MiR-301a-5p 調(diào)節(jié)繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥中甲狀旁腺激素的分泌：基于調(diào)控鈣敏感受體的表達(dá)

柳麗丹，錢立元，李珮婷，李俊，黃珊，易文君，柳雙喜，吳唯

1中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院乳甲外科，湖南 長(zhǎng)沙 410013；2中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院乳甲外科，湖南 長(zhǎng)沙410013

繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥（SHPT）是由于各種原因所致的低鈣血癥刺激甲狀旁腺，使之代償性分泌過多的甲狀旁腺激素（PTH），常繼發(fā)于慢性腎臟疾?。?］。慢性腎臟疾病引起的SHPT與腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良、骨外鈣化、骨礦化受損和心血管疾病有關(guān)，SHPT逐漸進(jìn)展引起的礦物質(zhì)代謝紊亂和心腦血管系統(tǒng)紊亂均是慢性腎臟疾病患者死亡的主要原因［2］。SHPT的特征是PTH分泌增加和甲狀旁腺增生，導(dǎo)致骨和礦物質(zhì)代謝紊亂，且甲狀旁腺增生導(dǎo)致維生素D受體和鈣敏感受體（CaSR）的表達(dá)減少，PTH分泌增加［3,4］。SHPT發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，既往研究認(rèn)為其與高磷血癥、CaSR、維生素D受體、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23、PTH 受體表達(dá)下調(diào)、靶器官對(duì)PTH 反應(yīng)性降低、PTH 代謝紊亂、碎片化微小RNA（miRNA）的改變等相關(guān)［5］，但尚不完全明確。CaSR的低表達(dá)在其中起著重要作用，據(jù)此機(jī)制而使用的擬鈣劑藥物也廣泛用于臨床；但對(duì)于晚期的SHPT患者，藥物的治療效果甚微，此時(shí)大部分患者仍需手術(shù)治療。由于手術(shù)本身存在風(fēng)險(xiǎn)及部分患者不能耐受手術(shù)等因素，導(dǎo)致SHPT患者的生存與生活質(zhì)量嚴(yán)重受損，研究SHPT中CaSR低表達(dá)的相關(guān)機(jī)制以探尋進(jìn)一步的治療手段刻不容緩。

CaSR是一種位于甲狀旁腺主細(xì)胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體，在生理狀況下與調(diào)節(jié)機(jī)體血清鈣濃度及PTH的分泌有關(guān)［6］；在SHPT中，CaSR也與PTH的異常分泌有關(guān)［7］。既往認(rèn)為其低表達(dá)與高磷狀態(tài)、Klotho蛋白和甲狀旁腺增生有關(guān)［8］，但目前尚無針對(duì)調(diào)控SHPT 中CaSR的miRNA相關(guān)研究。MiRNAs具有調(diào)節(jié)激素合成、激素釋放和內(nèi)分泌細(xì)胞增殖等的功能，與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系［9-11］。本研究旨在探索miRNA對(duì)CaSR的相對(duì)調(diào)控作用及其對(duì)PTH的分泌是否存在影響，以期為進(jìn)一步研究SHPT的發(fā)病機(jī)制和診治等提供新的參考。

1 材料和方法

1.1 材料

RIPA裂解液（Abiowell），蛋白酶抑制劑（北京金泰宏達(dá)），蛋白磷酸酶抑制劑（Abiowell），顯影液（上海佳信），定影液（上海佳信），1640培養(yǎng)基（Sigma），胎牛血清（GIBICO），青-鏈霉素（碧云天），I型膠原酶（索萊寶），Lipo3000（thermofisher），trziol 試劑（invitrogen）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（中國(guó)勤翔），超凈工作臺(tái)（北京亞泰），低速離心機(jī)（知信儀器），直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱（上海三藤儀器），倒置顯微鏡（北京中顯恒業(yè)）；mRNA 及miRNA 引物，miRNA mimics 及miRNA inhibitor，mRNA及miRNA qRT-PCR Starter Kit試劑盒（廣州銳博生物有限公司）；雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（Abiowell），293T細(xì)胞（上海中喬新舟生物科技公司）；SHPT的組織標(biāo)本來源于接受外科手術(shù)治療的尿毒癥繼發(fā)SHPT患者的術(shù)后標(biāo)本，正常的甲狀旁腺標(biāo)本來源于甲狀腺癌患者行甲狀腺癌根治手術(shù)時(shí)，術(shù)者不慎將甲狀旁腺切除的標(biāo)本，標(biāo)本均來源于中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院乳甲外科，實(shí)驗(yàn)所需用到甲狀旁腺標(biāo)本的收集已通過中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 目標(biāo)miRNA的初步篩選

本課題組已對(duì)6個(gè)正常甲狀旁腺組織標(biāo)本和11個(gè)SHPT甲狀旁腺組織標(biāo)本進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序，得到52個(gè)在SHPT中高表達(dá)的miRNAs［12］。同時(shí)通過targetscan網(wǎng)站（https://www.targetscan.org/vert_80/）和miRDB 網(wǎng)站（mirdb.org）對(duì)可能調(diào)控CaSR 基因的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，將上述3種方法得到的結(jié)果作韋恩圖取交集可得到三者共有的7個(gè)miRNAs，對(duì)初步篩選出的7個(gè)miRNAs進(jìn)行下一步的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)。

1.3 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

采用24孔板培養(yǎng)8組293T細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（含有人CASR 基因3'UTR 端部分序列，命名為psiCHECK-2-CASR-3U）及各個(gè)miRNA mimic或?qū)φ眨∟C），具體分組如下：（1）psiCHECK-2-CASR-3U+miRNA NC組；（2）psiCHECK-2-CASR-3U+miR-15a-5p mimics 組；（3）psiCHECK-2-CASR-3U+miR-15b-5p mimics組；（4）psiCHECK-2-CASR-3U+miR-16-5p mimics 組；（5）psiCHECK-2-CASR-3U+miR-221-3p mimics 組；（6）psiCHECK-2-CASR-3U+miR-222-3p mimics 組；（7）psiCHECK-2-CASR-3U+miR-301a-5p mimics 組；（8）psiCHECK-2-CASR-3U+miR-503-5p mimics組。每組做3個(gè)復(fù)孔，共24孔。轉(zhuǎn)染72 h后，使用試劑盒（Vazyme Biotech Co.,Ltd.）對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行裂解，并檢測(cè)相應(yīng)的熒光強(qiáng)度。通過上述實(shí)驗(yàn)選定了miR-301a-5p為進(jìn)一步的研究對(duì)象，并構(gòu)建了人CASR基因3'UTR 雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（突變型），命名為psiCHECK-2-CASR-3U-Mut（以下簡(jiǎn)稱Mut）。Mut針對(duì)預(yù)測(cè)的miR-301a-5p結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)突變。再次使用24孔板培養(yǎng)兩組293T細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染Mut及miR-301a-5p mimics或miRNA NC，具體分組如下：（1）Mut+NC組：共轉(zhuǎn)染psiCHECK-2-CASR-3U-Mut大提質(zhì)粒、miRNA NC的293T細(xì)胞（2）Mut+miR-301a-5p mimics組：共轉(zhuǎn)染psiCHECK-2-CASR-3U-Mut大提質(zhì)粒、miR-301a-5p mimics的293T細(xì)胞。再次用上述方法檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.4 qRT-PCR

采用trziol 提取甲狀旁腺組織RNA 之后，檢測(cè)CaSR mRNA及miR-301a-5p在SHPT和正常甲狀旁腺組織中的表達(dá)水平，采用染料法（SYBR Green I）通過LightCycler-4800II PCR 儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 分析，mRNA的內(nèi)參選用GAPDH，miRNA的內(nèi)參選用U6，實(shí)驗(yàn)所用引物由廣州銳博生物公司所設(shè)計(jì)并且合成。

1.5 SHPT甲狀旁腺原代細(xì)胞的提取、培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

手術(shù)切除的SHPT甲狀旁腺標(biāo)本浸泡于約4 ℃含有鏈霉素及青霉素（以下簡(jiǎn)稱雙抗）的1640培養(yǎng)液中，在PBS中清洗組織塊，去掉血塊、脂肪和包膜，只留下腺體組織；在PBS中剪碎組織至1 mm3大小，將組織轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，加入膠原酶消化液；37 ℃搖床80 r/min消化1 h；過200目細(xì)胞濾網(wǎng)，收集濾液；1000 r/min離心5 min，棄上清，加10 mL PBS洗滌，1000 r/min離心5 min，棄上清；加入2 mL 紅細(xì)胞裂解液，室溫裂解5 min，再加8 mL PBS，混勻，1000 r/min離心5 min，棄上清，加10 mL PBS洗滌，1000 r/min離心5 min，棄上清；加1 mL完全培養(yǎng)基重懸，混勻，取10 μL計(jì)數(shù)，每孔接種5×105/孔細(xì)胞，接種體積2 mL；細(xì)胞于含10%FBS+1%雙抗的1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d后首次換液，以后每2～3 d換液1次。細(xì)胞培養(yǎng)至5 d時(shí)，細(xì)胞體積變大，細(xì)胞未見明顯增多。此時(shí)取細(xì)胞進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染，共分為4組，分別為：miR-301a-5p-mimics 組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-301a-5pmimics；mimics-NC 組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimics-NC 組；miR-301a-5p-inhibitor 組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-301a-5pinhibitor；inhibitor-NC組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染inhibitor-NC。操作完成后，將細(xì)胞置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，換新鮮完全培養(yǎng)液。再繼續(xù)轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞樣品進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 Western blotting

收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用蛋白裂解液在冰上裂解細(xì)胞。加入樣本進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，再加入一抗過夜。第2天TBST洗滌3次后，加入二抗常溫孵育1.5 h。TBST清洗后，加入顯影液拍照。

1.7 細(xì)胞上清液PTH濃度的檢測(cè)

取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞上清液在中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科進(jìn)行PTH分泌情況檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 8軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-15a-5p、miR-15b-5p、miR-16-5p、miR-221-3p、miR-222-3p、miR-301a-5p和miR-503-5p與CaSR基因均有靶向作用關(guān)系

因miRNA通常與靶基因呈負(fù)調(diào)控關(guān)系，當(dāng)靶基因表達(dá)下調(diào)時(shí)，其miRNA多為上調(diào)，CaSR基因在SHPT中表達(dá)下調(diào)，故選擇測(cè)序結(jié)果中上調(diào)的52個(gè)miRNAs作為下一步的研究對(duì)象。同時(shí)，結(jié)合生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)的可能靶向CaSR的miRNAs，三者作韋恩圖取交集（圖1），初步篩選出了可能靶向調(diào)控CaSR基因的7個(gè)miRNAs，分別是miR-15a-5p、miR-15b-5p、miR-16-5p、miR-221-3p、miR-222-3p、miR-301a-5p和miR-503-5p。

圖1 韋恩圖結(jié)果Fig. 1 Result of Venn diagram.

構(gòu)建一個(gè)插入了人CaSR 基因（NM_001178065）3'UTR 端部分序列的報(bào)告質(zhì)粒，命名為psiCHECK-2-CASR-3U，該段序列包含了上述7個(gè)miRNAs可能與之結(jié)合的位點(diǎn)（圖2）。將各個(gè)miRNA mimic或mimic NC分別和質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，進(jìn)行雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各個(gè)mimics與靶基因均有不同程度的結(jié)合，7個(gè)miRNAs都與CaSR基因有靶向關(guān)系，但miR-301a-5p 與CaSR 基因之間的靶向關(guān)系最強(qiáng)（圖3）。因此，選擇miR-301a-5p進(jìn)行下一步的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

圖2 雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒psiCHECK-2-CASR-3UFig. 2 Structure of the dual-luciferase plasmid psiCHECK-2-CASR-3U.

圖3 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 3 Dual-luciferase experiment results.

2.2 將CaSR基因3'UTR區(qū)中預(yù)測(cè)的miR-301a-5p結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變后miR-301a-5p mimics與CaSR基因的靶向關(guān)系

在之前構(gòu)建的質(zhì)?；A(chǔ)上，又構(gòu)建了一個(gè)人CaSR基因3'UTR 雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（突變型），命名為psiCHECK-2-CASR-3U-Mut（簡(jiǎn)稱Mut），Mut針對(duì)預(yù)測(cè)的miR-301a-5p結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)突變。將該突變質(zhì)粒分別和miR-301a-5p mimic、mimic NC 轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中再次進(jìn)行雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，將CaSR基因3'UTR區(qū)中預(yù)測(cè)的miR-301a-5p結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變后，miR-301a-5p mimics與CaSR基因沒有了靶向關(guān)系。反之，也進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-301a-5p與CaSR基因有靶向關(guān)系（圖4）。

圖4 轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒后的雙熒光素酶結(jié)果Fig. 4 Dual-luciferase results after transfection with the mutant plasmids.

2.3 MiR-301a-5p 與CaSR mRNA 在SHPT 中的表達(dá)情況

選取11例手術(shù)切除的SHPT標(biāo)本與3例正常甲狀旁腺標(biāo)本分別進(jìn)行RNA 提取，然后進(jìn)行qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與測(cè)序的結(jié)果一致，同正常甲狀旁腺組織相比，miR-301a-5p在SHPT中的表達(dá)量更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.747，P=0.018，圖5）。另外，還選取了10例手術(shù)切除的SHPT標(biāo)本與6例正常甲狀旁腺組織標(biāo)本再次提取RNA進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證CaSR mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示CaSR基因的表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.148，P=0.007，圖6）。另外，miR-301a-5p 和CaSR mRNA與血清PTH水平分別呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)關(guān)系，但結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖7、8）。

圖5 MiR-301a-5p在正常甲狀旁腺與SHPT中的相對(duì)表達(dá)量比較Fig. 5 Comparison of the relative expression of miR-301a-5p in normal parathyroid gland and SHPT.*P＜0.05.

圖6 CaSR mRNA在正常甲狀旁腺與SHPT中的相對(duì)表達(dá)量比較Fig. 6 Comparison of relative expression of CaSR mRNA in normal parathyroid gland and SHPT.**P＜0.01.

圖7 MiR-301a-5p與PTH水平的相關(guān)性Fig. 7 Correlation between miR-301a-5p and PTH levels.

圖8 CaSR mRNA與PTH水平的相關(guān)性Fig. 8 Correlation between CaSR mRNAand PTH levels.

2.4 SHPT原代細(xì)胞中miR-301a-5p對(duì)CaSR基因表達(dá)的調(diào)控作用

培養(yǎng)SHPT甲狀旁腺原代細(xì)胞，按如下分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染：（1）組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-301a-5p mimics；（2）組：細(xì)胞轉(zhuǎn) 染mimics NC；（3）組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-301a-5p inhibitor；（4）組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染inhibitor NC。將4組的細(xì)胞繼續(xù)置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后換新鮮完全培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染48 h后，留取細(xì)胞上清液測(cè)定PTH 濃度，收集細(xì)胞樣品進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖9～11）。用Image J軟件測(cè)得其各組灰度值，其相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1、2）。

表1 MiR-301a-5p-mimic組和mimic NC組3次Western blot實(shí)驗(yàn)的相對(duì)表達(dá)量Tab.1 Relative expression of 3 Western blotting experiments in miR-301a-5p-mimic group and mimic NC group

表2 MiR-301a-5p inhibitor組和inhibitor NC組3次Western blot實(shí)驗(yàn)的相對(duì)表達(dá)量Tab.2 Relative expression of CaSR in 3 Western blot experiments in the miR-301a-5p inhibitor group and inhibitor NC group

圖9 第1次實(shí)驗(yàn)各組CaSR的表達(dá)量Fig. 9 Expression of CaSR in each group in the first experiment.

圖10 第2次實(shí)驗(yàn)各組CaSR的表達(dá)量Fig. 10 Expression of CaSR in each group in the second experiment.

圖11 第3次實(shí)驗(yàn)各組CaSR的表達(dá)量Fig. 11 Expression of CaSR in each group in the third experiment.

2.5 拮抗miR-301a-5p促進(jìn)SHPT甲狀旁腺原代細(xì)胞PTH的分泌

取上述轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)完成后的上清液，測(cè)其PTH的濃度進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示，當(dāng)miR-301a-5p過表達(dá)時(shí)，其PTH的分泌未受明顯影響（P＞0.05），而miR-301a-5p的表達(dá)被抑制時(shí)，其PTH的分泌升高（P＜0.001，表3、4）。

表3 MiR-301a-5p-mimic組和mimic NC組3次實(shí)驗(yàn)細(xì)胞上清液的PTH濃度Tab.3 PTH concentration in cell supernatants in miR-301a-5p-mimic and mimic NC in 3 experiments(pg/mL)

表4 MiR-301a-5p inhibitor組和inhibitor NC組3次實(shí)驗(yàn)細(xì)胞上清液的PTH濃度Tab.4 PTH concentration of supernatant of three experimental cells in the miR-301a-5p inhibitor group and inhibitor NC group(pg/mL)

3 討論

3.1 MiR-301a-5p與CaSR基因存在靶向作用關(guān)系

本研究測(cè)序和實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNAs在SHPT中表達(dá)異常，這提示了miRNA與此種疾病的相關(guān)性。在既往的實(shí)驗(yàn)性SHPT中，甲狀旁腺特異性dicer酶被敲除后的小鼠在應(yīng)對(duì)低鈣血癥和尿毒癥時(shí)都不能增加血清PTH的水平，這表明完整的dicer酶和miRNAs對(duì)于低鈣血癥和患尿毒癥時(shí)PTH的分泌至關(guān)重要［13-14］，這與本研究結(jié)果一致，miRNAs很可能參與了SHPT的發(fā)病機(jī)制。CaSR是G蛋白偶聯(lián)受體家族的成員，具有很多高度特異的鈣結(jié)合位點(diǎn)，生理狀態(tài)下當(dāng)血清Ca2+濃度升高時(shí)，Ca2+與CaSR的胞外特異結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+［15］。隨后細(xì)胞膜上的Ca2+通道激活，細(xì)胞外的Ca2+內(nèi)流，胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高，抑制細(xì)胞釋放PTH，并促進(jìn)其降解，從而使血漿PTH濃度下降［16］。反之，當(dāng)細(xì)胞外Ca2+濃度降低時(shí)，CaSR表達(dá)減少，胞內(nèi)Ca2+流出，使得PTH的抑制作用減弱，引起血清PTH濃度升高［17］。在SHPT中，CaSR蛋白的表達(dá)減少，導(dǎo)致甲狀旁腺對(duì)Ca2+的調(diào)節(jié)出現(xiàn)抵抗，Ca2+的濃度變化對(duì)PTH的產(chǎn)生和分泌幾乎沒有影響［18］，隨著疾病進(jìn)展，PTH的分泌逐漸失調(diào)。本研究也發(fā)現(xiàn)CaSR mRNA在SHPT中的表達(dá)量較正常甲狀旁腺組織減少，并且其在SHPT中的表達(dá)量與患者血清PTH水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本量較少有關(guān)。CaSR下調(diào)的機(jī)制可能與SHPT中miR-15a-5p、miR-15b-5p、miR-16-5p、miR-221-3p、miR-222-3p、miR-301a-5p 和miR-503-5p 的高表達(dá)有關(guān)，因其各個(gè)miRNA mimics與雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（含有人CaSR基因3'UTR端部分序列）共轉(zhuǎn)染后，其熒光素酶的活性都受到了不同程度的抑制。這表明7個(gè)miRNAs均和CaSR基因具有靶向作用關(guān)系，但其中靶向作用關(guān)系最強(qiáng)的是miR-301a-5p，提示miR-301a-5p可能與CaSR mRNA的3'UTR中的部分序列發(fā)生了最密切的結(jié)合。MiR-301a-5p mimics與突變型質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)也再次對(duì)此進(jìn)行了反向論證，當(dāng)預(yù)測(cè)的miR-301a-5p結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變后，熒光素酶的活性與對(duì)照組相比幾乎無異，說明兩者幾乎沒有結(jié)合，因此我們認(rèn)為miR-301a-5p對(duì)CaSR基因存在靶向調(diào)控關(guān)系。本研究也發(fā)現(xiàn)與正常甲狀旁腺組織相比，miR-301a-5p在SHPT甲狀旁腺組織中表達(dá)量增加。但由于甲狀旁腺組織標(biāo)本較小，提取到的RNA也較少，未能對(duì)同一組標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行CaSR mRNA和miR-301a-5p的qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，故未對(duì)兩者進(jìn)行相關(guān)性的分析。但基于雙熒光素酶的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們猜想這兩者之間可能存在某種潛在關(guān)系。MiR-301a-5p或可能與CaSR mRNA的3'UTR中部分序列結(jié)合，使其轉(zhuǎn)錄本不穩(wěn)定，促進(jìn)其mRNA的降解，從而使得其表達(dá)量較少。

3.2 MiR-301a-5p下調(diào)CaSR基因的表達(dá)

SHPT原代細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明miR-301a-5p對(duì)CaSR的表達(dá)具有負(fù)向調(diào)控作用。當(dāng)miR-301a-5p過表達(dá)時(shí)，SHPT原代細(xì)胞的CaSR蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯減少，反之當(dāng)miR-301a-5p的表達(dá)被抑制時(shí)，CaSR蛋白的表達(dá)則明顯增高。MiRNA是一種干預(yù)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的短的非編碼RNA，和miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物一起與靶mRNA的3'UTR中部分序列結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄本不穩(wěn)定，促進(jìn)其降解或抑制其翻譯［19-21］。因原代細(xì)胞的數(shù)量較少，本研究未能驗(yàn)證轉(zhuǎn)染之后細(xì)胞中mRNA的變化，但基于上述機(jī)制，miR-301a-5p有可能直接靶向CaSR mRNA促進(jìn)其降解，使得其轉(zhuǎn)錄減少，也有可能通過其他的RNA結(jié)合蛋白來調(diào)節(jié)亞細(xì)胞定位和抑制翻譯，從而降低目的蛋白的表達(dá)量［22］，或者兩種機(jī)制同時(shí)發(fā)生，使得CaSR蛋白的表達(dá)減少。

3.3 MiR-301a-5p影響PTH的分泌

盡管在SHPT組織中我們發(fā)現(xiàn)miR-301a-5p的表達(dá)量與患者血清PTH水平呈現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系，但細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻與此不一致。MiR-301a-5p雖影響了SHPT甲狀旁腺原代細(xì)胞PTH 的分泌，但未呈現(xiàn)出預(yù)計(jì)變化。有研究發(fā)現(xiàn)抑制豐富的let-7 miRNAs家族增加了正常和尿毒癥大鼠以及小鼠甲狀旁腺器官培養(yǎng)的PTH的分泌，抑制miR-148家族可以阻止甲狀旁腺器官培養(yǎng)中分泌的PTH水平的降低［18］。本研究也發(fā)現(xiàn)抑制miR-301a-5p的表達(dá)后，SHPT原代細(xì)胞PTH水平升高，表明miR-301a-5p 在一定程度上調(diào)控了PTH 的生成或分泌。MiR-301a-5p曾被證明作為致癌基因，在胃癌中表達(dá)上調(diào)，并與其進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān)［23］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-301a-5p 能夠下調(diào)肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而激活STAT3和NF-κB信號(hào)通路，最終促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)［24］；而Mao等［25］發(fā)現(xiàn)局部NF-κB激活能夠促進(jìn)尿毒癥患者PTH的合成和分泌，在SHPT中，miR-301a-5p被抑制后是否通過影響NF-κB信號(hào)通路進(jìn)而干擾PTH的分泌，仍有待進(jìn)一步考證。另外，當(dāng)miR-301a-5p過表達(dá)后，PTH的分泌未受到明顯影響，這提示CaSR的表達(dá)和PTH的分泌可能還受到了其他因素的調(diào)控。有研究認(rèn)為，CaSR 的表達(dá)減少可能與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞缺失因子2（GCM2）在甲狀旁腺細(xì)胞中的特異性表達(dá)有關(guān)［26］。GCM2可以直接作用于CaSR基因的上游啟動(dòng)子，促進(jìn)CaSR的表達(dá)［27］。在成人體內(nèi)，GCM2還可與其他轉(zhuǎn)錄因子一起作用于PTH上游的順式作用原件，促進(jìn)PTH基因的轉(zhuǎn)錄［28］。同時(shí)，miRNA的調(diào)控作用也并非是單一的調(diào)控，一個(gè)miRNA可能調(diào)控多個(gè)靶基因，一個(gè)基因也可以同時(shí)受到多個(gè)miRNAs 的調(diào)控，miR-301a-5p是否也可能影響了GCM2的表達(dá)，從而影響了PTH 的分泌。此外，有研究表明維生素D 受體也是miR-301a-5p的靶基因［29］，在實(shí)驗(yàn)過程中，miR-301a-5p是否也通過調(diào)控維生素D受體進(jìn)而影響PTH的分泌，值得深思。SHPT的發(fā)病是一個(gè)多因素共同作用的過程，PTH的分泌也受到多種因素的調(diào)節(jié)，這些復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能同時(shí)發(fā)生，影響著最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。雖然未能完全闡明miR-301a-5p與CaSR水平、PTH分泌之間的關(guān)系，但本研究的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探究miR-301a-5p在SHPT中的作用機(jī)制提供了新的思路。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miRNA與SHPT關(guān)系密切，且首次探討了SHPT中miR-301a-5p與CaSR之間的負(fù)向調(diào)控關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其可能與PTH的異常分泌有關(guān)。這些結(jié)果為后續(xù)研究SHPT 關(guān)于miRNA層面的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)，或?yàn)閷戆l(fā)現(xiàn)新的診治方法提供思路。