石瑞桃,許曉敏,許喆,馬堃,鄒宇,李瑤瑤,韓世英,李婷婷,韓玲鈺
(大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 大連,116600)
我國擁有豐富的魚類資源,隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖及魚類產(chǎn)品加工產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展,魚糜制品的消費(fèi)量也越來越大。魚糜制品因其食用簡便、營養(yǎng)價(jià)值高、保質(zhì)期長而受到消費(fèi)者喜愛[1]。我國大連地區(qū)盛產(chǎn)鲅魚,是北方重要的經(jīng)濟(jì)魚,其具有產(chǎn)量高、肉質(zhì)肥厚、刺少等特點(diǎn),是魚糜加工的主要原材料。但由于冷藏保鮮過程中魚肉蛋白容易變質(zhì),從而使魚肉的保水性、凝膠性等性能下降,影響產(chǎn)品的質(zhì)量和營養(yǎng)價(jià)值[2]。關(guān)于開發(fā)能夠提升魚糜制品品質(zhì)添加劑的研究有待進(jìn)一步深入。
隨著水產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展,水產(chǎn)品生產(chǎn)中的魚皮、魚頭、魚鱗等廢棄物也隨之產(chǎn)生,而國內(nèi)的鱈魚產(chǎn)量大,加工時(shí)所產(chǎn)生的魚皮廢棄物占總重量的7%~8%,既浪費(fèi)了資源,又對(duì)環(huán)境造成了極大的污染。研究表明,鱈魚皮中膠原蛋白含量占總蛋白含量的70%以上[3]。鱈魚魚皮肽由魚皮經(jīng)蛋白酶酶解獲得,具有保水性等良好的功能特性[4]。卡拉膠是從紅海藻的細(xì)胞外基質(zhì)中提取的主要多糖成分,具有優(yōu)異的穩(wěn)定性和凝膠形成性能,已廣泛應(yīng)用于食品和化妝品行業(yè)。當(dāng)前用于魚糜產(chǎn)品加工的卡拉膠類型多是Kappa(κ-型)與Iota(ι-型),而對(duì)于Ramota(λ-型)的應(yīng)用研究較少。其中,κ-卡拉膠已被廣泛應(yīng)用于改善魚糜凝膠品質(zhì)。CHEN等[5]研究表明κ-卡拉膠能顯著提高鯉魚魚糜的凝膠強(qiáng)度。當(dāng)前對(duì)κ-型、ι-型、λ-型3種不同類型卡拉膠之間的性質(zhì)差異研究并不充分。美拉德反應(yīng)是由蛋白質(zhì)的游離氨基和還原糖的羰基發(fā)生的非酶促褐變的化學(xué)反應(yīng),劉建華等[6]研究表明蛋清蛋白與刺槐豆膠和瓜爾豆膠的美拉德產(chǎn)物顯著增強(qiáng)魚糜制品的凝膠特性。許亞彬等[7]研究表明糖基化改性蛋清粉能提高鰱魚魚糜凝膠的凝膠強(qiáng)度和白度。何進(jìn)武等[8]研究表明糖基化大豆分離蛋白能顯著提高鯉魚魚糜凝膠的硬度、彈性和黏結(jié)性。本實(shí)驗(yàn)采用干法美拉德反應(yīng),將3種不同構(gòu)型的卡拉膠與鱈魚魚皮膠原蛋白肽進(jìn)行糖基化反應(yīng),以鲅魚魚糜作為對(duì)象,探究3種不同構(gòu)型的卡拉膠制備的糖基化產(chǎn)物對(duì)魚糜凝膠產(chǎn)生的性能影響,為保障2次成型魚糜產(chǎn)品的質(zhì)量提供方法。
鱈魚魚皮膠原蛋白肽,濱州萬嘉生物科技有限公司;κ-型、ι-型、λ-型卡拉膠,源葉生物科技有限公司;KBr(光譜純),科密歐;β-巰基乙醇、1-苯胺基-8-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS),阿拉丁試劑有限公司;其他化學(xué)品和試劑均為分析級(jí)。
FD-1C-50型冷凍干燥機(jī),北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;NicoletTMiS50傅里葉變換紅外光譜儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;UV-160型紫外可見分光光度計(jì),上海美譜達(dá)儀器有限公司;LS55熒光光譜儀,珀金埃爾默儀器有限公司;TA.XT.plus質(zhì)構(gòu)儀,北京微訊超技儀器技術(shù)有限公司。
1.3.1 鱈魚魚皮膠原蛋白肽-卡拉膠美拉德反應(yīng)體系制備
將鱈魚魚皮肽溶于磷酸鹽緩沖液中(0.05 mmol/L,pH 7.0),將卡拉膠加入鱈魚魚皮肽水溶液中攪拌至完全溶解(肽∶卡拉膠質(zhì)量比4∶1),冷凍后在冷凍干燥機(jī)中凍干。將凍干樣品置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d,每2 d采集樣品,相對(duì)溫度和濕度為60 ℃和79%,制得3種不同美拉德產(chǎn)物:ι-卡拉膠-魚皮肽美拉德產(chǎn)物(ι-car-CSCP MRPs)、κ-卡拉膠-魚皮肽美拉德產(chǎn)物(κ-car-CSCP MRPs)、λ-卡拉膠-魚皮肽美拉德產(chǎn)物(λ-car-CSCP MRPs),密封保存于-20 ℃。
1.3.2 紅外光譜分析
根據(jù)李靈誠[9]的方法進(jìn)行制樣,采用Nicoletis-50紅外光譜儀在4 000~400 cm-1掃描。
1.3.3 接枝度的測定
根據(jù)MAO等[10]的方法稍作修改。通過使用鄰苯二甲醛(o-phthaldialdehyde,OPA)測定游離氨基酸的減少來測定結(jié)合效率,OPA具體配制方法如下:稱取40 mg OPA溶于1.0 mL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇中,依次加入25 mL四硼酸鈉緩沖溶液(0.1 mol/L)、2.5 mL SDS溶液(20%,體積分?jǐn)?shù))、0.1 mL β-巰基乙醇后混合均勻,最后加水至總體積為50 mL。
用OPA法定量游離氨基,0.05 mL的5 mg/mL樣品與1.35 mL的OPA試劑混合,室溫下水浴1 min,立即用紫外-分光光度計(jì)在340 nm處測定吸光度。以L-亮氨酸(1~5 mmol/L)作為含氨基的標(biāo)準(zhǔn)化合物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。接枝度的計(jì)算如公式(1)所示:
接枝度/%=(1-結(jié)合后的氨基含量/結(jié)合前的氨基含量)×100
(1)
1.3.4 褐變顏色測定
采用紫外-分光光度計(jì)在420 nm處測定3種不同種類鱈魚魚皮膠原蛋白肽-卡拉膠美拉德產(chǎn)物棕色溶液(10 mg/mL)的吸光度。
1.3.5 表面疏水性測定
根據(jù)LUO等[11]的方法稍作修改。將蛋白質(zhì)量濃度稀釋至0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2 mg/mL(0.02 mol/L、pH 7磷酸緩沖液),分別向4 mL樣品溶液中加入20 μL 8 mmol/L的ANS溶液,立即混勻,在390/470 nm(激發(fā)/發(fā)射)下檢測熒光強(qiáng)度。用熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)量濃度作圖并進(jìn)行線性回歸,表面疏水性的值即為線性回歸斜率。
1.3.6 熒光光譜測定
根據(jù)CAO等[12]的方法做簡要修改,配制基于不同類型卡拉膠糖的糖肽樣品,質(zhì)量濃度為2 mg/mL,熒光光譜儀設(shè)置參數(shù):激發(fā)波長為347 nm,掃描范圍為360~600 nm。
1.3.7 鲅魚魚糜凝膠的制備
取魚肉,用5倍體積浸泡20 min,漂洗2次。再用體積分?jǐn)?shù)0.3%的NaCl溶液浸泡20 min后過濾。將魚肉、魚肉質(zhì)量3%的食鹽和魚肉質(zhì)量5%的8 g/L卡拉膠糖基化產(chǎn)物溶液分別放入攪拌機(jī)內(nèi),混合攪拌2 min,之后把制備好的魚糜二段式加熱獲得魚糜凝膠,40 ℃加熱35 min后90 ℃加熱20 min。然后冷卻至室溫,放入4 ℃冰箱保存。
1.3.8 鲅魚魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)特性分析
利用質(zhì)構(gòu)儀測定魚糜凝膠強(qiáng)度和全質(zhì)構(gòu)分析(texture profile analysis,TPA),魚糜凝膠強(qiáng)度的測定如公式(2)所示[13]:將魚糜樣品制成各邊長度為20 mm的立方體,測試條件:探頭型號(hào)P/5S;測前測后速度均為1 mm/s;觸發(fā)力15 g。
凝膠強(qiáng)度/(g·mm)=破斷力(g)×破斷距離(mm)
(2)
魚糜凝膠TPA參數(shù)的測定:將魚糜樣品制成各邊長度為20 mm的立方體,測試條件:探頭型號(hào)P/50;測前,測中,測后速度均為1 mm/s;觸發(fā)力5 g。
傅里葉紅外光譜常用于分析蛋白質(zhì)或多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu),主要通過蛋白在中紅外區(qū)的典型的特征峰而分析肽鏈的結(jié)構(gòu)變化。圖1為3種美拉德產(chǎn)物FTIR譜圖,在3 500~3 000 cm-1內(nèi)出現(xiàn)一個(gè)寬峰,這可能是游離羥基伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的,或是N—H鍵變形振動(dòng)造成的;其次均在1 260~1 000 cm-1內(nèi)出現(xiàn)吸收峰,此范圍下的特征峰為碳氧鍵的伸縮振動(dòng)造成的。這是由于美拉德反應(yīng)后,糖鏈上的羥基引入到肽鏈上,使得肽鏈中羥基和碳氧鍵數(shù)量增加,使得對(duì)應(yīng)的吸收增強(qiáng)[14]。GENG等[15]制備了卵清蛋白和羧甲基纖維素糖基化產(chǎn)物,同樣通過紅外光譜分析得到羥基的特征吸收峰增強(qiáng)。因此上述現(xiàn)象表明糖分子以共價(jià)鍵形式接入到了鱈魚魚皮肽中,形成了美拉德產(chǎn)物。另外,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,鱈魚魚皮肽糖基化產(chǎn)物3 500~3 000 cm-1和1 260~1 000 cm-1光譜強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),主要是由于糖分子以共價(jià)鍵形式接入肽中,使游離羥基數(shù)量增多,而美拉德反應(yīng)時(shí)間越長,反應(yīng)越徹底,羥基數(shù)量越多,從而導(dǎo)致峰的強(qiáng)度越大。
a-ι-car-CSCP MRPs;b-κ-car-CSCP MRPs;c-λ-car-CSCP MRPs圖1 不同孵育時(shí)間糖基化產(chǎn)物的傅里葉紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of the glycosylated products at different reaction times
評(píng)價(jià)美拉德反應(yīng)程度的重要指標(biāo)是游離氨基酸的含量,隨著游離氨基酸消耗量的增多,反應(yīng)越完全,隨之接枝度越高。利用OPA法測定了美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)合效率,如圖2所示,隨著反應(yīng)時(shí)間延長,3種不同美拉德產(chǎn)物的接枝度呈增長趨勢,且ι-car-CSCP MRPs、κ-car-CSCP MRPs、λ-car-CSCP MRPs在孵育14 d后,接枝度最高,最高接枝度分別為35.64%、32.25%、45.54%。美拉德反應(yīng)伴隨著褐變,據(jù)目前研究表明棕色物質(zhì)來源于二次美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物。圖2同時(shí)顯示在不同孵育時(shí)間下,3種美拉德產(chǎn)物在420 nm處的吸光值,結(jié)果表明吸光值與孵育時(shí)間成正相關(guān),即溶液褐變程度隨著孵育時(shí)間越來越深,此現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于美拉德反應(yīng)后期形成大量的褐色聚合體類黑精,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,產(chǎn)生的色素物質(zhì)增加,導(dǎo)致褐變程度加深[16]。其次,在美拉德反應(yīng)中,鱈魚魚皮膠原蛋白肽-卡拉膠美拉德反應(yīng)速率與接枝度成正比。
熒光物質(zhì)是褐變產(chǎn)物形成之前產(chǎn)生的,是美拉德反應(yīng)的早期指標(biāo)。美拉德反應(yīng)過程中,初始中間體通過Strecker降解轉(zhuǎn)化為一種熒光物質(zhì),然后進(jìn)一步反應(yīng),發(fā)生褐變[17]。如圖3所示,3種不同卡拉膠美拉德產(chǎn)物均在孵育4 d后,熒光強(qiáng)度達(dá)到最大,隨后隨著時(shí)間的延長熒光強(qiáng)度逐漸減少,LIU等[18]在乳清分離蛋白和葡萄糖美拉德產(chǎn)物中也得到類似的結(jié)論,研究表明,乳清蛋白葡萄糖美拉德產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度在第4天達(dá)到最大,然后下降。JING等[19]制備了核糖與酪蛋白美拉德產(chǎn)物,研究發(fā)現(xiàn)美拉德產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度同樣在第4天達(dá)到最大,然后下降。產(chǎn)生此現(xiàn)象可能是因?yàn)殡逆溤诩訜徇^程中結(jié)構(gòu)被破壞,暴露出更多具有熒光吸收能力的苯環(huán)基團(tuán),使熒光強(qiáng)度增加。而在熒光強(qiáng)度達(dá)到峰值后隨反應(yīng)時(shí)間的增加而降低,可能是由于肽與卡拉膠發(fā)生共價(jià)反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物的空間位阻增加,減弱了氨基酸吸收熒光的信號(hào),導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低[20]。因此熒光物質(zhì)在前4天不斷生成,4 d后熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)化為褐色化合物,導(dǎo)致熒光物質(zhì)減少,熒光強(qiáng)度降低。
a-ι-car-CSCP MRPs;b-κ-car-CSCP MRPs;c-λ-car-CSCP MRPs圖3 不同孵育糖基化時(shí)間產(chǎn)物的熒光光譜圖Fig.3 Intrinsic fluorescence spectra of glycosylated products with different reaction time
圖4為3種不同美拉德產(chǎn)物的表面疏水性分析,分析可知,當(dāng)具有多羥基的卡拉膠與鱈魚魚皮膠原蛋白肽發(fā)生共價(jià)交聯(lián),且隨著反應(yīng)時(shí)間加長,表面疏水性明顯降低。說明糖基化后肽表面親水簇分子減少,有研究表明,當(dāng)在肽上接入卡拉膠分子時(shí),打破了肽自身的親水和疏水平衡,肽鏈中親水基團(tuán)數(shù)量增加,分子表面的親水性增強(qiáng);其次,引入卡拉膠后,肽鏈分子內(nèi)部的極性基團(tuán)暴露出來,疏水性降低[21]。3種美拉德產(chǎn)物表面疏水性隨著孵育時(shí)間增長而降低,當(dāng)孵育14 d時(shí),ι-car-CSCP MRPs與第0天相比降低了40.78%;κ-car-CSCP MRPs與第0天相比降低了33.95%;λ-car-CSCP MRPs與第0天相比降低了30.73%。三者對(duì)比,ι-car-CSCP MRPs對(duì)表面疏水性改變最大。由此可知,隨著卡拉膠接枝到鱈魚魚皮膠原蛋白肽上,膠原蛋白肽的表面疏水性降低,整個(gè)體系的親水性增強(qiáng),使膠原蛋白肽更易于在體系中分散,故通過美拉德反應(yīng),鱈魚魚皮膠原蛋白肽的溶解性得到改善,其次較大的溶解有利于鱈魚魚皮膠原蛋白肽向氣-水或油-水界面的擴(kuò)散,極大地改善了肽的乳化性、起泡性等功能性質(zhì)[22]。
a-ι-car-CSCP MRP;b-κ-car-CSCP MRPs;c-λ-car-CSCP MRPs圖4 不同孵育時(shí)間糖基化產(chǎn)物的表面疏水性Fig.4 Surface hydrophobicity of glycosylated products at different reaction times注:不同小寫字母表示差異顯著,P<0.05。
表1、表2和表3為3種不同卡拉膠糖基化產(chǎn)物在不同孵育時(shí)間下對(duì)魚糜凝膠TPA性能的影響。分析可得,添加糖基化產(chǎn)物后的魚糜凝膠相比于未添加的空白組來說,硬度都有顯著的提升,而彈性、黏聚性和回復(fù)性無太大差別。對(duì)于κ-car-CSCP MRPs,當(dāng)樣品孵育時(shí)間為6 d時(shí),硬度達(dá)到最大,相較于空白組提高了36.63%;對(duì)于ι-car-CSCP MRPs,當(dāng)樣品孵育時(shí)間為4 d時(shí),硬度達(dá)到最大,相較于空白組提高了40.91%;對(duì)于λ-car-CSCP MRPs,當(dāng)樣品孵育時(shí)間為2 d時(shí),硬度達(dá)到最大,相較于空白組提高了7.65%。在此基礎(chǔ)上,分析可得當(dāng)κ-car-CSCP MRPs在孵育6 d時(shí),魚糜凝膠的硬度達(dá)到最大。因此,添加糖基化產(chǎn)物能增加魚糜硬度,且當(dāng)κ-car-CSCP MRPs孵育6 d時(shí),硬度達(dá)到最大,為31.31 N。產(chǎn)生此差異的原因是由于卡拉膠自身的凝膠性質(zhì)決定,不同類型卡拉膠的增稠和膠凝性質(zhì)有很大的不同,κ-型卡拉膠與K+形成硬且脆的凝膠,而ι-型和λ-型卡拉膠形成的凝膠較為柔軟。因此糖基化反應(yīng)后,添加κ-car-CSCP MRPs的魚糜硬度也相應(yīng)較大。
表1 添加不同孵育時(shí)間ι-卡拉膠糖基化產(chǎn)物對(duì)魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)的影響Table 1 Effects of adding ι-car-CSCP MRPs at different reaction times on the texture properties of surimi gel
表2 添加不同孵育時(shí)間κ-卡拉膠糖基化產(chǎn)物對(duì)魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)的影響Table 2 Effects of adding κ-car-CSCP MRPs at different reaction times on the texture properties of surimi gel
表3 添加不同孵育時(shí)間λ-卡拉膠糖基化產(chǎn)物對(duì)魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)的影響Table 3 Effects of adding λ-car-CSCP MRPs at different reaction times on the texture properties of surimi gel
凝膠強(qiáng)度是評(píng)價(jià)魚糜品質(zhì)的重要指標(biāo)。圖5顯示了3種美拉德產(chǎn)物對(duì)魚糜凝膠強(qiáng)度的影響。不同反應(yīng)時(shí)間下,3種美拉德產(chǎn)物的添加對(duì)魚糜凝膠強(qiáng)度的影響類似。隨著孵育時(shí)間的的延長都呈先上升后下降的趨勢。對(duì)于κ-卡拉膠,孵育時(shí)間為6 d時(shí)凝膠強(qiáng)度最大,為1 825.48 g·mm;對(duì)于ι-卡拉膠,孵育時(shí)間為4 d時(shí)凝膠強(qiáng)度最大,為1 700.10 g·mm;對(duì)于λ-卡拉膠,孵育時(shí)間為2 d時(shí)凝膠強(qiáng)度最大,為1 408.03 g·mm。且添加卡拉膠美拉德產(chǎn)物的魚糜其凝膠強(qiáng)度均高于未添加卡拉膠美拉德產(chǎn)物的魚糜凝膠強(qiáng)度,說明3種卡拉膠美拉德產(chǎn)物的添加對(duì)于魚糜凝膠強(qiáng)度的提升有一定作用??赡苁怯捎谠谥谱黥~糜的過程中,卡拉膠能與肌肉中蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用,強(qiáng)化了由于肌球蛋白受熱變性伸展交聯(lián)形成的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),從而增強(qiáng)凝膠網(wǎng)絡(luò)并減少水分損失[23]。其中,κ-car-CSCP MRPs孵育6 d時(shí)的凝膠強(qiáng)度最好,研究表明肌原纖維蛋白交聯(lián)是魚糜凝膠的骨架,而κ-卡拉膠可以作為黏合劑來加強(qiáng)這種基質(zhì),使其更緊湊和更堅(jiān)固,從而增強(qiáng)凝膠強(qiáng)度[24]。其次,鱈魚魚皮肽在美拉德反應(yīng)前期,由于肽的結(jié)構(gòu)部分展開,可以提高肽的凝膠性,但過度結(jié)合亦使糖基化產(chǎn)物溶解度降低,導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)的弱化[25],因此,當(dāng)添加孵育6 d的κ-卡拉膠糖肽物時(shí),魚糜的凝膠強(qiáng)度達(dá)到最大。
圖5 添加不同孵育時(shí)間糖基化產(chǎn)物的魚糜凝膠強(qiáng)度Fig.5 Gel strength of surimi with glycosylated products at different reaction times
綜上所述,3種不同構(gòu)型卡拉膠與鱈魚魚皮肽經(jīng)由糖基化反應(yīng)制備肽糖基化產(chǎn)物,紅外光譜圖表明糖分子以共價(jià)鍵形式接入到了鱈魚魚皮肽中,形成了美拉德產(chǎn)物。其次隨著孵育時(shí)間的增加,反應(yīng)物形成大量的褐色聚合體類黑精,使糖基化產(chǎn)物的接枝度、褐變程度逐漸提高;熒光強(qiáng)度是美拉德反應(yīng)早期產(chǎn)物,在4 d達(dá)到最大值,隨后下降;而引入卡拉膠后,肽鏈分子內(nèi)部的極性基團(tuán)暴露出來,表面疏水性隨時(shí)間的延長而降低。3種構(gòu)型的卡拉膠糖基化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特性有所差異,但產(chǎn)生差異的機(jī)理還需進(jìn)一步探究。將3種不同糖基化產(chǎn)物添加入鲅魚魚糜中,制得魚糜凝膠,相較于空白組,魚糜凝膠的凝膠強(qiáng)度和硬度都有顯著提升,其中孵育6 d的κ-car-CSCP MRPs加入到魚糜凝膠中后,使其凝膠強(qiáng)度和硬度達(dá)到最大,分別為1 825.48 g·mm和31.31 N,主要是由于κ-型卡拉膠形成的凝膠硬且脆,而ι-型和λ-型卡拉膠形成的凝膠較為柔軟。綜合考慮凝膠強(qiáng)度和質(zhì)構(gòu)的測定結(jié)果,向魚糜凝膠中添加孵育6 d的κ-car-CSCP MRPs,魚糜凝膠的品質(zhì)最優(yōu)質(zhì)。本研究探討了不同構(gòu)型卡拉膠與鱈魚魚皮肽制備肽糖基化產(chǎn)物,3種產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)都存在差異,其次將3種糖基化產(chǎn)物添加至魚糜凝膠中,為改善鲅魚魚糜品質(zhì)提供了理論基礎(chǔ),同時(shí)實(shí)現(xiàn)了鱈魚魚皮肽的廢物利用,提高了鱈魚魚皮肽的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,拓寬了鱈魚魚皮肽的應(yīng)用范圍。