二甲雙胍通過抑制線粒體氧化磷酸化降低結(jié)直腸癌干細(xì)胞的自我更新能力

顏 暢，劉爽，宋慶志，胡藝冰

北京大學(xué)深圳醫(yī)院1胃腸外科，2乳甲外科，廣東 深圳518036

結(jié)直腸癌是我國發(fā)病率第2位、死亡率第4位的惡性腫瘤［1］。癌干細(xì)胞（CSCs）是結(jié)直腸癌中主導(dǎo)化療耐藥、轉(zhuǎn)移和治療后復(fù)發(fā)的細(xì)胞亞群［2］。針對結(jié)直腸CSCs的治療對提高結(jié)直腸癌的預(yù)后尤為重要［3］。

目前鑒別和分選CSCs主要依賴其細(xì)胞膜表達(dá)的CD133、CD44、Lgr5等分子標(biāo)志物［4］。但是，由于缺乏統(tǒng)一的標(biāo)志物，且此類標(biāo)志物的功能和機(jī)制尚并不完全清楚，靶向CSCs標(biāo)志物的臨床應(yīng)用仍相對受限［5］。準(zhǔn)確的來講，CSCs區(qū)別于癌分化細(xì)胞的主要特征是其具備更強(qiáng)的自我更新能力、分化潛能、成瘤能力等生物學(xué)功能，而不是簡單表達(dá)某種標(biāo)志物［2-6］。我們前期的研究表明，結(jié)直腸CSCs除了具備更強(qiáng)的自我更新能力和體內(nèi)成瘤能力，還具有更高的線粒體氧化磷酸化和活性氧（ROS）水平［7,8］。因此，靶向抑制結(jié)直腸CSCs線粒體代謝或ROS是潛在的治療手段。

糖尿病和結(jié)直腸癌的發(fā)生和預(yù)后存在復(fù)雜的關(guān)系［9］。較多研究顯示，糖尿病患者有更高的結(jié)直腸癌發(fā)生率和癌癥特異性死亡率［10］。二甲雙胍是世界上廣泛應(yīng)用的治療II型糖尿病的藥物。研究表明，二甲雙胍能顯著降低糖尿病人群中結(jié)直腸癌的發(fā)生率，并顯著提升結(jié)直腸癌病人的預(yù)后［9,11］。盡管有研究顯示二甲雙胍可以調(diào)控腫瘤的葡萄糖及線粒體代謝，抑制結(jié)直腸癌［12,13］。其具體機(jī)制仍不清楚。二甲雙胍能否通過抑制結(jié)直腸CSCs的線粒體代謝，從而促進(jìn)其分化尚缺乏研究。本研究擬用二甲雙胍與原代結(jié)直腸癌來源的類器官中的CSCs體內(nèi)和體外共培養(yǎng)，觀察其促進(jìn)結(jié)直腸CSCs分化的作用，并進(jìn)一步探討其機(jī)制，為靶向結(jié)直腸CSCs的治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和動物

已轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt 報告基因慢病毒（TOP-GFP）的結(jié)直腸癌病人來源的類器官（PDOs）來源于本課題組已建立的結(jié)直腸癌PDOs活樣本庫，樣本獲取及研究已充分經(jīng)過知情同意，并獲得倫理委員會許可（IRB ID:20141106）［7,8］。SPF級非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠（NOD/SCID，北京華阜康公司）。所有實驗程序均經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)，并參照《實驗動物護(hù)理和使用指南》執(zhí)行（IACUC ID:2014S652）。

1.2 試劑

DMEM/F12培養(yǎng)液、B27、MitoSOX紅色熒光探針試劑盒（Invitrogen）；人表皮生長因子、胃泌素、基礎(chǔ)成纖維細(xì)胞生長因子、二甲雙胍、半乳糖、N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，Sigma）；Trizol 裂解液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）；實時熒光定量PCR試劑盒（Thermo）；基質(zhì)膠、FACS Aria II流式細(xì)胞儀（BD Bioscience）；四甲基羅丹明乙酯（tetramethyrhodamine,ethyl ester,TMRE）試劑盒（Abcam）。

1.3 方法

1.3.1 類器官培養(yǎng) 收集活樣本庫中結(jié)直腸癌PDOs，加入0.025%胰蛋白酶溶液在37 ℃下孵育15～20 min，消化為單細(xì)胞后包埋至基質(zhì)膠（去生長因子、無酚紅）并接種至超低吸附培養(yǎng)皿。待基質(zhì)膠聚合后，加入類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并置入37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d更換一次類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基［8］。類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基為添加人表皮生長因子（50 ng/mL）、胃泌素（10 nmol/L）、1×B27和A83-01（500 nmol/L）的DMEM/F12培養(yǎng)基［8］。

1.3.2 流式細(xì)胞分選癌干細(xì)胞 收集已轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt報告基因慢病毒（TOP-GFP）的結(jié)直腸癌PDOs，并制備為單細(xì)胞懸液（1×107/mL）。使用流式細(xì)胞儀根據(jù)GFP的熒光強(qiáng)度，分選出表達(dá)最強(qiáng)的5%～10%細(xì)胞為GFP+細(xì)胞（高表達(dá)Wnt，即Wnt+細(xì)胞，富集癌干細(xì)胞）和表達(dá)最弱的5%～10%細(xì)胞為GFP-細(xì)胞（不表達(dá)Wnt，即Wnt-細(xì)胞，富集癌分化細(xì)胞）［7,8］。

1.3.3 細(xì)胞球體形成實驗 細(xì)胞接種在超低吸附6 孔板內(nèi)（1000/孔），在干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入藥物（5、10、20、30 μmol/L 二甲雙胍、10 mmol/L 半乳糖、5 mmol/L NAC）或等體積的干細(xì)胞培養(yǎng)基作為空白對照，置入37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d補0.5 mL干細(xì)胞培養(yǎng)基及藥物，9 d 后觀察細(xì)胞球體的形態(tài)及數(shù)量［8］。干細(xì)胞培養(yǎng)基為添加人表皮生長因子（10 ng/mL）、1×B27 和基礎(chǔ)成纖維細(xì)胞生長因子（10 ng/mL）的DMEM/F12培養(yǎng)基［8］。

1.3.4 克隆形成實驗 將細(xì)胞接種在6孔板（1000/孔），貼壁后加入10 μmol/L二甲雙胍或等體積的干細(xì)胞培養(yǎng)基，置入37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d補0.5 mL干培養(yǎng)基及藥物，9 d后去除培養(yǎng)基，以4%多聚甲醛常溫固定30 min后，用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，光學(xué)顯微鏡觀測克隆的數(shù)目及大小［14］。

1.3.5 體內(nèi)有限稀釋實驗 用基質(zhì)膠包被細(xì)胞后按濃度梯度皮下注射至NOD/SCID小鼠背部（100 μL/側(cè)），每5 d經(jīng)腹腔內(nèi)注射二甲雙胍（100 mg/kg body weight）或?qū)φ眨?5］，每3 d監(jiān)測腫瘤的起始及大小。待腫瘤生長至一定體積后，處死小鼠，收獲腫瘤，計數(shù)成瘤率和稱量腫瘤質(zhì)量。根據(jù)網(wǎng)站ELDA:Extreme Limiting Dilution Analysis（http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html）提供的分析工具計算各組細(xì)胞中可成瘤細(xì)胞頻率，并計算統(tǒng)計學(xué)差異［16］。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞Wnt表達(dá)率和活性 接種純化的Wnt+細(xì)胞在超低吸附6孔板內(nèi)，在干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入對應(yīng)濃度的藥物或?qū)φ?，置?7 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d后收集細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的GFP表達(dá)率，并檢測GFP+細(xì)胞中GFP的平均熒光強(qiáng)度［8］。

1.3.7 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）使用Trizol裂解液提取細(xì)胞總RNA，加入適量無酶無菌水調(diào)節(jié)RNA濃度至500 ng/μL；參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA；采用SYGR熒光染料摻入法檢測目的基因表達(dá)。每組實驗重復(fù)3次，以GAPDH作為實驗內(nèi)參。引物序列來自于已發(fā)表文獻(xiàn)［17］，引物由武漢擎科生物有限公司合成（表1）。本研究使用的引物如下：

表1 qRT-PCR對差異表達(dá)的mRNA的引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR for differentially expressed mRNAs

1.3.8 海馬能量代謝儀檢測細(xì)胞氧化率（OCR）和細(xì)胞外酸化率（ECAR）將Wnt+細(xì)胞接種在96孔板（1×104/mL），每孔加入80 μL干細(xì)胞培養(yǎng)基，經(jīng)10 μmol/L二甲雙胍或?qū)φ仗幚?8 h后，按照安捷倫實驗操作進(jìn)行后續(xù)實驗并計算OCR和ECAR［18］。

1.3.9 探針檢測線粒體膜電位和ROS水平 獲取實驗組和對照組Wnt+細(xì)胞，按照試劑盒說明每孔加入100 nmol/L TMRE探針或MitoSOX探針，37 ℃避光孵育探針30 min，離心并洗滌細(xì)胞2遍后，PBS溶液重懸，上流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位和ROS水平［19］。

1.3.10 NDI1轉(zhuǎn)染與鑒定 根據(jù)已報道的文獻(xiàn)引物序列［12］，從釀酒酵母（saccharomyces cerevisiae）中純化NDI1 cDNA，引物如下：FWD: 5'ATAAGATCTGCCGCCA CCATGCTATCGAAGAATTTGTAT3'；REV: 5' TATG AATTCCTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTAA TCCTTTAAAAAAGTCTCT3'。pCMV-NDI1-Puro慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建及病毒包裝由上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司提供。在培養(yǎng)基中加入10 μg/mL polybrene，慢病毒以感染復(fù)數(shù)25（MOI=25）感染結(jié)直腸癌類器官細(xì)胞72 h后，更換含有1 μg/mL Puromycin的培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NDI1 的細(xì)胞。通過免疫印跡檢測細(xì)胞中NDI1的表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0和Graphpad 8.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有實驗均重復(fù)3次，正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍選擇性抑制結(jié)直腸CSCs的自我更新

采用不同濃度二甲雙胍（5、10、20、30 μmol/L）與原代結(jié)直腸癌類器官（PDO1、PDO2和PDO3）中分選出的Wnt+細(xì)胞和Wnt-細(xì)胞分別在體外共培養(yǎng)形成細(xì)胞球體。體外細(xì)胞球體形成實驗顯示不同濃度的二甲雙胍均可以顯著抑制Wnt+細(xì)胞自我更新形成細(xì)胞球體（P＜0.01，圖1A），對Wnt-細(xì)胞無顯著抑制效應(yīng)（P＞0.05，圖1A）。當(dāng)二甲雙胍濃度升至10 μmol/L后，其對Wnt+細(xì)胞形成細(xì)胞球體的抑制率已超過50%（圖1A）。因此，選取10 μmol/L二甲雙胍與Wnt+細(xì)胞共培養(yǎng)作為最佳的體外實驗?zāi)Ｐ?。單克隆集落形成實驗同樣顯示，10 μmol/L二甲雙胍在體外可顯著抑制單個Wnt+細(xì)胞自我更新形成單克隆（P＜0.001，圖1B）。進(jìn)一步，通過二甲雙胍處理接種不同數(shù)量級的Wnt+細(xì)胞的小鼠，體內(nèi)有限稀釋實驗顯示二甲雙胍可以抑制Wnt+細(xì)胞形成移植瘤的數(shù)量，并顯著降低腫瘤起始細(xì)胞（TICs）的數(shù)量（P＜0.001，表2）。

圖1 二甲雙胍體外對結(jié)直腸癌干細(xì)胞和癌分化細(xì)胞的自我更新能力的影響Fig.1 Evaluation of self-renewal capacity of CSCs and differentiated cancer cells obtained from PDOs following metformin treatment. A: Sphere formation assays of Wnt+ and Wnt- cells treated with different concentrations of metformin. B: Colony formation assays of Wnt+ cells treated with 10 μmol/L metformin.(**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group).

表2 小鼠體內(nèi)有限稀釋實驗檢測二甲雙胍對結(jié)直腸癌干細(xì)胞成瘤能力的影響Tab.2 Limiting dilution assays on tumor-initiating frequencies(TIFs)of metformin-treated colorectal CSCs in vivo

2.2 二甲雙胍促進(jìn)Wnt+細(xì)胞分化為癌分化細(xì)胞

用10 μmol/L二甲雙胍處理純化的CSCs 3 d后，用流式細(xì)胞儀檢測Wnt+細(xì)胞比例變化，結(jié)果顯示二甲雙胍可顯著降低Wnt+細(xì)胞的比例（P＜0.01，圖2A）。qRT-PCR分析顯示，二甲雙胍顯著抑制Wnt+細(xì)胞中干性相關(guān)標(biāo)志物CD133、Lgr5、CD44的mRNA水平，顯著升高Wnt+細(xì)胞中癌分化細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物MUC2、KRT20和FABP2的mRNA水平（P＜0.05，圖2B）。進(jìn)一步分析Wnt+細(xì)胞中GFP 的熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示二甲雙胍能顯著抑制Wnt+細(xì)胞中Wnt 信號通路活性（P＜0.001，圖2C）。qRT-PCR實驗證實，二甲雙胍能顯著抑制Wnt+細(xì)胞Wnt下游信號通路c-Myc、CCND1、ASCL2和AXIN2的mRNA水平（P＜0.05，圖2D）。

圖2 二甲雙胍抑制結(jié)直腸癌干細(xì)胞Wnt信號通路并促進(jìn)其分化Fig.2 Metformin inhibits Wnt activity of CSCs and induces CSCs into differentiated cancer cells.A, C: FACS analysis on Wnt expression in 10 μmol/L metformin-treated CSCs and GFP intensity of residual Wnt+cells.B,D:qRT-PCR analysis of changes in cancer stemness-related markers,differentiation-related markers and Wnt target genes in Wnt+ cells treated with 10 μmol/L metformin.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group.

2.3 二甲雙胍對結(jié)直腸CSCs糖代謝活性的影響

通過海馬能量代謝分析儀分析顯示10 μmol/L二甲雙胍處理Wnt+細(xì)胞后，其基礎(chǔ)呼吸和氧化磷酸化的OCR均顯著下降（P＜0.001，圖3A）。同時，其ECAR水平顯著增加（P＜0.001，圖3B）。TMRE探針檢測線粒體膜電位顯示，二甲雙胍能顯著降低Wnt+細(xì)胞線粒體膜電位（P＜0.001，圖3C）。MitoSOX 探針檢測顯示，二甲雙胍顯著抑制Wnt+細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS 的產(chǎn)生（P＜0.001，圖3D）。

圖3 二甲雙胍抑制結(jié)直腸癌干細(xì)胞的線粒體有氧代謝并降低細(xì)胞內(nèi)ROSFig.3 Metformin impairs mitochondrial aerobic capacity and ROS production in colorectal CSCs.A, B: Seahorse analysis for OCR and ECAR of 10 μmol/L metformintreated Wnt+cells.C,D:FACS analysis for mitochondrial membrane potential and ROS production of 10 μmol/Lmetformin-treated Wnt+cells.***P＜0.001 vs control group.

2.4 二甲雙胍促進(jìn)結(jié)直腸癌干細(xì)胞分化及機(jī)制

體外細(xì)胞球體形成實驗顯示，半乳糖顯著增強(qiáng)Wnt+細(xì)胞體外自我更新形成細(xì)胞球體的能力，二甲雙胍或外源性抗氧化劑NAC均能顯著抑制Wnt+細(xì)胞的細(xì)胞球體形成能力，二甲雙胍能顯著削弱半乳糖促進(jìn)Wnt+細(xì)胞形成細(xì)胞球體的效應(yīng)（P＜0.05，圖4A、B）。MitoSOX探針檢測證實，半乳糖顯著增強(qiáng)Wnt+細(xì)胞線粒體ROS水平；加入二甲雙胍或外源性抗氧化劑NAC均能顯著抑制Wnt+細(xì)胞ROS 水平，二甲雙胍能顯著削弱半乳糖增強(qiáng)Wnt+細(xì)胞ROS水平的效應(yīng)（P＜0.01，圖4C）。進(jìn)一步流式細(xì)胞學(xué)分析各組Wnt+細(xì)胞比例及其細(xì)胞內(nèi)Wnt信號通路活性顯示，半乳糖顯著增加細(xì)胞球體中Wnt+細(xì)胞比例及其Wnt活性，二甲雙胍和NAC均能顯著降低細(xì)胞球體中Wnt+細(xì)胞比例及其Wnt活性；并且，二甲雙胍可顯著削弱半乳糖增強(qiáng)Wnt+細(xì)胞比例及Wnt活性的效應(yīng)（P＜0.05，圖4D、E）。

圖4 二甲雙胍通過降低結(jié)直腸癌干細(xì)胞線粒體ROS抑制其自我更新Fig.4 Metformin inhibits self-renewal capacity of colorectal CSCs by reducing mitochondrial ROS.A,B:Representative images(Original magnification: ×200) and quantitative analysis of sphere-formation capacity of Wnt+ cells treated with 10 mmol/L galactose(Gal),10 μmol/L metformin(Met),5 mmol/L NAC and 10 mmol/L galactose plus 10 μmol/L metformin.C:FACS analysis for mitochondrial ROS production in Wnt+cells.D,E:FACS analysis on Wnt expression and GFP intensity of Wnt+cells in spheres.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group,#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001 vs Gal group.

2.5 二甲雙胍調(diào)控結(jié)直腸癌干細(xì)胞Wnt信號通路的機(jī)制

免疫印跡檢測顯示，人結(jié)直腸癌類器官細(xì)胞不表達(dá)NDI1，轉(zhuǎn)染NDI1 慢病毒后細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)NDI1（圖5A）。TMRE探針和MitoSOX探針檢測分析顯示，10 μmol/L二甲雙胍顯著抑制結(jié)直腸Wnt+細(xì)胞線粒體膜電位及細(xì)胞內(nèi)ROS水平，轉(zhuǎn)染NDI1可顯著削弱二甲雙胍抑制結(jié)直腸CSCs線粒體氧化磷酸化及ROS的效應(yīng)（P＜0.001，圖5B、C）。熒光顯微鏡觀察及流式細(xì)胞檢測顯示，10 μmol/L二甲雙胍顯著降低PDOs中Wnt+細(xì)胞的比例及其Wnt信號通路活性，轉(zhuǎn)染NDI1可顯著削弱二甲雙胍降低結(jié)直腸CSCs的比例、抑制其Wnt信號通路活性的效應(yīng)（P＜0.001，圖5D、F）。

圖5 二甲雙胍抑制線粒體復(fù)合體I抑制結(jié)直腸癌干細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路Fig. 5 Metformin suppresses Wnt/β-catenin signaling pathway of colorectal CSCs by inhibiting mitochondrial complex I.A:Western blotting for NDI1 expressions in Wnt+cells infected by NDI1 lentivirus or vector lentivirus.B,C:FACS analysis for mitochondrial membrane potential and ROS production of 10 μmol/L metformin-treated Wnt+ cells infected by NDI1 lentivirus or vector lentivirus. D-F: Representative images and FACS analysis of Wnt expression and GFP intensity in NDI1 lentivirus or vector lentivirus-infected Wnt+ cells derived organoids (Scale bar: 100 μm).***P＜0.001 vs control group,###P＜0.001 vs vector lentivirusinfected organoids treated with 10 μmol/Lmetformin.

3 討論

二甲雙胍是經(jīng)典的治療糖尿病的藥物，其潛在的預(yù)防和抗結(jié)直腸癌的作用也引起了廣泛的研究興趣［9-13］。然而，其發(fā)揮作用的對象和機(jī)制仍缺乏不清楚［19,20］。本研究首次使用人原代結(jié)直腸癌PDOs作為研究對象，探討臨床治療濃度（5～30 μmol/L）的二甲雙胍對不同腫瘤和不同細(xì)胞亞群的抑制效應(yīng)［21,22］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對抑制結(jié)直腸CSCs體外自我更新形成細(xì)胞球體的效應(yīng)呈濃度依賴性，對癌分化細(xì)胞無顯著影響。同時，二甲雙胍可顯著降低CSCs相關(guān)基因和Wnt信號通路下游基因的mRNA表達(dá)水平，顯著升高癌分化細(xì)胞相關(guān)基因的mRNA水平。既往體內(nèi)研究數(shù)據(jù)僅發(fā)現(xiàn)二甲雙胍降低CSCs形成腫瘤的體積或生長速度，無法排除二甲雙胍對增殖的抑制效應(yīng)［20-23］，本研究率先通過小鼠體內(nèi)有限稀釋實驗計算可形成腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，證實二甲雙胍在體內(nèi)顯著降低結(jié)直腸CSCs亞群中的可成瘤細(xì)胞頻率，抑制CSCs自我更新形成腫瘤。以上數(shù)據(jù)證實，二甲雙胍選擇性抑制結(jié)直腸CSCs并促進(jìn)其分化為癌分化細(xì)胞亞群。

二甲雙胍可以通過抑制線粒體氧化磷酸化發(fā)揮其抗腫瘤作用［24］。研究表明，結(jié)直腸CSCs較癌分化細(xì)胞具有更高的氧化磷酸化和ROS水平，ROS可以增強(qiáng)介導(dǎo)CSCs自我更新的Wnt/β-catenin信號通路［7,8,25］。因此，我們進(jìn)一步探討了二甲雙胍對結(jié)直腸CSCs葡萄糖代謝和ROS水平的影響，結(jié)果顯示二甲雙胍顯著降低結(jié)直腸CSCs的細(xì)胞OCR、線粒體膜電位水平和ROS水平，顯著增強(qiáng)其ECAR，證實二甲雙胍可抑制結(jié)直腸CSCs氧化磷酸化及下游ROS的產(chǎn)生，并促進(jìn)其代謝重編程至糖酵解產(chǎn)生更多的酸性代謝產(chǎn)物。加入外源性半乳糖增強(qiáng)細(xì)胞氧化磷酸化、升高ROS水平［26］，能顯著增強(qiáng)結(jié)直腸CSCs自我更新能力和Wnt信號通路活性，加入抗氧化劑NAC降低ROS水平能顯著削弱結(jié)直腸CSCs自我更新能力和Wnt信號通路活性；并且，二甲雙胍能顯著削弱半乳糖增強(qiáng)結(jié)直腸CSCs的線粒體氧化磷酸化和ROS 水平的效應(yīng)，從而抑制半乳糖對Wnt/βcatenin信號通路的促進(jìn)作用。以上數(shù)據(jù)表明，二甲雙胍通過抑制線粒體氧化磷酸化及下游ROS的生成降低結(jié)直腸CSCs的Wnt/β-catenin信號通路。

二甲雙胍通過抑制線粒體復(fù)合體I發(fā)揮其臨床治療作用［27］。我們將酵母NADH脫氫酶NDI1轉(zhuǎn)染至結(jié)直腸癌PDOs，其在細(xì)胞內(nèi)可替代人線粒體復(fù)合體I的功能且不受二甲雙胍的抑制，從而維持線粒體的有氧代謝和ROS水平［28］。轉(zhuǎn)染NDI1后，二甲雙胍失去降低結(jié)直腸CSCs氧化磷酸化和ROS水平的作用，與文獻(xiàn)報道一致［12］。流式細(xì)胞學(xué)分析顯示，轉(zhuǎn)染NDI1可挽救二甲雙胍降低結(jié)直腸CSCs 比例和Wnt 活性水平的效應(yīng)。表明二甲雙胍通過抑制線粒體復(fù)合體I下調(diào)CSCs的Wnt/β-catenin信號通路。

目前結(jié)直腸癌和卵巢癌的臨床研究均已發(fā)現(xiàn)，術(shù)前服用二甲雙胍可顯著降低腫瘤內(nèi)CSCs的比例，提示二甲雙胍在靶向抑制CSCs中有重要的應(yīng)用前景［29,30］。本研究證實了二甲雙胍通過抑制結(jié)直腸CSCs的線粒體復(fù)合體I降低結(jié)直腸CSCs線粒體氧化磷酸化水平，從而通過抑制ROS/Wnt/β-catenin 信號通路降低結(jié)直腸CSCs的自我更新能力，為探索應(yīng)用二甲雙胍治療結(jié)直腸癌提供了新的理論依據(jù)。