基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討消瘤藤治療子宮肌瘤的作用機(jī)制*

胡筱希，黃建猷,2，黃周鋒，陸國壽,2，譚 曉，劉 瑛,2，黎 驪

（1.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530022；2.廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室，廣西 南寧 530022）

子宮肌瘤是婦女常見的良性腫塊，國醫(yī)大師班秀文認(rèn)為其屬中醫(yī)學(xué)“癥瘕”“帶下”范疇[1]。子宮肌瘤的發(fā)生，多因經(jīng)產(chǎn)時病邪入侵、七情過極、臟腑功能失調(diào)等原因，形成瘀血、痰飲、濕濁等有形之邪，停積胞宮，膠結(jié)不解，日積月累而逐漸形成肌瘤。治法以活血化瘀，軟堅散結(jié)，攻堅破積，祛除消塊為主[2-3]。

消瘤藤又名腫瘤藤、山枇杷等，為虎耳草科植物星毛冠蓋藤Pileostegia tomentella Hand.-Mazz.的藤莖，分布于浙江、江西、福建、湖南、廣東、廣西、貴州等地[4-6]?！吨腥A本草》[4]認(rèn)為其具有祛風(fēng)除濕、散瘀止痛、消腫解毒的功能，主治腰腿酸痛、風(fēng)濕麻木、跌打損傷、骨折、外傷出血、癰腫瘡毒。廣西金秀瑤族自治縣瑤醫(yī)醫(yī)院將其用于子宮肌瘤等多種腫瘤疾病的治療。消瘤藤用于治療子宮肌瘤，有可能是通過“散瘀、消腫”的功效發(fā)揮作用，有別于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“殺滅腫瘤”的治療思路，具有一定的特色及新穎性。但消瘤藤在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)下的“散瘀、消腫”功效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子作用機(jī)制方面的研究仍較為匱乏。本研究擬在前期消瘤藤化學(xué)成分研究[7]結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]的基礎(chǔ)上，通過HPLC-LTQ/Orbitrap-MS分析結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，對消瘤藤“散瘀、消腫”的分子機(jī)制進(jìn)行分析，對其“散瘀、消腫”功效的物質(zhì)基礎(chǔ)及分子作用機(jī)制進(jìn)行解釋，為消瘤藤這一少數(shù)民族特色藥材的開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 儀器 HPLC-LTQ/Orbitrap MS（美國熱電公司）；T500型電子天平（常數(shù)市雙杰測試儀器廠）。

1.2 材料 消瘤藤采自廣西金秀縣，由廣西中醫(yī)藥研究院副主任藥師嚴(yán)克儉鑒定為虎耳草科消瘤藤Pileostegia tomentella Hand.-Mazz的藤莖。乙腈、甲酸為色譜純，其余為分析純。

2 方 法

2.1 樣品制備 將消瘤藤藥材粉碎，過40目篩，精密稱取粉碎后樣品10 g，加入100 mL 95%乙醇回流30 min，共2次，過濾，合并濾液，回收溶劑，濾液蒸干后用無水乙醇定容于100 mL容量瓶中，得到供試液質(zhì)量濃度為100 mg/mL（以生藥計）。

2.2 LC-MS條件 XTerra C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；流動相A為0.1%甲酸+2.5 mmol/L乙酸銨水，流動相B為乙腈進(jìn)行梯度洗脫（0～15 min，90%A～70%A；15～25 min，70%A～30%A；25～30 min，30%A～20%A；30～32 min，20%A～10%A；32～37 min，10%A；37 ～37.10 min，10%A ～90%A；37.10 ～40 min，90%A）；流速：0.2 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：282 nm。ESI離子源；正離子檢測；毛細(xì)管溫度：320 ℃；脫氣溶劑溫度：350 ℃；脫氣溶劑氣流量：10 L/min；掃描范圍（m/z）：150～2 000；霧化器壓力：35 000 kpa；毛細(xì)管電壓：4 kV；錐孔電壓：100 V。

2.3 消瘤藤化學(xué)成分及疾病靶點預(yù)測 通過HPLC-LTQ/Orbitrap MS分析，得到消瘤藤的化學(xué)成分，化合物分子結(jié)構(gòu)用Chemdraw軟件繪制，以SDF文件格式保存，依次導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù) 據(jù) 庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）對靶點進(jìn)行預(yù)測，選擇排名前20位潛在的活性靶點。在GeneCards數(shù)據(jù)庫（http://www.genecards.org）、MalaCard數(shù)據(jù)庫（malacard.org）及OMIM數(shù)據(jù)庫（omom.org）檢索與“血瘀”“子宮肌瘤”相關(guān)的靶點，取交集并與化合物靶點行比對，找出重復(fù)項，整理合并得到潛在相互作用靶點。

2.4 “成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)靶點預(yù)測結(jié)果，利用String平臺（http://string-db.org/）構(gòu)建疾病-靶點蛋白相互作用關(guān)系，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件建立成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析（Networkanalyzer）。

2.5 GO富集分析 將預(yù)測靶點的Uniprot ID導(dǎo)入David 6.8（http://david.ncifcrf.gov），選擇Uniprot Accession，對消瘤藤的核心靶點可能存在的生物過程（BP）、分子功能（MF）、細(xì)胞組分（CC）進(jìn)行GO富集分析（P＜0.05），根據(jù)P值繪制柱狀圖。

2.6 KEGG通路富集分析 利用DAVID 6.8導(dǎo)入消瘤藤靶點的Uniprot ID后進(jìn)行KEGG通路富集分析，并根據(jù)富集程度和P值并使用R語言對其可視化作圖。篩選出主要信號通路導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0進(jìn)行“成分-靶點-通路”相互作用的構(gòu)建并可視化。

2.7 分子對接驗證 結(jié)合“成分-靶點-通路”分析結(jié)果，選擇節(jié)點數(shù)量多的關(guān)鍵靶點與其對應(yīng)的成分進(jìn)行分子對接，從PDB數(shù)據(jù)庫下載相應(yīng)的蛋白結(jié)構(gòu)，除去原有的復(fù)合物配體后，采用AUTODOCK軟件進(jìn)行對接，并導(dǎo)出對接結(jié)果，采用PYMOL作圖。

3 結(jié) 果

3.1 HPLC-LTQ/Orbitrap MS分析結(jié)果 消瘤藤提取物總離子流圖見圖1。查詢國內(nèi)外消瘤藤及植物化學(xué)成分研究相關(guān)文獻(xiàn)報道[10-15]，同時借助Scifinder和Pubchem數(shù)據(jù)庫，收集整理了消瘤藤中各化學(xué)成分的數(shù)據(jù)，根據(jù)一級質(zhì)譜的準(zhǔn)分子離子峰信息和二級質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)碎片信息，推測出了14個化學(xué)成分的可能結(jié)構(gòu)；通過與對照品的質(zhì)譜信息進(jìn)行比對，1、2、12號峰得到確證，分別是紫丁香苷、茵芋苷、當(dāng)藥苷。（見圖2）所有化合物信息，已鑒定和已推測的化合物保留時間、一級質(zhì)譜、二級質(zhì)譜和分子信息見表1。

圖1 消瘤藤提取物總離子流圖

圖2 紫丁香苷（A）、茵芋苷（B）、當(dāng)藥苷（C）對照品質(zhì)譜圖

表1 消瘤藤化學(xué)成分分析

3.2 消瘤藤化學(xué)成分及疾病靶點預(yù)測 通過HPLC-LTQ/Orbitrap MS分析，得到消瘤藤的化學(xué)成分14個，根據(jù)Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫靶點預(yù)測結(jié)果，選擇排名前20位潛在的活性靶點，共獲得280個基因靶點。在GeneCards、MalaCards及OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索與“血瘀”“子宮肌瘤”相關(guān)的靶點，取交集共82個。（見圖3）與化合物靶點進(jìn)行比對，找出重復(fù)項，整理合并得到潛在相互作用靶點23個，可以看出消瘤藤主要從抗炎、調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡及轉(zhuǎn)移、抗凝血等方面發(fā)揮“散瘀、消腫”治療子宮肌瘤的作用。（見表2）

圖3 疾病靶點交集韋恩圖

表2 潛在靶點預(yù)測

3.3 “成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)靶點預(yù)測結(jié)果，利用String平臺構(gòu)建疾病-靶點蛋白相互作用關(guān)系，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件建立成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析（Networkanalyzer）。該網(wǎng)絡(luò)由39個節(jié)點，45條邊組成，拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)信息包括“接近中心度值（closeness）”“中介中心度值（betweenness）”“度值（degree）”。大部分化合物作用于多個靶點，而非僅僅通過一個靶點來發(fā)揮作用，如3-羥基香豆素（3-Hydroxycoumarin）、7-羥基-8-甲氧基香豆素[7-(ethylamino)-4,6-dimethylchromen-2-one]、秦皮啶（Fraxidin）、傘形花內(nèi)酯（Umbelliferone）等，度值（degree）均為5。（見表3）

表3 “成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

3.4 GO富集分析 對消瘤藤的核心靶點可能存在的生物過程（BP）、分子功能（MF）、細(xì)胞組分（CC）進(jìn)行GO富集分析。其中P＜0.05和錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05為顯著的靶點，經(jīng)過篩選后共得出124個BP條目，29個MF條目，21個CC條目。GO分析結(jié)果表明，BP靶點主要以細(xì)胞表面受體信號通路、蛋白質(zhì)自磷酸化、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控、肽基絡(luò)氨酸磷酸化等條目為主；MF靶點主要負(fù)責(zé)蛋白磷酸酶結(jié)合、蛋白激酶活性、ATP結(jié)合、酶結(jié)合等；CC靶點主要分布于受體復(fù)合體及質(zhì)膜。可見消瘤藤發(fā)揮“散瘀、消腫”的功效可能參與了蛋白激酶活性、細(xì)胞表面受體信號通路、蛋白質(zhì)磷酸化、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄等過程。（見圖4）

圖4 GO 富集分析圖

3.5 KEGG通路富集分析[16-17]對消瘤藤的預(yù)測靶點使用DAVID 6.8進(jìn)行KEGG通路富集分析，篩選出7條主要通路，并將其可視化，繪制氣泡圖。氣泡的大小表示基因的數(shù)量，氣泡越大說明富集在該通路上基因的數(shù)目越多；氣泡的顏色代表富集的顯著性，顏色越紅則說明在該通路上富集越顯著?？梢钥闯鱿鎏倩钚猿煞譂撛谧饔冒悬c在IGF1R、EGFR等生長因子的誘導(dǎo)因素中富集，并可能通過調(diào)控蛋白多糖、黏附斑激酶、Rap1及Ras等多條信號通路發(fā)揮其治療子宮肌瘤的作用。（見表4、圖5）

圖5 KEGG 通路分析圖

表4 KEGG 信號通路富集

3.6 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)KEGG通路富集分析的結(jié)果，篩選出7條相關(guān)信號通路，同時和參與相關(guān)通路的靶點建立聯(lián)系，將“成分-靶點”作用關(guān)系整合導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0，可視化得到“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。該網(wǎng)絡(luò)由42個節(jié)點和177條邊組成，網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅玫胶诵陌悬c，Degree值排名前3位的靶點為EGFR、IGF1R、PIK3CA。（見圖6、表5）

圖6 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

表5 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)表

3.7 分子對接結(jié)果 結(jié)合“成分-靶點-通路”分析結(jié)果及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)表，選擇節(jié)點數(shù)量多的關(guān)鍵靶點（EGFR、IGF1R、PIK3CA）與其對應(yīng)的成分進(jìn)行分子對接，從PDB數(shù)據(jù)庫下載EGFR、IGF1R、PIK3CA的蛋白結(jié)構(gòu)，除去原有的復(fù)合物配體后，采用AUTODOCK軟件進(jìn)行對接，并導(dǎo)出對接結(jié)果，PYMOL作圖。3-羥基香豆素（3-Hydroxycoumarin）、松柏醇（Coniferin）、傘形花內(nèi)酯（Umbelliferone）與IGF1R、PIK3A、EGFR的蛋白結(jié)構(gòu)的作用模式主要為氫鍵及疏水作用。（見表6、圖7）

圖7 分子對接二維平面圖

表6 分子對接結(jié)果

4 討 論

消瘤藤具有散瘀、消腫等功效，本研究對其臨床上用于治療子宮肌瘤的應(yīng)用進(jìn)行現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的論證。子宮肌瘤在中醫(yī)學(xué)歸屬于“癥瘕”范疇，血瘀是“癥瘕”形成的基礎(chǔ)。《黃帝內(nèi)經(jīng)》記載的“血實宜決之”“疏其血氣，令其調(diào)達(dá)”，是中醫(yī)治療血瘀的基礎(chǔ)。中藥治療惡性腫瘤是通過改善血液流變學(xué)及血管正?；鸬绞柰ń?jīng)絡(luò)、活血止痛及消腫抑瘤的作用[18-19]?，F(xiàn)代研究[20]表明，子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展與性激素及其受體、細(xì)胞增殖與凋亡、信號傳導(dǎo)途徑異常等有關(guān)。

本研究通過HPLC-LTQ/Orbitrap-MS方法，從消瘤藤95%乙醇提取物中分析出了14種化合物，主要有苷類成分（紫丁香苷、松柏苷、茵芋苷、當(dāng)藥苷、胡蘿卜苷），香豆素類成分[傘型花內(nèi)酯、7-羥基-8-甲氧基香豆素、秦皮啶、異歐前胡素、Coumarin、3-羥基香豆素、7-(ethylamino)-4,6-dimethylchromen-2-one]，以及生物堿類成分（馬錢子堿、偽馬錢子堿）等成分?；衔锕?jié)點度值（degree）表示成分與靶點的相關(guān)個數(shù)，由“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)可知，具有較大度值（degree＞4）的活性成分有7個，即3-羥基香豆素（degree=5）、馬錢子堿（degree=5）、傘型花內(nèi)酯（degree=5）、7-(ethylamino)-4,6-dimethylchromen-2-one（degree=5）、7-羥基-8-甲氧基香豆素（degree=4）、胡蘿卜苷（degree=4）。節(jié)點度值排名靠前的主要以香豆素類為主。香豆素是一類具有苯駢α-吡喃酮結(jié)構(gòu)的化合物，可看作是順式鄰羥基桂皮酸脫水形成的內(nèi)酯，絕大多數(shù)在C-7位有羥基或烴基。近年來，香豆素類化合物在抗腫瘤藥物的研發(fā)方面展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。研究發(fā)現(xiàn)香豆素及其衍生物可抑制多種腫瘤細(xì)胞株的生長，并與多條轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)[21]。

GO生物學(xué)富集分析發(fā)現(xiàn)，消瘤藤的活性成分可影響蛋白激酶活性、細(xì)胞表面受體信號通路、蛋白質(zhì)磷酸化、RNA聚合酶Ⅱ啟動子過程。這些生物學(xué)過程很可能涉及血瘀引起的子宮肌瘤的發(fā)病原因及治療手段，同時消瘤藤可能通過改善這些生物學(xué)過程發(fā)揮其“散瘀、消腫”的作用。KEGG通路及“成分-靶點-通路”分析發(fā)現(xiàn)，消瘤藤活性成分潛在作用靶點在IGF1R、EGFR等生長因子的誘導(dǎo)因素中富集。近年來，有研究表明生長因子可以調(diào)節(jié)甾體激素在腫瘤細(xì)胞中的增殖和分化，并對雌激素誘導(dǎo)細(xì)胞的生長和分化以分泌的方式在組織局部起作用。子宮肌瘤發(fā)生的原因是生長因子的異常表達(dá)，肽類生長因子及其受體是肌瘤生長的調(diào)節(jié)因子[22]。胰島素樣生長因子1受體（insuline-like growth factors 1R，IGF1R）是小的單鏈多肽類因子，由70個氨基酸組成。動物實驗證明IGF1R可在子宮肌細(xì)胞產(chǎn)生，且通過卵巢甾體激素控制其表達(dá)。IGF1R能促進(jìn)正常子宮肌細(xì)胞和肌瘤的平滑肌細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂和分化。有研究表明，孕酮對子宮肌瘤的影響有雙重性，一方面通過降低IGF1R抑制子宮肌瘤生長，另一方面則通過增加EGFR和Bcl-2來促進(jìn)子宮平滑肌瘤生長。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）可刺激細(xì)胞增生并影響正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的分化。研究顯示子宮肌瘤細(xì)胞EGF mRNA含量高于正常平滑肌，從而使離體子宮肌瘤細(xì)胞迅速生長[23]。上述消瘤藤“成分-靶點-通路”的網(wǎng)絡(luò)信息及相關(guān)文獻(xiàn)顯示，消瘤藤可能通過調(diào)控蛋白多糖、黏附斑激酶、Rap1及Ras等多條信號通路發(fā)揮治療子宮肌瘤的作用。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與蛋白多糖的過度激活密切相關(guān)[24]。蛋白多糖（Proteoglycans，PGs）是一種含有長而不分硫支共價結(jié)合重復(fù)二糖長鏈的糖蛋白，在細(xì)胞中和細(xì)胞外基質(zhì)中含量豐富。近年來，蛋白多糖對生長因子信號的調(diào)控使glypican（及其他多聚糖）成為癌癥治療中極具吸引力的研究對象[25]，PGs通常在腫瘤血管生成中表現(xiàn)出促進(jìn)或抑制腫瘤血管生成作用。

綜上所述，經(jīng)HPLC-LTQ/Orbitrap-MS法及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，瑤藥消瘤藤共有14個不同的活性成分通過對不同的靶點協(xié)同作用，起到“散瘀、消腫”的作用。研究結(jié)果對瑤藥消瘤藤多成分、多靶點、協(xié)同作用的特點進(jìn)行了一定程度上的解釋，體現(xiàn)出其通過整體性、系統(tǒng)性來發(fā)揮治療腫瘤作用的特點。本研究發(fā)現(xiàn)，消瘤藤可能從以下3個方面發(fā)揮“散瘀、消腫”作用治療子宮肌瘤：（1）從消瘤藤“散瘀、消腫”的功能主治上探討，其可通過改善血液流變學(xué)及血管正常化起到疏通經(jīng)絡(luò)、活血止痛、消腫抑瘤的作用。（2）通過調(diào)控IGF1R、EGFR等生長因子從而調(diào)節(jié)甾體激素在子宮肌瘤細(xì)胞中的增殖和分化。（3）通過調(diào)控蛋白多糖、黏附斑激酶、Rap1及Ras等多條信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用。預(yù)測所得消瘤藤成分疾病靶點與已有文獻(xiàn)較為接近，表明基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接相結(jié)合的技術(shù)手段探討其“散瘀、消腫”治療子宮肌瘤的作用機(jī)制具有一定的準(zhǔn)確性，同時也揭示了消瘤藤多成分、多靶點的特點，可為后續(xù)的相關(guān)研究提供參考。