心力衰竭患者Circ-PALLD的高表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子GATA4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

黃 卓，曾振宇，李佳，蔡蕊，賀文霞，胡淑婷

1寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院心內(nèi)科，上海200433

在真核生物基因組中，大約90%的基因是轉(zhuǎn)錄基因，在這些轉(zhuǎn)錄基因中只有1%～2%編碼蛋白質(zhì)，其他大多數(shù)轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA（ncRNA）。非編碼RNA不編碼蛋白質(zhì)，但卻在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用［1］。最近研究表明，前體RNA（pre-mRNA）可以通過不同的選擇性剪接產(chǎn)生不同的RNA種類［2］。前體mRNA可經(jīng)反向剪接形成一種共價(jià)閉合的連續(xù)環(huán)，也就是CircRNAs。并且CircRNAs因其特殊的剪接方式，與線性RNA相比，缺少5'端甲基鳥苷帽子和3'端poly-A尾結(jié)構(gòu)，并且CircRNAs的半衰期明顯小于線性RNA分子［3］。CircRNAs因其結(jié)構(gòu)的特殊，可以抵抗核糖核酸外切酶的降解，以及對(duì)RNA 折疊的限制［4］。同時(shí)CircRNAs可以通過調(diào)節(jié)線性RNA轉(zhuǎn)錄，下游基因表達(dá)和蛋白質(zhì)或肽翻譯，在許多生物過程中起著至關(guān)重要的作用［5］。據(jù)報(bào)道CircRNAs的異常調(diào)節(jié)是各種心血管疾病和代謝紊亂（包括肥胖，高血壓）的主要變化之一［6］。并且在心血管疾病中異常表達(dá)的CircRNAs可作為心血管疾病臨床診斷和判斷預(yù)后的分子標(biāo)記物以及潛在的治療靶點(diǎn)［7］。

有報(bào)道稱CircRNAs參與心力衰竭、心肌梗死和心臟重構(gòu)的病理過程［8］，但只有少數(shù)CircRNAs被證明與心功能有關(guān)［9］，這些CircRNAs是否與慢性心衰有關(guān)，并且參與了心力衰竭的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究［10］。到目前為止心血管系統(tǒng)中CircRNAs的調(diào)控機(jī)制與其在衰竭心肌中的表達(dá)情況的相關(guān)報(bào)道甚少。為了研究CircRNAs在心血管疾病中的功能和作用，本研究對(duì)已報(bào)道的在人和鼠的心衰樣本中異常表達(dá)的10種CircRNAs 分子進(jìn)行測(cè)序［11,12］，并設(shè)計(jì)引物，探討CircRNAs與其線性RNA（linear RNA）在人衰竭心肌的表達(dá)情況并做對(duì)比分析，從中篩選出在衰竭心肌中具有表達(dá)差異的CircRNAs——Circ-PALLD。現(xiàn)在很多研究表明，CircRNAs可以與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控基因的表達(dá)，但對(duì)調(diào)控CircRNAs的機(jī)制研究卻知之甚少。本研究通過生物信息學(xué)對(duì)調(diào)控PALLD的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行預(yù)測(cè)，探討在慢性心衰過程中Circ-PALLD潛在的生物學(xué)功能，加深對(duì)CircRNAs的了解。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 病例來源 所有病例來自于海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院2021年5月1日～2023年2月15日期間出院診斷符合CHF 的患者，年齡≥18歲，心衰病史≥6個(gè)月。均簽署知情同意書。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠6只，1～3 d齡，購(gòu)自上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)營(yíng)部。SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，本文的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均通過寧夏醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理審查委員會(huì)已批準(zhǔn)（審批編號(hào)：2017-014）。

1.2 主要試劑

膠回收試劑盒（天根生化）；75%酒精（國(guó)藥集團(tuán)）；Hank's平衡鹽溶液（上海源培生物科技）；1%Ⅰ型膠原酶，Brdu（Sigma）；胎牛血清，RIPA 裂解液（上海碧云天生物）；DMEM培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技）；Hieff TransTM脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑，2×Hieff PCR Master Mix（翌圣生物科技）；Trizol Reagent，PVDF膜（默克）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript ⅢRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)試劑盒，DNA marker（諾唯贊生物）；SYBR?Green Pro Taq HS 預(yù)混型qPCR 試劑盒（愛科瑞生物）；本研究中使用的抗體包括anti-GATA4，anti-GAPDH（ABclonal）；辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗（Abways）；化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（新賽美生物科技）；本研究使用的引物全部交由金維智公司合成；siRNA均由廣州銳博生物公司設(shè)計(jì)合成；其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 CircRNAs的Sanger測(cè)序

首先通過NCBI 與Circbase 數(shù)據(jù)庫(kù)查找Circ-VWA8，Circ-VMP1，Circ-PRDM5，Circ-PLCL2，Circ-PALLD，Circ-NFATC3，Circ-MLIP，Circ-FAM208A，Circ-ANKIB1，Circ-AGTPBP1的前體序列，Primer3設(shè)計(jì)PCR引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到以上CircRNAs序列，瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行膠回收，并送至金維智公司進(jìn)行Sanger測(cè)序，驗(yàn)證以上CircRNAs的反向剪接方式。引物序列見表1。

表1 基因的引物序列Tab.1 Primer sequence for the target genes

1.3 乳鼠原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)

將出生1～3 d的新生SD乳鼠于75%酒精中浸泡消毒，取出后置于超凈工作臺(tái)，取出心臟后迅速將心臟迅速置于預(yù)冷的HBSS平衡鹽溶液中，用無菌眼科剪將心室剪成1 mm3左右組織塊，清洗后將組織塊轉(zhuǎn)移至10 cm培養(yǎng)皿，加入8倍體積的含1%Ⅰ型膠原酶的DHanks液，4 ℃孵育過夜。孵育完成后，無菌槍頭充分吹打直至無組織塊存在，移入離心管。離心10 min后棄掉上清，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，移入10 cm培養(yǎng)皿，置37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)箱孵育2 h。2 h后取出培養(yǎng)皿，將上清培養(yǎng)基（心肌細(xì)胞）接種于6孔板，置37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，待細(xì)胞貼壁后換液（含1%Brdu DMEM）。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

GATA4 siRNA 與對(duì)照siRNA 參照說明書，使用Hieff TransTM脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，將siRNA轉(zhuǎn)染入12孔板中的原代乳鼠心肌細(xì)胞中。

1.5 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR反應(yīng)）

在研缽中加入液氮，再將組織剪成小塊在液氮中磨成粉末，用液氮預(yù)冷的藥匙取50～100 mg組織粉末加入已盛Trizol液的EP管中，充分混合均勻。室溫放置5 min，使用Trizol Reagent從細(xì)胞/組織中提取RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript ⅢRT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒合成cDNA，使用2×Hieff PCR Master Mix，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，35個(gè)循環(huán)后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，50×TAE緩沖液用去離子水稀釋，倒入樣品槽中。用移液槍將樣品和DNA marker加入已經(jīng)準(zhǔn)備好的樣品孔中。30 min后，停止電泳，紫外下觀察顯影并拍照，使用GAPDH 作為circRNA或linear RNA的檢測(cè)內(nèi)參。引物序列見表1。

1.6 qRT-PCR

使用SYBR?Green Pro Taq HS 預(yù)混型qPCR 試劑盒在實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)。使用GAPDH作為circRNA或linear RNA的檢測(cè)內(nèi)參，采用2-△△CT法計(jì)算基因表達(dá)。引物序列見表1。

1.7 Western blot

使用含有苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液在冰上裂解提取蛋白。將蛋白質(zhì)萃取物轉(zhuǎn)移至4%～12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，然后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。經(jīng)過5%脫脂奶粉封閉2 h后，使用相應(yīng)一抗在4 ℃孵育過夜。然后用辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗在室溫下孵育2 h。使用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)對(duì)蛋白印跡進(jìn)行可視化。所有蛋白條帶以GAPDH作為檢測(cè)內(nèi)參。

1.8 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與Circ-PALLD有相關(guān)性的的轉(zhuǎn)錄因子

通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與Circ-PALLD有相關(guān)性的轉(zhuǎn)錄因子。R2越接近1及相關(guān)性越強(qiáng)。

1.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用Image pro plus 軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值檢測(cè)（IOD）歸一化后依據(jù)相應(yīng)比值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。應(yīng)用GraphPad Prism8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間的差異比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05（雙側(cè)）為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CircRNAs分子反向剪接成環(huán)

CircRNAs 通過反向剪接的形式形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖1）。通過Sanger測(cè)序法得出以上環(huán)狀分子的RNA序列，我們發(fā)現(xiàn)Circ-VWA8通過外顯子4與外顯子3反向剪接方式成環(huán)；Circ-VMP1通過外顯子5與外顯子2反向剪接方式成環(huán)；Circ-PRDM5通過外顯子13與外顯子7反向剪接成環(huán)；Circ-PLCL2通過外顯子4與外顯子3反向剪接成環(huán)；Circ-PALLD通過外顯子2首尾反向剪接成環(huán)；Circ-NFATC3通過外顯子3與外顯子2反向剪接成環(huán)；Circ-MLIP通過外顯子11與外顯子4反向剪接成環(huán)；Circ-FAM208A通過外顯子11與外顯子2反向剪接成環(huán)；Circ-ANKIB1通過外顯子5與外顯子2反向剪接成環(huán)；Circ-AGTPBP1通過外顯子15與外顯子13反向剪接成環(huán)（圖2）。

圖1 反向剪接示意圖Fig. 1 Diagram showing reverse splicing of CircRNAs.

圖2 CircRNAs的Sanger測(cè)序結(jié)果Fig. 2 Sanger sequencing results of the CircRNAs.

2.2 CircRNAs與linear RNA在心衰中的表達(dá)

2.2.1 CircRNAs 在衰竭心肌中的表達(dá) 通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)衰竭心肌組織中Circ-VWA8，Circ-VMP1，Circ-PRDM5，Circ-PLCL2，Circ-PALLD，Circ-NFATC3，Circ-MLIP，Circ-FAM208A，Circ-ANKIB1，Circ-AGTPBP1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在衰竭心肌中環(huán)狀RNA分子的表達(dá)水平均上調(diào)，其中Circ-VWA8，Circ-ANKIB1，Circ-AGTPBP1，Circ-NFATC3 和 Circ-PALLD的上調(diào)最為顯著（P＜0.05，圖3）。

圖3 CircRNAs分子在衰竭心肌中的表達(dá)Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of the amplified CircRNAs from failing myocardium.*P＜0.05,**P＜0.01 vs Normol(n=4).

2.2.2 linear RNA在衰竭心肌中的表達(dá) 通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)衰竭心肌組織中VWA8，VMP1，PRDM5，PLCL2，PALLD，NFATC3，MLIP，F(xiàn)AM208A，ANKIB1，AGTPBP1 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在衰竭心肌中AGTPBP1，VMP1表達(dá)水平升高，而PALLD表達(dá)水平降低（P＜0.05，圖4）。

圖4 線性RNA在人衰竭心肌的表達(dá)水平Fig. 4 Agarose gel electrophoresis of the amplified linear RNAs from failing myocardium.*P＜0.05 vs Normol(n=4).

2.2.3 衰竭心肌中PALLD 與Circ-PALLD 的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 通過RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，在衰竭心肌中，Circ-PALLD的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.001，圖5A），PALLD的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.001，圖5B）。

圖5 衰竭心肌中PALLD與Circ-PALLD的表達(dá)水平Fig. 5 Expression levels of PALLD(A)and Circ-PALLD(B)in the failing myocardium.***P＜0.001 vs Normol(n=8).

2.3 生物信息學(xué)尋找可能調(diào)控Circ-PALLD的轉(zhuǎn)錄因子

通過生物信息學(xué)分析出與Circ-PALLD具有相關(guān)性的轉(zhuǎn)錄因子有49個(gè)（圖6）。在String網(wǎng)站檢索以上49個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能的潛在相互作用，并構(gòu)建了蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖7）。然后通過Cytoscape 進(jìn)行Hub基因的篩選發(fā)現(xiàn)GATA4 具有最高的連接度，連接分?jǐn)?shù)為4514784。

圖6 Circ-PALLD與轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)分析Fig. 6 Bioinformatic analysis of Circ-PALLD and its transcription factors.

圖7 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig. 7 Protein interaction network.

2.4 敲降轉(zhuǎn)錄因子GATA4后Circ-PALLD和PALLD的表達(dá)降低

qRT-PCR檢測(cè)衰竭心肌組織中GATA4的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，GATA4在衰竭心肌組織中表達(dá)升高（P＜0.001，圖8A）。為探討PALLD轉(zhuǎn)錄調(diào)控是否受GATA4的影響，將GATA4的siRNA轉(zhuǎn)染入原代乳鼠心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)敲低GATA4 后（P＜0.01，圖8B），Circ-PALLD 和PALLD的表達(dá)均降低（P＜0.05，圖8C、D）。

圖8 敲降轉(zhuǎn)錄因子GATA4后線性PALLD和Circ-PALLD的表達(dá)降低Fig. 8 The transcription factor GATA4 regulates the transcription of Circ-PALLD. A: Expression of GATA4 in failing myocardium. B: GATA4 expression level after GATA4 knockdown. C: Expression level of PALLD after GATA4 knockdown.D:Expression levels of Circ-PALLD after GATA4 knockdown.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001vs NC/Normol(n=3).

3 討論

越來越多的證據(jù)表明CircRNAs與多種心血管疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，在心血管疾病中發(fā)揮重要作用［13］。同時(shí)CircRNAs有多種成環(huán)方式，CircRNAs可以由外顯子，內(nèi)含子，外顯子和內(nèi)含子共同組成［12,14］。因此研究CircRNAs 的成環(huán)方式具有重要意義。本研究通過Sanger一代測(cè)序驗(yàn)證了Circ-VWA8、Circ-VMP1、Circ-PRDM5、Circ-PLCL2、Circ-PALLD、Circ-NFATC3、Circ-MLIP、Circ-FAM208A、Circ-ANKIB1、Circ-AGTPBP1 均是由外顯子反向剪接成環(huán)的，為CircRNAs的研究提供了科學(xué)依據(jù)。

心力衰竭的主要病理生理改變是心臟重塑，主要由心肌細(xì)胞衰老、死亡，肌小節(jié)功能減退，內(nèi)皮、血管功能受損，間質(zhì)纖維化增加等導(dǎo)致［15］。目前臨床上常用腦鈉肽和N端腦鈉肽前體作為評(píng)估心力衰竭危險(xiǎn)分層及預(yù)后的生物標(biāo)記物［16］，但它們的血漿濃度個(gè)體差異較大，因此對(duì)心力衰竭的治療指導(dǎo)作用有限［17］。近幾年來，CircRNAs被證明與心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥等疾病有關(guān)［18］。已有研究表明CircRNAs在心肌細(xì)胞損傷后修復(fù)、心肌細(xì)胞自噬與衰老、血管再生等方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)心臟重塑［19］。也有研究人員檢測(cè)到心力衰竭患者血漿中存在大量顯著差異表達(dá)的CircRNAs。這表明CircRNAs在診斷和治療心力衰竭方面具有巨大潛力［20］。本研究通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)人衰竭心肌中CircRNAs與linear RNA的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)Circ-PALLD表達(dá)水平明顯上調(diào)。因此Circ-PALLD 在心衰中或有重要作用，并且也可能是潛在的心衰生物標(biāo)志物。

PALLD（Palladin）是一種廣泛表達(dá)的肌動(dòng)蛋白和捆綁蛋白，作為細(xì)胞骨架支架來捆綁肌動(dòng)蛋白纖維和肌動(dòng)蛋白交聯(lián)劑，參與控制細(xì)胞形狀，粘附和收縮［21］。有研究表明PALLD參與了血小板和動(dòng)脈血栓的形成且與心肌梗死有關(guān)，是缺血性心肌病引起的心力衰竭潛在的生物標(biāo)志物［22］。本研究通過RT-qPCR進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Circ-PALLD仍在衰竭心肌表達(dá)升高，但PALLD在衰竭心肌中的表達(dá)水平卻截然相反，這說明Circ-PALLD與PALLD在心血管疾病中的功能可能存在差異，因此我們分析，在衰竭心肌中表達(dá)升高的Circ-PALLD在心血管疾病中可能扮演重要角色。針對(duì)Circ-PALLD在心血管疾病中的功能目前并沒有相關(guān)報(bào)道，因此我們的研究有望為心血管疾病的診斷和治療提供新的思路。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們分析，在衰竭心肌中，Circ-PALLD的表達(dá)上調(diào)可能是PALLD的轉(zhuǎn)錄水平或者轉(zhuǎn)錄后水平受到影響。

研究報(bào)道心臟轉(zhuǎn)錄因子（TF）網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)是治療干預(yù)心血管疾病的一種可行選擇［23］。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析，轉(zhuǎn)錄因子GATA4具有調(diào)控基因PALLD轉(zhuǎn)錄的可能性。已有的研究表明，GATA4是心臟發(fā)育和肥大基因調(diào)節(jié)中必不可少的轉(zhuǎn)錄因子［24］。GATA4（GATA結(jié)合蛋白4）是一種含鋅指的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子［25］，對(duì)小鼠和人類的正常心臟發(fā)育和穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，并且在人類心臟缺陷中已經(jīng)報(bào)道了該基因的突變［26］。本研究通過RT-qPCR發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子GATA4在心衰組織中高表達(dá)，敲降GATA4后，Circ-PALLD與PALLD的表達(dá)水平明顯降低。因此，在人心臟衰竭過程中基因PALLD 的轉(zhuǎn)錄確實(shí)可能受到轉(zhuǎn)錄因子GATA4 的影響。那么這種變化是否是由GATA4調(diào)控PALLD的轉(zhuǎn)錄引起，后續(xù)研究還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。但本研究發(fā)現(xiàn)在衰竭心肌中Circ-PALLD表達(dá)水平明顯上升的同時(shí)PALLD表達(dá)水平卻明顯降低。因此，轉(zhuǎn)錄因子GATA4可以影響Circ-PALLD與PALLD的轉(zhuǎn)錄過程，但根據(jù)Circ-PALLD與PALLD在心衰組織中的表達(dá)水平分析，GATA4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用并不是導(dǎo)致心衰的唯一的影響因素，其他因素在心衰中的作用可能高于轉(zhuǎn)錄在心衰中的影響。從CircRNAs的生物學(xué)發(fā)生方式上進(jìn)一步分析，在人心臟衰竭過程中，是否也同樣影響了基因PALLD的剪接修飾從而使Circ-PALLD表達(dá)水平升高，PALLD的表達(dá)水平降低［27］。

目前CircRNAs在心力衰竭中的研究大多是通過與miRNA的相互作用來探討CircRNAs的下游功能［28,29］，但CircRNAs的上游機(jī)制研究卻很少［30］。我們的研究旨在篩選可能作為心力衰竭中生物診斷物和治療靶點(diǎn)的候選CircRNAs分子，并著重研究CircRNAs的生物學(xué)發(fā)生過程，為心力衰竭的診斷治療以及預(yù)后提供潛在的新的靶點(diǎn)，同時(shí)也加深對(duì)CircRNAs的了解。