具有調(diào)節(jié)血糖功效的復(fù)合植物酵素的研究

陳青青,董墨思,石巖,張雨婷,楊宇峰,李蘇紅*

1(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng),110866)2(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院、中醫(yī)學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng),110847)

糖尿病是由于胰島素代謝異常或胰島素分泌不足而導(dǎo)致的慢性高血糖疾病,僅次于惡性腫瘤、心腦血管疾病,是危害人類(lèi)健康的第三大疾病[1]。長(zhǎng)期的高血糖會(huì)增加心血管疾病、視網(wǎng)膜病變及神經(jīng)性病變的風(fēng)險(xiǎn),同時(shí)會(huì)導(dǎo)致患者產(chǎn)生糖尿病足、創(chuàng)口不愈合潰瘍等現(xiàn)象[2-4]。目前糖尿病尚無(wú)治愈的方法,因此控制血糖對(duì)預(yù)防糖尿病及并發(fā)癥具有重要作用,日常生活中人們食用具有調(diào)節(jié)血糖功效的功能性食品具有廣闊的應(yīng)用前景。

食用植物酵素是以可用于食品加工的植物為主要原料,經(jīng)酵母菌、乳酸菌和霉菌等益生菌發(fā)酵制得含有特定功能性成分可供人體食用的產(chǎn)品[5]。益生菌發(fā)酵能在改善產(chǎn)品風(fēng)味的同時(shí)產(chǎn)生新的次級(jí)代謝產(chǎn)物和活性成分,增加酵素的保健功能。近年來(lái),酵素的市場(chǎng)需求量日益增大,市售酵素種類(lèi)逐漸增多,其研究主要集中在降脂減肥[6]、改善腸道菌群[7]、提高免疫力[8]、增強(qiáng)消化功能和胃腸道吸收[9]及抗氧化[10]等方面,調(diào)節(jié)血糖的酵素產(chǎn)品研究相對(duì)較少,且進(jìn)口食用酵素售價(jià)普遍昂貴。故本研究以紅參、玉竹、馬齒莧、枸杞、柚子、南瓜、生姜、芹菜、山藥為原料,復(fù)合乳酸菌為菌種,α-淀粉酶抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo),通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝,旨在探討乳酸菌發(fā)酵對(duì)酵素α-淀粉酶抑制率的影響,為開(kāi)發(fā)具有調(diào)節(jié)血糖功效的功能型食用酵素提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

柚子、南瓜、生姜、芹菜、山藥,市售;紅參、玉竹、馬齒莧,同仁堂;枸杞,安徽藥知源中藥飲片有限公司;復(fù)合乳酸菌Novum F312(活菌數(shù)為1×1010CFU/g,包含乳雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌),山東中科嘉億生物工程有限公司;低聚果糖,河南旗諾食品配料有限公司;豬胰α-淀粉酶、鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ),Sigma公司;糖化酶,上海瑞恩生物科技有限公司;可溶性淀粉、無(wú)水乙醇、3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)(均為分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;中藥復(fù)方益糖康[紅參、黃芪、黃精、甘草、白術(shù)、丹參、枸杞子、葛根、三七、茯苓、五味子、黃連(10∶10∶13∶4∶3∶3∶3∶3∶3∶3∶3∶3)],遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。

試驗(yàn)動(dòng)物信息:SPF級(jí)雄性Wistar大鼠[體質(zhì)量(200±20) g,許可證號(hào):SCXK(遼)2020-0001],遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司。

電熱式壓力蒸汽滅菌鍋,浙江新豐醫(yī)療器械有限公司;超凈工作臺(tái),蘇州凈化醫(yī)療器械有限公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋,常州智博瑞儀器制造有限公司;數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī),上海標(biāo)本模型廠制造;UV-5100紫外分光光度計(jì),上海元析儀器有限公司;電腦控溫恒溫培養(yǎng)箱,寧波樂(lè)電儀器制造有限公司;SC-3614低速離心機(jī),安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;ACCU-CHEK血糖儀,中國(guó)羅氏制藥有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酵素發(fā)酵工藝流程

原料→粉碎→調(diào)配→均質(zhì)→滅菌→冷卻→接種→發(fā)酵→離心→成品

操作要點(diǎn):選取干燥的紅參(30 g)、玉竹(40 g)、馬齒莧(40 g)、枸杞(30 g)與新鮮的柚子(40 g)、南瓜(40 g)、生姜(30 g)、芹菜(40 g)、山藥(40 g)進(jìn)行粉碎,原料與蒸餾水按3∶10(質(zhì)量比)的比例于榨汁機(jī)中磨漿,之后12 000 r/min均質(zhì)5 min。將均質(zhì)后的樣品于115 ℃條件下滅菌30 min,冷卻至室溫后接入復(fù)合乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵,最后于4 500 r/min離心3 min,即得到復(fù)合植物酵素。由于酵素原液含量較高,試驗(yàn)測(cè)定時(shí)將其稀釋至不同含量,稀釋后酵素含量的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

1.2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

考察發(fā)酵時(shí)間(0、12、24、36、48、60 h)、發(fā)酵溫度(28、31、34、37、40 ℃)、復(fù)合乳酸菌添加量(0、0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%,質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)、低聚果糖添加量(0、2%、4%、6%、8%、10%,質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)對(duì)酵素α-淀粉酶抑制率的影響。

1.2.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,利用Design-expert 8.0.6分析軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn),優(yōu)化酵素的發(fā)酵工藝。以發(fā)酵時(shí)間(h)、發(fā)酵溫度(℃)及復(fù)合乳酸菌添加量(%)為自變量,以α-淀粉酶抑制率為響應(yīng)值,試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Response surface test factors and levels

1.2.4 α-淀粉酶抑制率的測(cè)定及IC50的測(cè)定

參照LI等[11]的方法略做修改。取28 μL 25 mL/L的酵素溶液、1 mL的PBS(pH 6.8,0.1 mol/L)、100 μL α-淀粉酶(29 U)溶液依次加入到10 mL離心管中,混合均勻,37 ℃反應(yīng)20 min后,加入5 mL 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))可溶性淀粉溶液,5 min后立刻取1 mL于試管中沸水浴,冷卻后加入1 mL蒸餾水和1.5 mL DNS溶液,沸水浴中反應(yīng)5 min,冷卻后加蒸餾水補(bǔ)至10 mL,于540 nm處測(cè)定吸光度,用PBS代替酵素作為空白組,用PBS代替α-淀粉酶作為樣品對(duì)照,用PBS代替酵素和α-淀粉酶作為空白對(duì)照。分別取12.5、16.7、20、25、33.3 mL/L的酵素28 μL,計(jì)算抑制率和IC50。抑制率的計(jì)算如公式(2)所示:

(2)

式中:A,空白吸光度;A0,空白對(duì)照吸光度;Ax,樣品吸光度;Ax0,樣品對(duì)照吸光度。

1.2.5 酵素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率及IC50的測(cè)定

試驗(yàn)參照劉雪蕊[12]的方法。取40 μL不同濃度的酵素(33.3、50、66.6、100、200 mL/L),分別與40 μL葡萄糖苷酶(0.02 U)溶液于37 ℃加熱10 min后,加入20 μL 7.5 mmol/L 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,pNPG)溶液,混合液反應(yīng)10 min后加入100 μL 0.1 mol/L NaCO3溶液終止反應(yīng),于405 nm處測(cè)定吸光度,用0.1 mol/L pH 6.8的PBS代替酵素作為空白組,用PBS代替α-葡萄糖苷酶溶液作為樣品對(duì)照。計(jì)算抑制率和IC50。抑制率的計(jì)算如公式(3)所示:

(3)

式中:A,空白吸光度;Ax,樣品吸光度;Ax0,樣品對(duì)照吸光度。

1.2.6 酵素的指標(biāo)測(cè)定

pH的測(cè)定:采用pH計(jì);總酸(以乳酸計(jì))的測(cè)定參考GB 12456—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測(cè)定》;乳酸菌的測(cè)定參考GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》;大腸菌群的測(cè)定參考GB 4789.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》;霉菌的測(cè)定參考GB 4789.15—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》;金黃色葡萄球菌的測(cè)定參考GB 4789.10—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》;沙門(mén)氏菌的測(cè)定參考GB 4789.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》。

1.2.7 糖尿病大鼠造模方法

選取SPF級(jí)健康Wistar大鼠40只,隨機(jī)設(shè)定10只大鼠作為正常組,普通飲食喂養(yǎng),其余30只大鼠連續(xù)喂養(yǎng)高脂飲食(在飼料中加入豬油、蔗糖、膽固醇、膽酸鈉等成分)。維持上述喂養(yǎng)方法2周后,禁食16 h,稱(chēng)重后,腹腔注射鏈脲佐菌素,劑量為45 mg/kg,建立2型糖尿病大鼠模型,以隨機(jī)血糖值>16.7 mmol/L作為造模標(biāo)準(zhǔn)。空白組大鼠根據(jù)體重注射同等體積的檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mmol/L)。

1.2.8 實(shí)驗(yàn)分組和給藥

造模成功后的大鼠隨機(jī)分為模型組、中藥組(中藥復(fù)方益糖康)、酵素組,每組10只。各組大鼠采用每日經(jīng)口灌胃方式給藥1次,連續(xù)8周。正常組和模型組每日10 mL/(kg·d)的生理鹽水灌胃,中藥組以每日10 mL/(kg·d)的中藥復(fù)方益糖康灌胃,酵素組以每日10 mL/(kg·d)的酵素灌胃。

1.2.9 大鼠空腹血糖測(cè)定

大鼠禁食16 h后尾尖取血,使用血糖儀測(cè)量各組大鼠的空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 2019b和Excel 2019軟件進(jìn)行作圖,Design-Expert.V 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析。使用SPSS 11.6進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸分析,P<0.05表示具有顯著性差異。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

如圖1-a所示,隨著發(fā)酵時(shí)間在0～60 h增加,酵素的α-淀粉酶抑制率逐漸增大。48 h內(nèi)的α-淀粉酶抑制率增長(zhǎng)較快,超過(guò)48 h趨于平穩(wěn);24 h內(nèi)的pH急劇下降,48 h的pH降至最低,說(shuō)明乳酸菌在發(fā)酵前24 h代謝旺盛,產(chǎn)酸速率快,到48 h時(shí)發(fā)酵基本完成。因此確定最適發(fā)酵時(shí)間為48 h。

a-發(fā)酵時(shí)間對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響;b-發(fā)酵溫度對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響;c-菌添加量對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響;d-低聚果糖添加量對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Single-factor test results注:不同小寫(xiě)字母代表差異顯著(P<0.05),相同代表差異不顯著。

如圖1-b所示,28～37 ℃內(nèi),酵素的α-淀粉酶抑制率逐漸增大,超過(guò)37 ℃呈下降趨勢(shì)。37 ℃時(shí)pH降至最低,說(shuō)明溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響乳酸菌的生長(zhǎng),導(dǎo)致發(fā)酵能力差,不利于抑制酶活性的功能性成分生成[13]。故選擇37 ℃作為最適發(fā)酵溫度。

由圖1-c可知,隨著復(fù)合乳酸菌添加量的增加,α-淀粉酶抑制率出現(xiàn)先增大后平穩(wěn)的趨勢(shì)。當(dāng)添加量大于0.1%,α-淀粉酶抑制率基本保持不變,且酵素pH值趨于平穩(wěn),說(shuō)明發(fā)酵完成。故選擇0.1%作為最適復(fù)合乳酸菌添加量。

為探究低聚果糖對(duì)酵素α-淀粉酶抑制率的影響,將發(fā)酵時(shí)間調(diào)整為30 h。由圖1-d所示,不添加低聚果糖時(shí),酵素的α-淀粉酶抑制率約為60%。為提高α-淀粉酶抑制率,繼續(xù)添加2%、4%、6%、8%、10%的低聚果糖。結(jié)果發(fā)現(xiàn),0～10%的低聚果糖對(duì)α-淀粉酶抑制率和pH均無(wú)顯著差異(P>0.05),說(shuō)明添加低聚果糖不影響酵素的發(fā)酵速度及對(duì)α-淀粉酶的抑制作用。由此說(shuō)明乳酸菌依靠原料中的碳源能夠完成發(fā)酵,并不需要額外添加。因此選擇不添加低聚果糖,且響應(yīng)面試驗(yàn)中去掉該因素。

2.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝結(jié)果見(jiàn)表2。以α-淀粉酶抑制率(Y)為響應(yīng)值,利用Design Expert.V8.0.6對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,建立發(fā)酵時(shí)間(A)、發(fā)酵溫度(B)、復(fù)合乳酸菌添加量(C)3因素的二次多項(xiàng)回歸方程為:

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Central composite design-response surface test design and results

Y=95.28+11.18A-3.46B+16.96C+4.49AB+4.21AC-8.46BC-10.55A2-20.54B2-12.27C2

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Regression model ANOVA results

2.3 酵素的質(zhì)量評(píng)價(jià)

以復(fù)合乳酸菌為菌種制備酵素,可提高發(fā)酵速度,顯著降低酵素的pH值,提高總酸含量[14]。由表4知,各項(xiàng)理化指標(biāo)均符合QB/T 5323—2018《植物酵素》的要求。酵素發(fā)酵前對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均有抑制作用,經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后抑制率顯著提高,可能是原料本身保留了營(yíng)養(yǎng)成分的同時(shí),乳酸菌發(fā)酵有利于2種酶活性抑制成分的生成。且最佳發(fā)酵工藝制備的酵素色澤良好,甘苦味適中,口感細(xì)膩無(wú)異味,質(zhì)地均勻,無(wú)致病菌檢出。

表4 酵素的指標(biāo)Table 4 Indicators of Jiaosu

2.4 酵素對(duì)α-淀粉酶與α-葡萄糖苷酶的抑制作用

如表5所示,酵素對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制呈濃度依賴(lài)性特征,計(jì)算得出酵素對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的IC50值分別為(16.54±0.40)和(46.54±6.50) mL/L,表明酵素對(duì)α-淀粉酶的抑制率達(dá)到50%所需要的濃度低于同等酶活力時(shí)α-葡萄糖苷酶抑制率達(dá)到50%所需要的濃度,即在同濃度下,酵素對(duì)α-淀粉酶的抑制強(qiáng)于α-葡萄糖苷酶。

表5 酵素對(duì)α-淀粉酶與α-葡萄糖苷酶的抑制作用Table 5 Inhibition of α-amylase and α-glucosidase by Jiaosu

2.5 酵素對(duì)大鼠空腹血糖的影響

酵素干預(yù)糖尿病大鼠的空腹血糖變化結(jié)果如表6所示,造模成功后,與正常組相比,喂食高脂飼料的3組大鼠在干預(yù)前空腹血糖值顯著升高(P<0.01)。干預(yù)2周后,與模型組相比,中藥組大鼠的FBG明顯降低(P<0.05);從第4周開(kāi)始,中藥組和酵素組的FBG顯著降低(P<0.01)。干預(yù)8周的中藥組和酵素組大鼠血糖水平分別降低了44.64%和37.12%,說(shuō)明酵素組效果接近于中藥組,能明顯改善大鼠的空腹血糖。

表6 各組大鼠空腹血糖值 單位:mmol/LTable 6 Fasting blood glucose values of rats in each group

3 討論

與化學(xué)合成物相比,天然產(chǎn)物更加經(jīng)濟(jì)、安全,利用天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)調(diào)節(jié)血糖的功能性產(chǎn)品已成為預(yù)防和治療糖尿病的新趨勢(shì)[15-17]。發(fā)酵能在改善產(chǎn)品風(fēng)味的同時(shí)提高其功能性,故發(fā)酵產(chǎn)品的研制已成為研究熱點(diǎn)。研究顯示,水果酵素對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率分別為99.57%和81.67%,酶抑制率較高,其中多酚對(duì)α-淀粉酶有抑制效果[18],但該酵素為自然發(fā)酵,發(fā)酵周期長(zhǎng),易受多種微生物影響,需要嚴(yán)格控制發(fā)酵條件以保證品質(zhì)[19];紫薯汁發(fā)酵后對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率分別為63.5%和70.9%,且發(fā)酵后提高了多糖、總酚、總酮含量[20];由乳酸菌發(fā)酵制備出富含多酚的接骨木果汁,其對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率分別為68.62%和72.39%[21]。大量研究表明,發(fā)酵可提高多糖含量[22],釋放黃酮[23]和多酚物質(zhì)[24],且植物中的黃酮、多酚、多糖等高活性物質(zhì)是天然降血糖提取物的研究熱點(diǎn)[25]。結(jié)合上述研究,推測(cè)酵素中含黃酮、多酚或多糖類(lèi)物質(zhì),并具有改善血糖的效果。

本研究酵素碳源充足,制備工藝簡(jiǎn)單,發(fā)酵周期短,微量酵素抑制酶活性效果顯著,經(jīng)發(fā)酵后對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率分別提高了4.86倍和3.41倍,且酵素濃度為33.3 mL/L可完全抑制α-淀粉酶活性。該酵素可改善糖尿病大鼠的空腹血糖,可能與其抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性有關(guān),或酵素發(fā)酵過(guò)程中提高多糖、多酚或黃酮類(lèi)物質(zhì)含量,同時(shí)產(chǎn)生的有益次級(jí)代謝產(chǎn)物起協(xié)同降糖作用。本研究?jī)H對(duì)酵素調(diào)節(jié)血糖的能力進(jìn)行初步研究,還需對(duì)活性成分進(jìn)行分離鑒定,這也為后期深入研究其調(diào)節(jié)血糖能力及其相關(guān)機(jī)制、發(fā)酵過(guò)程中代謝物的變化規(guī)律等研究提供參考。

4 結(jié)論

本研究采用單因素試驗(yàn)及星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法得出了酵素的最佳發(fā)酵工藝,最終確定發(fā)酵時(shí)間為49.5 h,發(fā)酵溫度為37 ℃,復(fù)合乳酸菌添加量為0.1%。該酵素發(fā)酵周期短,發(fā)酵工藝簡(jiǎn)便,適合工業(yè)規(guī)?；a(chǎn),應(yīng)用此模型繼續(xù)優(yōu)化酵素的其他保健功效,與改善血糖作用相結(jié)合,具有更為廣闊的研發(fā)價(jià)值和市場(chǎng)潛力,并在產(chǎn)業(yè)化中具有一定的指導(dǎo)意義,有利于滿足國(guó)內(nèi)日益增多的糖尿病患者的需求,減少患者副作用的同時(shí)降低國(guó)民生活成本。