苗藥五藤膏外敷對膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨GSK-3β、Notch4表達(dá)的影響

王顏君,周 靜,馬武開,范紅芬,韓 珊,盧林菊

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,貴州 貴陽 550001)

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(KOA)是以關(guān)節(jié)軟骨退變和骨質(zhì)硬化、增生為特征的慢性、進(jìn)展性、退行性關(guān)節(jié)病,表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、功能障礙等,若不及時治療,可能會導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形甚至關(guān)節(jié)功能喪失,給患者、家庭及社會造成沉重的負(fù)擔(dān)[1]。KOA的病因至今尚不清楚,治療目的在于減輕炎癥反應(yīng),緩解關(guān)節(jié)疼痛,改善關(guān)節(jié)功能,治療措施主要包括藥物治療、物理治療以及手術(shù)治療等。近年來分子生物學(xué)的深入研究發(fā)現(xiàn),Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是調(diào)控骨生長和骨骼代謝的關(guān)鍵信號通路,其下游靶點(diǎn)糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)的活性影響成骨細(xì)胞分化和凋亡,在KOA發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[2-3];Notch信號通路參與骨代謝,能調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞生長與分化,維持軟骨細(xì)胞的形態(tài)及平衡軟骨基質(zhì)代謝[4-5]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),苗藥五藤膏治療KOA能減輕患者的關(guān)節(jié)疼痛和僵硬癥狀,改善關(guān)節(jié)功能和活動度,同時中藥外治不良反應(yīng)較小[6]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上,通過觀察苗藥五藤膏外敷對兔KOA關(guān)節(jié)軟骨組織中GSK-3β、Notch4表達(dá)的影響,旨在探討苗藥五藤膏治療KOA的可能作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 選取由貴州中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供的新西蘭大白兔72只,4～5月齡,雌雄各半,體重2～3 kg,合格證號:SCXK(黔)2018-00012,實(shí)驗(yàn)遵循實(shí)驗(yàn)動物倫理要求。

1.2藥物 苗藥五藤膏(黑骨藤、大血藤、小花青風(fēng)藤、香血藤、絡(luò)石藤研成粉,與凡士林按1∶1配比調(diào)制,由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科提供,黔藥制字Z20120072),氟比洛芬巴布膏(日本三笠制藥株式社會)。

1.3主要試劑及實(shí)驗(yàn)儀器 RIPA裂解液(碧云天),BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天),兔多抗GAPDH(杭州賢至生物有限公司),兔多抗GSK-3β(LSBio),兔多抗Notch4(Invitrogen),蛋白Marker(海利克思),微量移液器(Eppendorf),磁力攪拌器(江蘇省金壇市中大儀器廠),離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法,將72只家兔分為空白組、模型組、巴布膏組、苗藥五藤膏高劑量組、苗藥五藤膏中劑量組及苗藥五藤膏低劑量組,每組12只。除空白組正常飼養(yǎng)外,其余組兔均采用經(jīng)典的木瓜蛋白酶膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射方法建立KOA模型[7],即在第1,4,7天分別于兔右膝關(guān)節(jié)注射0.3 mL木瓜蛋白酶生理鹽水溶液(含4%蛋白酶),飼養(yǎng)4周。造模后第5周開始,空白組和模型組每日用無菌紗布包扎右膝關(guān)節(jié)4 h,連續(xù)4周;巴布膏組將巴布膏(約2 g)剪至40 mm×30 mm大小,直接貼敷于兔右膝關(guān)節(jié)4 h,苗藥五藤膏低、中、高劑量組分別將約1 g、2 g、4 g的苗藥五藤膏均勻涂抹于紗布上制成的貼膏(貼膏面積大小分別為20mm×30mm、40 mm×30 mm、80 mm×30 mm)直接貼敷于兔右膝關(guān)節(jié)4 h,均1次/d,連續(xù)干預(yù)4周。家兔藥物使用劑量均與人體等效劑量相當(dāng)[8],同時為防止藥物掙脫,各藥物組均用繃帶包扎固定。

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1軟骨病理學(xué)形態(tài) 干預(yù)結(jié)束后,采用空氣栓塞法處死各組兔,從右側(cè)膝關(guān)節(jié)處剝除皮膚,取出右側(cè)股骨內(nèi)髁頂點(diǎn)鈣化層以上的軟骨,經(jīng)甲醛固定、硝酸脫鈣、石蠟包埋處理后,將病理標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)切片,放入60 ℃烤箱烤片3 h,脫蠟后用蘇木素-伊紅(HE)染色,觀察并記錄各組病理標(biāo)本的形態(tài)。參照改良版Mankin關(guān)節(jié)軟骨病理評分[9],對軟骨病理情況進(jìn)行評估。

1.5.2關(guān)節(jié)軟骨組織中GSK-3β、Notch4蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測:按照說明書要求在EP管中加入剪碎的軟骨組織、鋼珠及裂解液(含2 μL PMSF、2 μL磷酸酶抑制劑)進(jìn)行勻漿、裂解、離心,將蛋白樣品(經(jīng)PBS稀釋20倍)、標(biāo)準(zhǔn)品(經(jīng)BSA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋)及BCA試劑盒中的混合液(A液和B液按50∶1比例混合)依次加入96孔板內(nèi),37 ℃避光孵育后,用酶標(biāo)儀(DG-3022A)測定OD值(OD568),按OD值和標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度通過直線回歸擬合算出蛋白樣品濃度,再利用BandScan分析膠片灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理形態(tài) 光鏡下見空白組關(guān)節(jié)軟骨表面平整光滑,結(jié)構(gòu)清楚,潮線清晰,無變性或萎縮;模型組關(guān)節(jié)軟骨表面凹凸不平,結(jié)構(gòu)模糊,潮線難以識別,發(fā)生重度變性、萎縮;各藥物組軟骨組織破壞程度較模型組輕,其中苗藥五藤膏高劑量組關(guān)節(jié)軟骨表面更為光滑平整,結(jié)構(gòu)更加清晰,潮線識別度更高,僅發(fā)生輕度的變性、萎縮,而苗藥五藤膏低、中劑量組及巴布膏組均伴有不同程度的關(guān)節(jié)腫脹和滑膜充血,結(jié)構(gòu)層次較為模糊,個別潮線識別度不清,發(fā)生中度變性、萎縮。見圖1。

圖1 空白組和膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎各組兔關(guān)節(jié)軟骨組織病理形態(tài)(HE染色,×200)

2.2各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織Mankin評分 模型組Mankin評分為(12.30±1.25)分,明顯高于空白組的(0.90±0.74)分(P<0.05);巴布膏組及苗藥五藤膏低、中、高劑量組Mankin評分分別為(4.70±0.82)分、(7.80±0.63)分、(4.80±0.63)分、(3.40±0.70)分,均明顯低于模型組(P均<0.05),且苗藥五藤膏高劑量組均明顯低于其他藥物組(P均<0.05),巴布膏組、苗藥五藤膏中劑量組均明顯低于苗藥五藤膏低劑量組(P均<0.05)。

2.3各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中GSK-3β、Notch4蛋白表達(dá)情況 模型組GSK-3β、Notch4蛋白相對表達(dá)量均明顯高于空白組(P均<0.05);各藥物組GSK-3β、Notch4蛋白相對表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05);各藥物組間GSK-3β蛋白相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);巴布膏組和苗藥五藤膏高劑量組Notch4蛋白相對表達(dá)量均明顯低于苗藥五藤膏低、中劑量組(P均<0.05)。見圖2及表1。

表1 空白組和膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎各組兔關(guān)節(jié)軟骨組織中GSK-3β、Notch4蛋白相對表達(dá)量比較

圖2 空白組和膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎各組兔關(guān)節(jié)軟骨組織中GSK-3β、Nocch4蛋白表達(dá)條帶

3 討 論

OA屬中醫(yī)學(xué)“骨痹”“痹證”等范疇,在苗醫(yī)學(xué)中稱為“冷骨風(fēng)”。苗醫(yī)認(rèn)為“冷骨風(fēng)”是冷風(fēng)毒壅塞筋脈所致,治宜通筋活血。苗藥五藤膏是貴州民族民間外用經(jīng)驗(yàn)方,方中黑骨藤為君藥,有祛風(fēng)通絡(luò)、止痛的功效,現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有抑制炎癥反應(yīng)、緩解疼痛、抗氧化及提高免疫力等作用[10];小花青風(fēng)藤和香血藤祛風(fēng)除濕、通經(jīng)活絡(luò),為臣藥;佐藥為大血藤、絡(luò)石藤,能溫經(jīng)通絡(luò)、利關(guān)節(jié);少許冰片作為使藥,起到透邪、透皮的作用并促進(jìn)藥物吸收;諸藥合用,共奏通筋散血之功。前期申海艷等[11]實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),苗藥五藤膏能通過調(diào)控Wnt信號通路,促進(jìn)KOA兔患膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá),下調(diào)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Wnt信號下游基因基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)、原癌基因(c-myc) mRNA的表達(dá)而延緩病情進(jìn)展。

現(xiàn)代研究認(rèn)為,骨關(guān)節(jié)炎是由于關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、軟骨外基質(zhì)及軟骨下骨質(zhì)的合成和降解失衡所致,而軟骨和軟骨下骨改變是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的關(guān)鍵因素。在疾病進(jìn)展中,Wnt信號活性變化可能會影響軟骨下骨生長板的破骨活性,導(dǎo)致關(guān)節(jié)邊緣硬化或骨贅形成[12]。β-catenin是Wnt信號通路中的重要調(diào)控因子,在軟骨細(xì)胞分化、成熟和凋亡中起關(guān)鍵作用,存在于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)[13]。Wnt/β-catenin通路的活性受β-catenin表達(dá)水平的影響,研究發(fā)現(xiàn)β-catenin在KOA患者關(guān)節(jié)軟骨組織中過度表達(dá)[14]。而β-catenin的表達(dá)受由軸蛋白(Axin)、酪蛋白激酶1α(CK1α)及GSK-3β等所組成的降解復(fù)合物調(diào)節(jié),其中GSK-3β在機(jī)體受外源性刺激后失活,導(dǎo)致β-catenin無法磷酸化,細(xì)胞質(zhì)中β-catenin蛋白積聚被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核,并與轉(zhuǎn)錄因子淋巴增強(qiáng)因子(LEF)-1/T細(xì)胞因子(TCF)結(jié)合激活其下游靶基因轉(zhuǎn)錄[15]。因此GSK-3β既為Wnt/β-catenin通路的重要負(fù)調(diào)控因子,又是Axin的關(guān)鍵組成部分[16],其活性能維持軟骨細(xì)胞的完整性和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,苗藥五藤膏中、高劑量組的軟骨破壞較輕;各藥物組GSK-3β蛋白相對表達(dá)量均明顯低于模型組,各藥物組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示苗藥五藤膏可下調(diào)GSK-3β蛋白表達(dá)水平,抑制Wnt信號通路的活化,減少下游炎癥因子表達(dá),從而減輕關(guān)節(jié)軟骨損傷。

Notch信號通路不僅與軟骨細(xì)胞的增殖、分化密切相關(guān),還參與軟骨的發(fā)生、發(fā)育,其配體的過度表達(dá)可能會損害破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞前體,從而阻礙細(xì)胞分化[17-19]。相關(guān)研究顯示,Notch信號通路通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和炎癥因子影響關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的穩(wěn)定性,并在骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展過程中起雙重調(diào)節(jié)作用[20-21]。盡管Notch信號通路在KOA中的作用機(jī)制尚未闡明,但相關(guān)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)Notch1和Notch4蛋白處于異常激活狀態(tài)時,Notch信號能連續(xù)刺激巨噬細(xì)胞釋放炎性因子,引起骨代謝紊亂和骨贅增加[22-23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組Notch4蛋白相對表達(dá)量明顯高于空白組,由此推測Notch信號通路中Notch4受體蛋白表達(dá)水平與KOA的發(fā)生發(fā)展有密切的聯(lián)系;苗藥五藤膏各組Notch4蛋白相對表達(dá)量均明顯低于模型組,說明苗藥五藤膏可通過抑制軟骨組織中Notch4蛋白表達(dá),減輕炎癥反應(yīng)并抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述,苗藥五藤膏可延緩KOA軟骨退變及病情進(jìn)展,其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin和Notch信號通路,抑制GSK-3β和Notch4蛋白表達(dá)相關(guān),未來還需對Wnt/β-catenin和Notch信號通路確切的作用機(jī)制進(jìn)行更深入的探索。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。