多指標(biāo)正交試驗(yàn)法優(yōu)選連豆清脈合劑提取工藝

張文明，唐靜月，卞振華，袁曉航，陳曉偉，胡敏敏，張敏娟

無錫市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 無錫 214071

連豆清脈方是無錫市中醫(yī)醫(yī)院為治療痰、熱、瘀、虛合而為病的動脈硬化類疾病而研制的基礎(chǔ)方[1]。全方由7 味藥組成，包括連翹、黃連和野料豆等，具有清熱解毒、活血、化痰瀉濁、補(bǔ)腎之功效。方中連翹、黃連兩味藥同為君藥，共奏清熱解毒、散結(jié)消腫之功效。野料豆為臣藥，起到補(bǔ)益肝腎、祛風(fēng)解毒的作用。無錫市中醫(yī)醫(yī)院臨床多年來一直使用連豆清脈方，療效顯著，無不良反應(yīng)，深受廣大患者歡迎[2-3]。藥理研究表明，連翹中的有效成分連翹苷具有降血脂、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等功效[4]；黃連主要活性成分小檗堿具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗高血壓及血脂、調(diào)節(jié)血糖等功效[5-6]。依據(jù)本方功能主治和臨床用藥需求，選擇制備工藝簡單且服用和攜帶方便的合劑作為該方的劑型[7]。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）測定連翹苷和小檗堿含量，選擇連翹苷轉(zhuǎn)移率、小檗堿轉(zhuǎn)移率和浸膏得率作為評價指標(biāo)，結(jié)合綜合評分，以正交試驗(yàn)法優(yōu)選其最佳提取工藝，以更好地保證連豆清脈合劑的質(zhì)量和臨床療效，為連豆清脈合劑大規(guī)模生產(chǎn)及研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與藥材、試劑

1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；ZA805AS 電子分析天平（上海贊維衡器有限公司）；KQ-300E 型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑 連翹（批號：20022001；產(chǎn)地：河南）、赤芍（批號：20122912；產(chǎn)地：內(nèi)蒙古）、知母（批號：20102301；產(chǎn)地：河北）、野料豆（批號：190807；產(chǎn)地：江蘇）、牡丹皮（批號：210107；產(chǎn)地：安徽）、萊菔子（批號：210111；產(chǎn)地：江蘇）均購自江蘇亞邦中藥飲片有限公司。黃連（批號：201124；產(chǎn)地：四川）購自蘇州市春暉堂藥業(yè)有限公司；連翹苷、小檗堿對照品均從中國食品藥品檢定研究院購進(jìn)，批號分別為110821-201816、110713-201814；乙腈（賽默飛世爾科技有限公司，色譜級）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 連翹苷、小檗堿含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸水（B），梯度洗脫（0～7 min，10%～15%A；7～12 min，15%～23%A；12～17 min，23%～27%A；17～35 min，27%～29%A）；流速：0.7 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：277 nm。理論板數(shù)按連翹苷峰、小檗堿峰計(jì)算應(yīng)分別不低于3 000、5 000。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取適量連翹苷、小檗堿對照品，置于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，制成含連翹苷110.316 μg/mL、小檗堿85.833 μg/mL 的混合對照品溶液。再將上述混合對照品溶液0.25、0.5、1.0、3.0 mL 分別精密吸取到5 mL 量瓶中，加甲醇定容到刻度，得到不同濃度梯度混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取連豆清脈合劑2 mL，置10 mL 量瓶內(nèi)，加甲醇溶解定容至刻度，搖勻后超聲（100 W，40 kHz）10 min，經(jīng)微孔濾膜0.22 μm過濾，即得。

2.1.4 陰性溶液的制備 按連豆清脈合劑處方和生產(chǎn)工藝，分別稱取缺連翹、缺黃連的全方飲片，按上述“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，分別制成陰性試樣，即缺連翹和黃連。

2.1.5 專屬性考察 見圖1。分別取上述混合對照品溶液、供試品溶液、缺連翹、缺黃連陰性溶液各適量，依次按序進(jìn)樣分析。連翹苷和小檗堿都能有效分離，分離度在1.5 以上，陰性溶液沒有干擾。

圖1 HPLC 色譜圖

2.1.6 線性關(guān)系考察 分別精密移出適量“2.1.2”項(xiàng)下不同濃度梯度混合對照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件依次測定。橫坐標(biāo)為對照品濃度（X，μg/mL），縱坐標(biāo)為吸收峰面積（Y），進(jìn)行線性回歸，得連翹苷回歸方程為Y=8.388X-13.702，r=0.999 7，小檗堿回歸方程為Y=21.680X-31.478，r=0.999 7，結(jié)果表明連翹苷在5.516～110.316 μg/mL，小檗堿在4.292～85.833 μg/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，取上述相同混合對照品溶液適量，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，連續(xù)6 次進(jìn)樣，記錄連翹苷及鹽酸小檗堿的峰面積。結(jié)果顯示其峰面積RSD 分別為0.67%、0.61%（n=6），表明儀器精密度較好。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取連豆清脈合劑樣品6 份，每份2 mL，置10 mL 量瓶中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理。按“2.1.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測定，計(jì)算得連翹苷、小檗堿平均含量分別為290.488 μg/mL、251.440 μg/mL，RSD 分別為0.57%、1.16%（n=6），表明此方法測定連翹苷和小檗堿含量重復(fù)性良好。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品2 mL，按“2.1.3”項(xiàng)進(jìn)行處理。按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件，分別在制備后的0、2、4、8、10、12、14、16 h 進(jìn)樣測定。結(jié)果連翹苷、小檗堿峰面積RSD 分別為2.20%、2.04%（n=8），表明樣品溶液在16 h 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 取樣品6 份，每份精密吸取1 mL，置10 mL 量瓶中，加入含連翹苷304.320 μg/mL、小檗堿253.164 μg/mL 的混合對照品溶液1 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，按“2.1.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測定，記錄連翹苷和小檗堿峰面積。結(jié)果顯示，連翹苷、小檗堿的平均加樣回收率分別為101.31%、101.97%，RSD 分別為1.58%、1.76%（n=6），說明建立的方法加樣回收率較好。

2.2 飲片中連翹苷、小檗堿含量測定 分別照《中國藥典》2020 年版一部連翹和黃連“含量測定”項(xiàng)下方法測定[8]。精密稱取連翹粉末（過五號篩）2 g，依法制備樣品溶液。結(jié)果按干燥品計(jì)算，飲片連翹含連翹苷（C27H34O11）含量為0.53%，符合規(guī)定；精密稱取黃連粉末（過二號篩）0.2 g，依法制備樣品溶液。結(jié)果按干燥品計(jì)算，飲片黃連含小檗堿（C20H17NO4）含量為8.09%，符合規(guī)定。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝 在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，選取影響因素A（煎煮時間）、B（煎煮次數(shù)）、C（加水量），每個因素包含三個水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)[7，9]，具體見表1。稱取連豆清脈處方藥材73 g，總共9 份，加水浸泡30 min。按表1 條件，進(jìn)行提取，合并濾液，濃縮至200 mL，分別吸取50 mL 至已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴加熱至近干。105 ℃條件下烘干5 h，干燥器中冷卻30 min，稱質(zhì)量。再干燥2 h，冷卻，稱質(zhì)量，直至恒重。計(jì)算得出，正交樣品1～9 浸膏得率分別為17.57%、24.36%、26.44%、21.94%、26.98%、30.26%、23.24%、28.23%、32.10%，見表2；按“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，制備待測正交樣品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下條件測定正交樣品1～9 的連翹苷、小檗堿含量，計(jì)算連翹苷轉(zhuǎn)移率（煎液中連翹苷含量/連翹飲片中連翹苷含量×100%）、小檗堿轉(zhuǎn)移率（煎液中鹽酸小檗堿含量/黃連飲片中鹽酸小檗堿含量×100%），見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

連豆清脈合劑是多組分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用發(fā)揮藥效的中藥制劑供臨床使用，故賦予浸膏得率20%權(quán)重、連翹苷轉(zhuǎn)移率40%權(quán)重、鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率40%權(quán)重，以綜合評分為指標(biāo)，進(jìn)行直觀分析和方差分析，見表2、表3。結(jié)果顯示，煎煮次數(shù)影響最大，其次是煎煮時間和加水量。K 值顯示A3＞A2＞A1，B3＞B2＞B1，C2＞C3＞C1，得到最優(yōu)方案為A3B3C2，即加10 倍量水，提取3 次，每次1.5 h。由表3 可知，煎煮時間、煎煮次數(shù)、加水量對試驗(yàn)均未產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05），結(jié)合經(jīng)濟(jì)效益及實(shí)際生產(chǎn)制備情況，將提取次數(shù)進(jìn)行調(diào)整，由原來提取3 次變?yōu)樘崛? 次。

表3 方差分析表

2.4 最佳提取工藝驗(yàn)證 稱取連豆清脈合劑處方藥材73 g，以上述優(yōu)選的最佳工藝條件即加10 倍量水，提取2 次，每次1.5 h，進(jìn)行提取，制備得到3 批樣品。分別計(jì)算浸膏得率、連翹苷轉(zhuǎn)移率和小檗堿轉(zhuǎn)移率，見表4。結(jié)果表明3 批樣品的浸膏得率、連翹苷轉(zhuǎn)移率和小檗堿轉(zhuǎn)移率與正交試驗(yàn)結(jié)果最大值接近，表明此提取工藝可行性好、穩(wěn)定性高。

表4 3 批樣品驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）%

2.5 濃縮工藝研究 稱取連豆清脈合劑處方藥材，每份73 g，以上述優(yōu)選的最佳工藝條件即加10 倍量水，提取2 次，每次1.5 h，進(jìn)行提取，平行制備12 批樣品。樣品1～6 采取常壓濃縮，樣品7～12 進(jìn)行減壓濃縮（溫度70～80 ℃，壓力-0.04～-0.08 MPa）[9]。按“2.1.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行連翹苷和小檗堿含量測定，計(jì)算轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表5。采用Origin 7.5 統(tǒng)計(jì)軟件行t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，不同濃縮方法處理后的連翹苷、小檗堿含量無顯著差異（P＞0.05），連翹苷、小檗堿轉(zhuǎn)移率均較高。

表5 不同濃縮方法的考察結(jié)果（n=6）

3 討論

連豆清脈合劑來源于無錫市中醫(yī)醫(yī)院心內(nèi)科臨床經(jīng)驗(yàn)方連豆清脈方，主治高血壓動脈粥樣硬化、不穩(wěn)定型心絞痛，臨床療效顯著，無不良反應(yīng)[1，10]。其主要以湯劑作為臨床服用形式，存在攜帶不易、服用不方便等問題。合劑作為一種新劑型，克服了湯劑臨用時制備的麻煩，使臨床用藥特點(diǎn)得以較大程度被保留[11]。因此，本試驗(yàn)選擇合劑作為連豆清脈方的劑型，進(jìn)行醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑研究。

連翹作為清熱解毒類中藥代表之一，具有疏散風(fēng)熱、清熱解毒和消腫散結(jié)的功效。其主要有效成分連翹苷可以上調(diào)乙?；兔芏戎鞍祝ˋcLDL）刺激下小鼠巨噬細(xì)胞PPAR-r、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC）A1、ABCG1 和清道夫受體B 族1 型（SR-B1）基因的表達(dá)，達(dá)到抗動脈粥樣硬化（AS）作用[12]。連翹苷能降低大鼠血管組織細(xì)胞間黏附因子-1（IACM-1）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）等含量，抑制炎癥反應(yīng)，對AS 斑塊的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)行干預(yù)，從而減少心血管疾病的發(fā)生[13]。黃連作為本方的另一味君藥，其主要活性成分小檗堿可提高大鼠心肌組織miRNA-29b 水平，降低miRNA-29b 靶基因col1α1、col3α1 mRNA 水平，從而發(fā)揮抗心肌肥厚、抗心肌纖維化作用[14]。小檗堿通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）炎性信號通路，減輕ApoE-/-AS 小鼠血管炎癥反應(yīng)，達(dá)到抗AS 作用[15]。連翹苷和小檗堿作為本方的主要有效成分，HPLC 檢測方法成熟，且專屬性強(qiáng)。因此，選擇連翹苷和小檗堿轉(zhuǎn)移率作為本試驗(yàn)評價指標(biāo)，賦予各40%的權(quán)重?？紤]到連豆清脈方是通過多組分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用發(fā)揮藥效的中藥制劑，所以給予藥膏浸出率20%的權(quán)重。通過綜合評分指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，總分作為優(yōu)化指標(biāo)，進(jìn)行直觀分析和方差分析。結(jié)果顯示，煎煮時間、煎煮次數(shù)和加水量對試驗(yàn)均無顯著影響，最佳提取工藝為加10 倍量水，提取3 次，每次1.5 h?？紤]到實(shí)際大規(guī)模生產(chǎn)操作、生產(chǎn)成本及能源節(jié)約等因素，將提取次數(shù)調(diào)整為提取2 次，并按照調(diào)整后的工藝進(jìn)行工藝驗(yàn)證。

中藥制劑化學(xué)成分具有多樣性與復(fù)雜性的特點(diǎn)，影響其含量的因素有很多。王旭等[16]研究發(fā)現(xiàn)黃連和吳茱萸共同煎煮時會降低小檗堿的溶出度。王睿[17]研究表明黃連與甘草配伍使用時，會降低小檗堿的提取轉(zhuǎn)移率。更有研究發(fā)現(xiàn)，連翹配伍黃連發(fā)揮抗炎作用的最佳配伍比例為1∶1[18]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同提取工藝中小檗堿轉(zhuǎn)移率均不足30%，推測處方中連翹或其他藥味對小檗堿含量產(chǎn)生了影響，其具體作用機(jī)理有待后續(xù)深入研究。連翹苷在50 ℃以上高溫條件下，穩(wěn)定性變差。小檗堿易溶于熱水，在諸多提取工藝中存在小檗堿鹽和堿之間的相互轉(zhuǎn)化反應(yīng)[19-20]。本試驗(yàn)中常壓和減壓濃縮后，連翹苷和小檗堿含量均有所下降，說明高溫濃縮方式[8]對兩者含量有所影響，這也提示我們后續(xù)可以對連豆清脈合劑的濃縮方式進(jìn)行優(yōu)化。

此外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)連翹苷與小檗堿間存在一小峰，對峰形及分離度產(chǎn)生影響。故對色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化包括調(diào)整乙腈-磷酸水比例，考察不同流速（0.5、0.7、1.0 mL/min）和不同柱溫（25、28、30 ℃）。考慮到本方為復(fù)方制劑，成分復(fù)雜，故后續(xù)將增加有關(guān)薄層鑒定和藥理研究實(shí)驗(yàn)為其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。