明，小分子生物活性物質(zhì)的濃度對(duì)纖維中“球形”狀結(jié)構(gòu)的密度和尺寸起重要作用。Vega-Lugo等[20]的研究表明隨著異硫氰酸烯丙酯添加量從5%增加到20%，納米纖維直徑變得更小，“球形”狀結(jié)構(gòu)密度越大。劉雨雨[21]通過分析負(fù)載氧化鋅的明膠復(fù)合納米纖維膜的形貌，發(fā)現(xiàn)不添加氧化鋅的纖維膜表面光滑，纖維平均粒徑為500 nm，當(dāng)氧化鋅添加量為2.0%時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)聚集現(xiàn)象。李珍光[22]在制備含有天然抗菌劑丁香酚的多組分電紡納米纖維膜研究中也得到類似的結(jié)果。

表1 不同AC添加量納米纖維尺寸Table 1 Size of PPI/PUL/AC nanofiber films with different contents of allicin

圖3 不同AC添加量PPI/PUL/AC納米纖維膜的掃描電子顯微鏡（放大倍數(shù)為2000和5000）及直徑分布圖Fig.3 Scanning electron micrographs of PPI/PUL/AC nanofiber films(at × 2000 and × 5000 magnification) and diameter distribution

2.3 不同AC添加量PPI/PUL/AC復(fù)合納米纖維力學(xué)性能分析

從表2可以看出，納米纖維膜的彈性模量和拉伸強(qiáng)度隨AC添加量增加呈先升高后下降的趨勢(shì)，且當(dāng)AC添加量為15%時(shí)達(dá)到最大值，其彈性模量和拉伸強(qiáng)度比未添加AC的納米纖維膜分別提高了68.35 MPa和1.98 MPa，這表明AC的加入可適當(dāng)提高納米纖維膜的力學(xué)性能。相關(guān)研究表明，對(duì)于復(fù)合體系而言，小分子生物活性物質(zhì)的分散性及其與聚合物基質(zhì)之間的相互作用強(qiáng)弱程度對(duì)復(fù)合體系的力學(xué)性能具有顯著影響[23-24]。復(fù)合體系內(nèi)分子分散度越好，體系中相互作用效果越好力學(xué)性能越強(qiáng)。當(dāng)AC添加量為20%時(shí)，納米纖維膜的力學(xué)性能有所降低，這主要是因?yàn)锳C含量太高，易發(fā)生聚集行為，降低了復(fù)合纖維體系的分散性，使得力學(xué)性能下降。

表2 不同AC添加量納米纖維膜機(jī)械性能Table 2 Mechanical properties of PPI/PUL/AC nanofiber films with different contents of allicin

2.4 不同AC添加量PPI/PUL/AC復(fù)合納米纖維抑菌性能分析

圖4表明，當(dāng)AC添加量為5%時(shí)，對(duì)于大腸桿菌和金黃色葡萄球而言，納米纖維膜均未出現(xiàn)抑菌圈。AC添加量為15%的納米纖維膜對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出最大抑菌圈（12.8 mm），AC添加量為20%的納米纖維膜對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出最大抑菌圈（16.5 mm），與15% AC添加量相比，僅增加0.3 mm。

圖4 不同AC添加量PPI/PUL/AC納米纖維膜對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈Fig.4 Antibacterial efficacy of PPI/PUL/AC nanofiber films against E.coli and S.aureus

采用活細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)PPI/PUL/AC納米纖維膜對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性。從圖5可以看出，隨著納米纖維膜中AC添加量的增多，細(xì)菌菌落的數(shù)量減少，復(fù)合納米纖維膜對(duì)細(xì)菌的抑制率明顯提高（P＜0.05）。當(dāng)納米纖維膜中AC添加量為15%時(shí)，抑制率最大（大腸桿菌抑制率91%，金黃色葡萄球菌抑制率86%），此時(shí)菌落數(shù)最少。這表明AC添加量大于15%的PPI/PUL/AC納米纖維膜具有抑菌作用，而AC添加量較低的納米纖維膜則對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制率較低甚至沒有抑菌作用。該研究結(jié)果表明PPI/PUL/AC復(fù)合納米纖維膜具有抑菌活性。Wang Yufeng等[13]研究AC微膠囊對(duì)日常食品（豆腐、面包、雞肉和豬肉）的保鮮作用，結(jié)果顯示AC微膠囊抗菌效果顯著。李珍光[22]研究含有天然抗菌劑丁香酚的多組分電紡納米纖維膜的抑菌活性，研究表明隨著電紡納米纖維膜樣品中丁香酚含量的增加，抑菌率逐漸升高，丁香酚添加量為30%時(shí)，復(fù)合電紡納米纖維膜具有最高的抑菌率，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率分別為71.6%和78.6%。此外，許多研究報(bào)道了利用靜電紡絲技術(shù)包覆其他活性化合物，如肉桂醛[16]、姜黃素[19,25-26]、茶多酚[27-28]、丁羥基茴香醚[29]、花青素[30]、丁香酚[31]和花椒精油[32]等，同樣實(shí)現(xiàn)抑菌的功效。綜上所述，利用靜電紡絲制備的復(fù)合納米纖維膜具有抑菌活性，可用于食品包裝領(lǐng)域。

圖5 不同AC添加量PPI/PUL/AC納米纖維膜對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制率Fig.5 Inhibitory effect of PPI/PUL/AC nanofiber films with different contents of allicin on the growth of E.coli and S.aureus

3 結(jié)論

利用靜電紡絲技術(shù)成功制備了PPI/PUL/AC抗菌納米纖維膜。FTIR證實(shí)納米纖維中存在AC，通過分析納米纖維膜的性質(zhì)可知，隨著AC的加入，納米纖維會(huì)出現(xiàn)一些“球形”結(jié)構(gòu)，“球形”數(shù)量隨著AC添加量的增大而增多。同時(shí)，AC的復(fù)合可顯著提高納米纖維膜的力學(xué)性能，當(dāng)AC添加量為15%時(shí)，納米纖維膜的力學(xué)性能最佳。抑菌性能測(cè)試結(jié)果表明，包覆AC的納米纖維膜對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑制作用，特別是當(dāng)AC添加量達(dá)到15%及以上時(shí)，納米纖維膜的抑菌作用顯著。利用靜電紡絲制備的抗菌納米纖維在食品包裝領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。