永康市金黃色葡萄球菌感染情況及7種中草藥體外抑菌效果研究

呂美艷，方杭，陳俊，王蔚，徐象威

1. 永康市第一人民醫(yī)院檢驗科，浙江 永康 321300；2. 永康市第一人民醫(yī)院科教科，浙江 永康 321300

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）耐藥性主要由甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）獲得了可以在金黃色葡萄球菌染色體間進(jìn)行轉(zhuǎn)移的編碼甲氧西林耐藥性基因盒元件（SCCmec）而產(chǎn)生[1]，是公共感染和醫(yī)院感染的最重要病原體之一，MRSA 具有異質(zhì)性和廣譜耐藥性[2]，不僅對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，而且對四環(huán)素或氟喹諾酮類、氨基糖苷類抗生素也有耐藥性，臨床上通常用萬古霉素作為經(jīng)典治療手段，同時也認(rèn)為萬古霉素是治療金黃色葡萄球菌感染的“最后防線”[3]，但是國外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌，所以尋找新型抑菌藥或抑菌策略依舊刻不容緩，許多文獻(xiàn)報道含有黃酮類、生物堿類、多酚類、蒽醌類和有機酸類等天然產(chǎn)物具有抗耐藥菌活性[4]，應(yīng)用天然產(chǎn)物含有的化學(xué)物質(zhì)作為抗生素增效劑以提升抗生素效用，減緩耐藥性細(xì)菌傳播或降低耐藥性，已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究熱點。本研究收集2020—2022 年永康市第一人民醫(yī)院就診患者中分離的金黃色葡萄球菌株，了解其耐藥情況，篩選不同中草藥對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，以期獲得一種對金黃色葡萄球菌抑菌效果好的中藥，為后期天然植物抑菌藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑 收集2020 年10 月—2022 年9 月分離自永康市第一人民醫(yī)院就診患者的794 株金黃色葡萄球菌，-70 ℃保存，質(zhì)控菌金黃色葡萄球菌ATCC25923 購自國家衛(wèi)生部臨床檢驗中心，MSSA 和MRSA 菌株來自于永康市第一人民醫(yī)院-70 ℃保存的細(xì)菌室。

1.2 菌株分離鑒定與藥敏試驗 樣本按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進(jìn)行分離、培養(yǎng)和鑒定，使用法國生物梅里埃公司的VITTEK MS 質(zhì)譜儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定和VITEK 2 Compact 全自動微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行藥敏試驗，藥敏結(jié)果根據(jù)CLSI M100 進(jìn)行折點判斷。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 WHONET 5.6 統(tǒng)計方法分析金黃色葡萄球菌分布和耐藥情況。數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，3 組以上比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 體外抑菌活性實驗

1.4.1 菌懸液配制 取出在-70 ℃冰箱凍存的菌株，接種于血瓊脂培養(yǎng)基，在35 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，待長出單個菌落后，用無菌接種環(huán)挑取單個菌落于0.45%氯化鈉溶液中，配制菌液濃度為1.0×108CFU/mL。

1.4.2 實驗試劑及設(shè)備 試劑：二甲基亞砜（西隴科學(xué)股份，批號200314）；無水乙醇（無錫市晶科化工，批號20190701）；慶大霉素藥敏紙片（英國OXOID 公司，批號20142405149）；環(huán)丙沙星藥敏紙片（杭州濱和微生物試劑，批號20172400206）；MH培養(yǎng)基（鄭州安圖生物，批號20220415B）；Mueller-Hinton Broth（溫州市康泰生物，批號VG2308G）。設(shè)備：GZX-GFC101-2-BS 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博泰實驗設(shè)備）；SB-1300 型恒溫水浴鍋（上海愛郎儀器）；N-1300 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛郎儀器）；生化培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)）；電控高溫接種滅菌鍋（天津開發(fā)區(qū)合普工貿(mào)）；生物安全柜（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)）；梅里埃公司的VITTEK MS 質(zhì)譜儀；梅里埃公司VITEK 2 Compact 全自動微生物分析系統(tǒng)。

1.4.3 中草藥鑒定 7 種中草藥由湖南中醫(yī)藥大學(xué)周旭東教授鑒定，采購于上?？禈蛑兴庯嬈邢薰尽Ｆ渲?，連翹產(chǎn)自山西（批號：220205），金銀花產(chǎn)自山東（批號：220129），廣藿香產(chǎn)自廣西（批號：220111），黃芩產(chǎn)自吉林（批號：220213），黃連產(chǎn)自四川（批號：220215），杜仲產(chǎn)自湖北（批號：220207），對節(jié)白蠟樹來源于湖北荊州（批號：220212）。

1.4.4 提取方法 文獻(xiàn)報道7 種中草藥均具有體外抗金黃色葡萄球菌作用，中草藥中含有香豆素類、木脂類、環(huán)烯醚萜類、苯乙醇苷類、黃酮類、甾醇及三萜類等[4-7]成分，所以選擇提取揮發(fā)物、水提液和有機物提取液進(jìn)行實驗效果比較。揮發(fā)油制備：稱取中草藥粉末100 g 于圓底燒瓶中，加入300 mL蒸餾水，浸泡1 h 后，使用揮發(fā)油提取器回流提取約3 h 至不再有揮發(fā)油增加，所得揮發(fā)油于4 ℃保存?zhèn)溆?。水提物制備：稱取100 g 中草藥粉末加入300 mL蒸餾水，浸泡1 h 后煎煮，煮沸后文火煎1 h，4 層紗布初步過濾后，重復(fù)操作2 次，濾液合并后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干膏，放入真空干燥機凍干成粉，備用。有機物提取物制備：根據(jù)文獻(xiàn)報道[8]及前期對乙醇和二甲基亞砜實驗數(shù)據(jù)顯示，15%濃度的二甲基亞砜作為溶劑，對菌株干擾最低，同時對中草藥抑菌活性成分提取效果最佳，故取100 g 中草藥粉末于300 mL 15%濃度二甲基亞砜溶液中，浸泡1 h 后回流提取1 h，4 層紗布過濾后重復(fù)操作2 次，濾液合并后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干膏，放入真空干燥機凍干成粉，備用。

1.4.5 K-B 紙片擴散法藥敏實驗 實驗菌株為金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（編號為ATCC29213）、MSSA 和MRSA。參照美國CLSI 抗菌藥物敏感試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，水提物、有機物提取物以相同試劑將凍干粉配置成100 mg/mL 母液，揮發(fā)物使用原液進(jìn)行試驗，每個紙片直徑6 mm，定量載樣20 μL，以相同溶劑制備紙片作為陰性對照，待紙片晾干后備用，陽性對照選用環(huán)丙沙星和慶大霉素，35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h 測量抑菌圈直徑，判斷標(biāo)準(zhǔn)：無抑菌性（6 mm），中度敏感（7～10 mm），高度敏感（＞10 mm），每組實驗重復(fù)3 次。

1.4.6 提取物濃度對金黃色葡萄球菌株抑菌活性的影響 中草藥水提物用超純水稀釋，有機物提取物以15%二甲基亞砜稀釋，通過實驗初步獲得提取物較低抑菌濃度進(jìn)行最低抑菌濃度（MIC）實驗，水提物、有機物提取物濃度范圍按照1.4.4 方法配制為6.25 mg/mL、12.5 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL、100 mg/mL，以溶劑為陰性對照，實驗重復(fù)3 次。

1.4.7 微量肉湯稀釋法藥敏實驗 選取慶大霉素作為陽性對照，對萃取組分進(jìn)行MIC 測定，同時選用醫(yī)院分離的10 株MRSA 作為測試菌，以驗證對節(jié)白蠟樹有機物提取物對本地MRSA 的抑菌效果，以15%二甲亞砜為溶劑將提取物配制成濃度為5 120 μg/mL 儲備液，超純水將慶大霉素配制成濃度為1 024 μg/mL 儲備液，96 孔板首孔分別加入200 μL藥物，第2～第10 孔分別加入100 μL MH 肉湯培養(yǎng)基（MHB）肉湯，第11 孔加入200 μL 菌液作為菌液對照，第12 孔加入200 μL MHB 肉湯作為陰性對照，第1 ～第10 列的提取物最終濃度配制成5 120 μg/mL、2 560 μg/mL、1 280 μg/mL、640 μg/mL、320 μg/mL、 160 μg/mL、 80 μg/mL、 40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL，抗生素第1～第10 列的終濃度分別為256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL。放置35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～24 h 后獲得最低濃度即為化合物的MIC 值。

2 結(jié)果

2.1 永康市MSSA 及MRSA 分布情況 見表1。共檢出MSSA 和MRSA 合計794 株，其中MSSA 檢測出586 株，占比73.80%，MRSA 檢測出208 株，占比26.20%，均以痰液檢出占比最多，其次是分泌物、膿液、血液。

表1 永康市MSSA 及MRSA 分布情況

2.2 MRSA 及MSSA 對常見抗菌藥物耐藥情況 見表2。MRSA 對青霉素G、苯唑西林完全耐藥，對紅霉素、克林霉素耐藥率較高，對替加環(huán)素萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺完全敏感，對利福平、復(fù)方新諾明、莫西沙星和慶大霉素敏感率均大于80%。MSSA 對青霉素G 和紅霉素耐藥率較高，對苯唑西林、替加環(huán)素萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺完全敏感，對利福平、復(fù)方新諾明、莫西沙星、左旋氧氟沙星和慶大霉素敏感率均大于90%。

表2 MRSA 及MSSA 對常見抗菌藥物耐藥情況 %

2.3 7 種中草藥對金黃色葡萄球菌抑菌活性情況見表3。紙片擴散法是指藥物經(jīng)過瓊脂擴散分布在培養(yǎng)基表面，紙片周邊形成無菌落或少量菌落生長的透明半徑圈，據(jù)此粗略判斷受試藥物的抑菌效果，7 種中藥的水提物和有機物提取物均對3 種金黃色葡萄球菌抑菌效果，其中，有機物提取物中對節(jié)白蠟樹對金黃色葡萄球菌、MSSA 和MRSA 的抑菌效果最好，其余中草藥的有機物提取物及水提物抑菌效果較對節(jié)白蠟樹差，所以，本研究選擇對節(jié)白蠟樹水提物和有機物提取物作為MSSA 和MRSA 實驗的主要研究對象，以驗證對節(jié)白蠟樹在MSSA 和MRSA中的抑菌效果。

表3 7 種中草藥對金黃色葡萄球菌抑菌活性情況（） mm

表3 7 種中草藥對金黃色葡萄球菌抑菌活性情況（） mm

注：①與相同提取方法的其他中草藥比較，P＜0.05；②與同草藥水提物比較，P＜0.05

中草藥名稱連翹金銀花廣藿香黃芩黃連杜仲對節(jié)白蠟樹慶大霉素環(huán)丙沙星陰性對照金黃色葡萄球菌MSSA MRSA水提物7.23±0.03 8.71±0.37 7.12±0.48 9.75±0.39①8.36±0.36 8.49±0.47 9.46±0.54①20.72±0.27 20.35±0.78 6有機物提取物7.83±0.76 7.34±0.20 9.44±0.61 9.33±0.30 10.38±0.56 9.58±0.06 12.26±0.76①②23.76±0.85 21.35±0.18 6揮發(fā)油6 7.51±0.69揮發(fā)油揮發(fā)油6 6 6 6 6---水提物7.08±0.32 7.16±0.57 7.12±0.48 8.43±0.81 8.14±0.25 8.22±0.30 9.15±0.24①20.22±0.34 19.79±0.81 6有機物提取物7.46±0.11 7.55±0.63 8.58±0.09 8.76±0.18 9.08±0.40 9.17±0.17 10.45±0.66①②22.36±0.55 22.67±0.40 6 6 6 6 6 6 6 6 7.33±0.05 7.98±0.15 6 7.05±0.98---水提物6 7.76±0.62 7.66±0.33 7.58±0.21 8.12±0.59 7.19±0.50 8.83±0.48①19.38±0.79 19.19±0.28 6有機物提取物7.64±0.47 7.45±0.63 7.67±0.29 8.69±0.45 8.18±0.42 8.55±0.11 10.02±0.33①②20.76±0.92 20.77±0.09 6 6 6 6---

2.4 對節(jié)白蠟樹提取物濃度對MSSA 及MRSA 抑菌效果 見表4。對節(jié)白蠟樹水提物及有機物提取物對MSSA 和MRSA 抑菌圈大小隨著提取物濃度升高而增大，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中，有機物提取物對MRSA 抑菌效果好于水提取物，進(jìn)一步證明對節(jié)白蠟樹對MSSA 和MRSA 均有抑菌效果，并且有機物提取物工藝更具有研究價值。

表4 對節(jié)白蠟樹提取物濃度對MSSA 及MRSA 抑菌效果（）mm

表4 對節(jié)白蠟樹提取物濃度對MSSA 及MRSA 抑菌效果（）mm

注：①與相同菌株的對應(yīng)濃度水提物比較，P＜0.05

MRSA 7.59±0.26 8.63±0.74 8.71±0.28 9.33±0.21 11.78±0.50 12.35±0.74 7.39±0.46①8.90±0.62①9.55±0.24①9.79±0.22①10.86±0.76①13.82±0.51①6提取物種類水提取物有機物提取物濃度（mg/mL）6.25 12.5 25 50 75 100 6.25 12.5 25 50 75 100陰性對照MSSA 7.35±0.54 7.07±0.42 8.78±0.45 10.32±0.93 10.36±0.11 11.63±0.62 7.57±0.16①7.83±0.40①8.44±0.18①9.39±0.17①10.32±1.09 10.65±0.94①6

2.5 對節(jié)白蠟樹提取物對MSSA 及本地檢出10 株MRSA 的MIC 測定 見表5。為了進(jìn)一步驗證對節(jié)白蠟樹對本地區(qū)檢出的MRSA 抑菌效果，隨機選取10 株MRSA 作為研究對象，采用對節(jié)白蠟樹提取物檢測其MIC，實驗結(jié)果顯示，對節(jié)白蠟樹有機物提取物對MSSA 和10 株本地區(qū)篩選的MRSA 均具有良好抑菌效果，MIC 值在640 μg/mL～1 280 μg/mL之間。

表5 對節(jié)白蠟樹提取物對MSSA 及本地檢出10 株MRSA 的MIC 測定 μg/mL

3 討論

隨著抗菌藥物的濫用，致病菌的耐藥性不斷升高，日本和美國先后發(fā)現(xiàn)了對萬古霉素不敏感金黃色葡萄球菌株[9]。選擇有效的新型藥物或者方法控制MRSA 感染是當(dāng)前眾多學(xué)者關(guān)注的焦點之一，據(jù)統(tǒng)計，僅2016—2019 年已發(fā)現(xiàn)包含微生物、海洋生物和植物來源的256 種生物具有抗菌活性[10]。有文獻(xiàn)報道，連翹、金銀花、杜仲、藿香、黃芩和黃連等中草藥具有較好的抗MRSA 活性[11-12]。對節(jié)白蠟樹屬木犀科梣屬植物，落葉大喬木，是珍貴的藥材樹種，在我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥中多以其樹皮入藥稱為秦皮，主要功效為清熱燥濕、收澀、明目，用于熱痢、泄瀉[13]。目前研究報道花白蠟樹、大葉白蠟樹、秦嶺白蠟樹和苦櫪白蠟樹等植物提取物均具有體外抗菌、抗氧化、抗光照損傷、抗病毒等藥理活性[14-15]。王蕾等[16]研究發(fā)現(xiàn)秦皮乙素對肺炎克雷伯菌具有良好的體外抗菌效果，陳鵬舉等[17]研究報道秦皮水提物與部分抗菌藥聯(lián)合使用對含fosA3 大腸桿菌具有更好地抑菌效果，但是目前較少有關(guān)于對節(jié)白蠟樹體外抑菌效果研究的報道，本研究通過對幾種中藥抑菌效果的比較，選取對金黃色葡萄球菌具有良好抑菌效果的中草藥作為研究對象進(jìn)行研究。

永康市金黃色葡萄球菌感染樣本來源最多的是痰液，與陳興英等[18]和謝紅意等[19]報道的痰液占比最多一致，因為金黃色葡萄球菌普遍存在于鼻咽及皮膚表面，最容易引起呼吸道感染；其次是分泌物、膿液和血液，這可能由于外科手術(shù)等侵入性操作中導(dǎo)致患者黏膜受到損傷，細(xì)菌趁機侵入而導(dǎo)致感染有關(guān)；MRSA 對青霉素G、苯唑西林完全耐藥，對紅霉素、克林霉素耐藥率較高，對替加環(huán)素、萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺完全敏感；MSSA 對青霉素G 和紅霉素耐藥率較高，對苯唑西林、替加環(huán)素、萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺完全敏感，說明本地區(qū)未出現(xiàn)對萬古霉素和利奈唑胺耐藥的金黃色葡萄球菌，萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺仍然可以作為治療MSSA 和MRSA 感染的首選藥物，但是在高劑量使用時必須嚴(yán)密監(jiān)測肝腎功能等生化檢測指標(biāo)，以保證治療安全[20]。

我國有悠久的中藥使用歷史，越來越多的中藥活性成分被發(fā)掘和利用，本研究團(tuán)隊通過前期文獻(xiàn)查詢[11-12]，選擇連翹、金銀花、杜仲、藿香、黃芩、黃連和對節(jié)白蠟樹，均通過水提、有機物提取和揮發(fā)物提取法獲得其提取物進(jìn)行體外抑菌實驗，實驗結(jié)果表明，7 種中草藥的水提物和有機物提取物均具有抑菌效果，但是對金黃色葡萄球菌抑菌效果最好的水提物和有機物提取物均是對節(jié)白蠟樹，并且有機物提取物效果更好，可能與文獻(xiàn)報道從對節(jié)白蠟樹活性部位分離得到多個單體化合物，如五環(huán)三萜類化合物等，具有抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)血糖和降血壓等藥理作用[21-22]有關(guān)；對節(jié)白蠟樹有機物提取物對MSSA 和MRSA 的抑菌濃度表明，對節(jié)白蠟樹有機物提取物在較低濃度（6.25 mg/mL）下對MSSA 和MRSA均具有抑菌效果；進(jìn)一步通過對節(jié)白蠟樹提取物對MSSA 和本地檢出10 株MRSA 進(jìn)行MIC 測定研究，得出對節(jié)白蠟樹提取物不僅對金黃色葡萄球菌ATCC29213 具有抑菌效果，而且對MSSA 和MRSA也具有較好的抑菌效果，但是具體的抑菌活性成分和抑菌機制需要進(jìn)一步研究確定。

綜上所述，永康市金黃色葡萄球菌樣本主要來源痰液、分泌物、膿液和血液，MRSA 對青霉素G、苯唑西林完全耐藥，對紅霉素、克林霉素耐藥率較高，對替加環(huán)素、萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺完全敏感；MSSA 對青霉素G 和紅霉素耐藥率較高，對苯唑西林、替加環(huán)素、萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺完全敏感，萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺可以作為治療MSSA 和MRSA 感染首選藥物，7 種中草藥提取物體外抑菌效果實驗表明對節(jié)白蠟樹有機物提取物對MSSA 和MRSA 均具有較好的抑菌效果，該種中草藥可能具備作為新型抑菌藥物進(jìn)一步探討開發(fā)的價值。