鎂合金外支架輔助自體牙異位移植

常乾 沈圓 朱可石 李濤 任利玲

[摘要]目的：探索微弧氧化處理的鎂合金支架輔助自體牙異位移植的可行性。方法：拔除9只雌性比格犬（9～11 kg）的左下頜第二前磨牙、左下頜第三前磨牙和右下頜第二前磨牙，截冠得犬牙根，3Shape掃描形態(tài)制作微弧氧化鎂合金支架并裝配自體牙根，3個(gè)月后植入牙槽窩，同時(shí)植入1個(gè)鈦合金種植體和自體牙根進(jìn)行對(duì)照；植入后3、6、12個(gè)月分三批處死實(shí)驗(yàn)犬，每批3只。截取骨組織標(biāo)本進(jìn)行Micro-CT掃描、切片VG染色觀察。結(jié)果：Micro-CT結(jié)果顯示，鎂合金支架組成骨效果在各時(shí)間點(diǎn)均優(yōu)于鈦合金組和自體牙組。VG染色結(jié)果可見(jiàn)，無(wú)論是在哪個(gè)時(shí)間點(diǎn)，鎂合金支架組的骨接觸率均高于鈦合金種植體組，自體牙組最低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：與自體牙移植和鈦合金種植體相比，鎂合金支架輔助的自體牙異位移植可以有效促進(jìn)機(jī)體形成新骨，有利于提高移植牙的初期穩(wěn)定性。

[關(guān)鍵詞]鎂合金；自體牙異位移植；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；牙種植體；微弧氧化；支架

[中圖分類號(hào)]R783.1? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2023）08-0024-05

Magnesium Alloy Stent Assited Autologous Tooth Transplantaion

CHANG Qian1，SHEN Yuan1，ZHU Keshi1，LI Tao2，REN Liling1

（1.Department of Orthodontics，Hospital of Stomatology Lanzhou University，Lanzhou 730000，Gansu，China; 2.Lanzhou University，Lanzhou 730000，Gansu，China）

Abstract： Objective? This work aims to explore the feasibility of tooth heterotopic transplantaion with micro-arched oxide processed magnesium scaffold. Methods? The left mandibular second premolars， the left mandibular third premolars and the right mandibular second? premolars of 9 Beagle canine teeth were extracted， then cutting the tooth crowns. The 3Shape scanning morphology was used to make micro-arc magnesium oxide alloy brackets and assemble the autogenous roots. Three months later， they were implanted into the alveolar socket， and a titanium alloy implant and an autogenous root were implanted for comparison. The dogs were killed in three batches at 3， 6 and 12 months after implantation. The bone samples were cut for Micro-CT scanning and VG staining of sections for observation. Results? The results of micro-CT indicated that The bone composition of magnesium alloy stents is better than titanium alloy group and autologous tooth group at all time points.The result of VG staining indicated that the bone-implant contact of the magnesium alloy group was higher than that of the titanium implant group at any time point， and the autogenous tooth group was the lowest， the difference was statistically significant （P＜0.05）. Conclusion? Compared with autologous tooth heterotopic transplantation and titanium alloy implants， magnesium alloy scaffold assisted tooth transplantation can effectively promote the formation of new bone in the body， which is beneficial to improve the initial stability of the transplanted tooth.

Key words： magnesium alloy; tooth heterotopic transplantaion; animal experiment; dental implant; micro-arc oxidation; stent

自體牙移植（Autotransplantation of teeth，ATT）具有優(yōu)良的生物相容性，但是供體牙與植入?yún)^(qū)人工預(yù)備牙槽窩匹配度差是影響自體牙移植成功率的重要影響因素[1-2]。同時(shí)，也極大地限制了牙移植技術(shù)的臨床應(yīng)用。因此，如何提高供體牙與植入?yún)^(qū)人工預(yù)備牙槽窩匹配度，成為牙移植技術(shù)的一個(gè)研究發(fā)展方向。

鎂及其合金是新型生物醫(yī)用材料，與廣泛應(yīng)用于臨床種植的鈦合金相比，鎂合金在力學(xué)性（彈性模量、密度與人體骨組織更接近）、生物相容性及促進(jìn)新骨形成[3]方面更加適合作為種植體材料。然而，鎂合金在體內(nèi)腐蝕速率較高，限制了其在體內(nèi)的應(yīng)用。經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)440 V電壓微弧氧化處理的AZ31B鎂合金具有長(zhǎng)期耐腐蝕性的優(yōu)點(diǎn)[4]，且其降解后有助于成骨細(xì)胞的分化[5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立比格犬牙缺失模型，在其牙槽窩中植入裝配有微弧氧化鎂合金支架的自體牙，同時(shí)植入鈦合金種植體和自體牙作為對(duì)照，評(píng)價(jià)鎂合金支架輔助自體牙移植的可行性，以期為臨床提高自體牙異位移植成功率提供新的思路。

1? 材料和方法

1.1 研究材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用9只健康雌性比格犬（西安迪樂(lè)普生物醫(yī)學(xué)有限公司，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物符合國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要求），體重9～10 kg，年齡為12個(gè)月，隨機(jī)編號(hào)為1～9號(hào)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委托中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸藥與畜牧研究所飼養(yǎng)。所有犬均采用籠中獨(dú)立圈養(yǎng)的方法，定時(shí)、定量攝食，自由飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要儀器試劑：立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX-30KBS，上海申安醫(yī)療器械廠）、種植機(jī)（CHIROPRO 980，Bien Air.Swiss）、萊卡轉(zhuǎn)輪式硬組織切片機(jī)（Leica SP1600，Saw Microtome，Germany）、萊卡磨片機(jī)（Leica SP2600，Polycut Ultramiller，Germany）、Micro-CT掃描（由西安交通大學(xué)提供）WHYH-100A型設(shè)備（北京師范大學(xué)核學(xué)院）、AZ31B鎂合金（寶雞鈦液有限公司）、鈦合金種植體（OSSTEM TSⅡ，韓國(guó)）、獸用陸眠寧（西安迪樂(lè)普生物醫(yī)學(xué)有限公司）、獸用陸醒寧（西安迪樂(lè)普生物醫(yī)學(xué)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 犬牙缺失模型的建立：本實(shí)驗(yàn)經(jīng)蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理管理委員會(huì)論證，編號(hào)為L(zhǎng)ZUKQ-2019-040。實(shí)驗(yàn)用比格犬9只，以3%碘伏進(jìn)行麻醉術(shù)區(qū)消毒，肌肉注射陸眠寧（鹽酸塞拉嗪注射液，0.03 ml/kg）全麻，前臼齒術(shù)區(qū)注射鹽酸利多卡因（1 ml）進(jìn)行局部麻醉，微創(chuàng)拔除左側(cè)下頜第二、三前磨牙和右側(cè)下頜第二前磨牙，縫合牙齦，止血，麻醉術(shù)區(qū)注射陸醒寧（鹽酸苯噁唑0.03 ml/kg）復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)犬。拔除的犬牙經(jīng)低溫冷凍保存。所有比格犬無(wú)死亡，拔牙術(shù)區(qū)愈合情況良好，術(shù)區(qū)牙齦無(wú)紅腫，無(wú)出血，無(wú)明顯感染現(xiàn)象。拆除縫線后，亦未見(jiàn)傷口感染。所有比格犬恢復(fù)情況良好。

1.2.2 鎂合金外支架的制作：每只犬選取1顆拔除的離體牙，在無(wú)菌環(huán)境下，利用高速手機(jī)磨除離體牙牙冠部分，去除牙髓、牙周膜和頸部牙齦組織見(jiàn)圖1A，采用3shape掃描牙根形態(tài)，數(shù)據(jù)導(dǎo)入Pro/E軟件中，采用AZ31B鎂合金（化學(xué)成分見(jiàn)表1），應(yīng)用CAD/CAM系統(tǒng)加工制作個(gè)性化鎂合金外支架，并與離體牙裝配（見(jiàn)圖1B）。鎂合金外支架外形類似于牙種植體，外表面為螺紋結(jié)構(gòu)，內(nèi)表面與牙根相嵌合，利用根面倒凹固位。采用WHYH-100A型設(shè)備對(duì)鎂合金進(jìn)行微弧氧化表面處理，用不銹鋼電解池和制作完成的鎂合金支架分別作為陰極和陽(yáng)極，通過(guò)使用循環(huán)冷卻系統(tǒng)保證實(shí)驗(yàn)時(shí)電解液的溫度恒定，通常控制在35℃以下。鎂合金支架表面處理所用的電解質(zhì)是由14 g/L Na2SiO3·9H2O，4 g/L NaOH，4 g/L KF組成，處理電流為2 A，頻率為75 Hz，處理時(shí)間為20 min，處理電壓為440 V，負(fù)壓為30 V。微弧氧化處理完成后將離體牙解凍，與鎂合金外支架裝配。鎂合金外支架制作過(guò)程見(jiàn)圖1。

1.2.3 種植手術(shù)：犬牙拔除3個(gè)月后進(jìn)行種植手術(shù)，手術(shù)前對(duì)所有實(shí)驗(yàn)犬禁食水24 h。以3%碘伏進(jìn)行麻醉術(shù)區(qū)消毒，肌肉注射陸眠寧（鹽酸塞拉嗪注射液，0.03 ml/kg）進(jìn)行全麻，仰臥位固定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，口腔前磨牙術(shù)區(qū)以利多卡因/腎上腺素（1∶100 000）浸潤(rùn)麻醉。手術(shù)刀切開(kāi)分離牙齦，在標(biāo)記好的種植位點(diǎn)處分別使用引導(dǎo)鉆、先鋒鉆、擴(kuò)孔鉆逐級(jí)預(yù)備種植窩洞。預(yù)備種植窩洞時(shí)鉆速約1 200 r/min，種植窩制備過(guò)程中用大量含慶大霉素的生理鹽水沖洗冷卻。將裝配有鎂合金外支架的自體牙、鈦合金種植體以及自體牙分別植入比格犬下頜骨內(nèi)，縫合（見(jiàn)圖2）。術(shù)后連續(xù)5 d給予肌肉注射青霉素（80萬(wàn)單位/只）預(yù)防術(shù)后感染。種植手術(shù)10 d后拆除創(chuàng)口縫線。定期觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的創(chuàng)口情況及精神狀況，術(shù)后3、6、12個(gè)月分三批隨機(jī)處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，每批3只。切取帶有種植體的下頜骨標(biāo)本，大小約12 mm×8 mm×15 mm。標(biāo)本用生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛中固定48 h備用。

1.2.4 Micro-CT掃描：取包含異位移植牙、種植體和自體牙的下頜骨標(biāo)本，放入并固定在容器中校對(duì)后進(jìn)行掃描。掃描時(shí)保持牙齒長(zhǎng)軸與檢查床平行并與掃描平面垂直，掃描電壓為90 kV，電流為55.0 μA，測(cè)量區(qū)域X、Y、Z軸層厚均為12.324μm。使用VG Studio3.0軟件（Volume Graphics，德國(guó)）對(duì)骨樣本掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行三維重建。

1.2.5 含種植體不脫鈣骨磨片制備及染色：所有標(biāo)本進(jìn)行硬組織切片及染色，使用生理鹽水洗凈標(biāo)本上殘留的固定液，梯度乙醇脫水，然后在甲苯中進(jìn)行透明化處理。干燥后分別浸入浸液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各3 d，然后將樣本浸入甲基丙烯酸甲酯的容器中，將容器放入恒溫水浴箱逐漸升溫聚合直至樣品完全硬化。取出包埋有骨組織標(biāo)本的容器，冷卻后將組織塊取出。對(duì)包埋塊進(jìn)行修整，使用硬組織切片機(jī)將包埋好的組織塊沿種植體長(zhǎng)軸切開(kāi)制作含種植體的不脫鈣骨切片，每個(gè)包埋好的骨標(biāo)本切3張。然后進(jìn)行磨片染色處理，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)含種植體的不脫鈣骨磨片進(jìn)行觀察。

1.2.6 成像及種植體-骨接觸率（Bone-implant contact，BIC）檢測(cè)：使用Eclipse Ci-L拍照顯微鏡（Nikon Japan）選取組織的目的區(qū)域進(jìn)行20倍成像，成像時(shí)保證每張照片的背景光一致。成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件（Media Cybemetics U.S.A）統(tǒng)一以毫米（mm）作為標(biāo)準(zhǔn)單位，分別測(cè)量每張切片種植體-骨界面總長(zhǎng)度（Total length，TL）；測(cè)量界面種植體與骨直接接觸長(zhǎng)度（Contact length，CL）；求出骨接觸率BIC=（CL/TL）×100%[6]；

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS軟件（版本22.0，USA）進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 臨床觀察結(jié)果：整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察犬的狀況及精神情況，可見(jiàn)種植術(shù)當(dāng)天犬食欲不振，精神不佳，第2天好轉(zhuǎn)。術(shù)后傷口愈合情況良好，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物完全康復(fù)。

2.2 Micro-CT掃描結(jié)果：術(shù)后3、6、12個(gè)月Micro-CT掃描圖像可見(jiàn)鈦合金植體周圍的骨結(jié)合情況良好，并且隨著植入時(shí)間的增加，植體周圍的骨質(zhì)緩慢增加（見(jiàn)圖3A～C、見(jiàn)圖4A～C、圖5A～C）。而鎂合金組植體植入3個(gè)月時(shí)根尖周圍可見(jiàn)低密度影像，并且范圍較大；牙根周圍有少量高密度影像，說(shuō)明有骨質(zhì)形成（見(jiàn)圖3D、圖4D）。而6個(gè)月組和12個(gè)月組較三個(gè)月組低密度影像更小，高密度影像更大，說(shuō)明隨時(shí)間增加，氣體在牙槽骨內(nèi)被緩慢吸收，植體周圍骨質(zhì)逐漸增多（見(jiàn)圖3D～F、圖4D～F、圖5D～F）。自體牙組可以看出，隨著植入時(shí)間的延長(zhǎng)，牙根周圍的骨質(zhì)變化不大，并且還存在一定程度的牙根吸收（見(jiàn)圖3G～I(xiàn)、圖4G～I(xiàn)、圖5G～I(xiàn)）。

2.3 硬組織切片及染色結(jié)果：硬組織切片苦味酸-品紅染色結(jié)果見(jiàn)圖6，3個(gè)月時(shí)，鈦合金種植體周圍骨質(zhì)較少，多處種植體螺紋處沒(méi)有骨結(jié)合；鎂合金支架組牙根周圍少量骨質(zhì)，與牙根附著不緊密，牙根根方殘余大量鎂合金支架降解產(chǎn)生的疑似氣體（見(jiàn)圖6D綠色箭頭）；自體牙組根方基本沒(méi)有骨質(zhì)附著，存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。6個(gè)月時(shí)，鈦合金種植體周圍骨質(zhì)增多，多處骨質(zhì)與種植體之間存在間隙，（見(jiàn)圖6B黃色箭頭）；鎂合金支架組牙根周圍骨質(zhì)增多，附著緊密，殘余氣體減少；自體牙組牙根周圍少量骨質(zhì)，炎性細(xì)胞仍存在。12個(gè)月時(shí)，鈦合金周圍骨質(zhì)緊密，與植體間間隙變小，骨結(jié)合良好；鎂合金支架組牙根周圍骨質(zhì)繼續(xù)增多，牙根與周圍骨質(zhì)連接緊密，骨結(jié)合良好；自體牙組牙根周圍骨質(zhì)增多，炎性細(xì)胞減少。使用Image-Pro 6.0分析軟件對(duì)種植體-骨接觸界面的骨接觸率（Bone-implant contact，BIC）進(jìn)行測(cè)量（見(jiàn)圖7）?？梢?jiàn)各時(shí)間點(diǎn)鎂合金支架組的骨接觸率均高于鈦合金種植體組，自體牙組最低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3? 討論

自體牙移植是一種修復(fù)牙列缺損的外科治療方法，通過(guò)將阻生、錯(cuò)位、無(wú)功能的牙齒移植到同一個(gè)體的另一位置使其在新的牙位上生存以替代缺失牙的生理功能。自體牙移植除了恢復(fù)生理功能外，還可給予頜骨及牙槽骨相應(yīng)的刺激并保證其正常生長(zhǎng)；對(duì)于缺失或缺損的牙槽骨能產(chǎn)生功能性刺激，促進(jìn)新骨沉積，維持其完整的形態(tài)。但異位牙移植的主要問(wèn)題在于供體牙與待移植區(qū)牙槽窩形態(tài)不匹配[6]。已有研究表明，在移植手術(shù)操作過(guò)程中盡量減少對(duì)供體牙牙周膜損傷，對(duì)提高自體牙移植成功率有直接影響。一方面，供體牙與待移植區(qū)牙槽窩形態(tài)不匹配需反復(fù)多次擬合，由此會(huì)增加對(duì)于供體牙牙周膜的損傷[7]。另一方面，供體牙牙根與待植入?yún)^(qū)牙槽窩間間隙越小其愈合時(shí)間越短、愈合效果越好[8]。進(jìn)一步研究表明，當(dāng)供體牙牙根與待植入?yún)^(qū)牙槽窩間距在0.5～1 mm時(shí)最利于愈合；而當(dāng)兩者間隙大于5 mm時(shí)，會(huì)延長(zhǎng)愈合時(shí)間、增加移植失敗的概率[9]?；谝陨显颍狙芯吭O(shè)想利用一種生物可降解材料作為外支架，解決牙槽窩與供牙不匹配的問(wèn)題，同時(shí)，該材料具有適宜的力學(xué)性能、良好的生物相容性和低生物毒性，以及適合組織愈合的降解性能，以促進(jìn)移植牙的良好愈合。

生物醫(yī)用金屬材料在骨科及口腔修復(fù)領(lǐng)域至關(guān)重要。由于鎂合金相對(duì)于其他材料（例如鈦合金和不銹鋼）的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)人們對(duì)其進(jìn)行了廣泛研究[10-11]。然而，鎂合金在生理溶液中極易腐蝕，這阻礙了其安全有效地應(yīng)用于人體[12]。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，人們采用了多種方法對(duì)鎂合金進(jìn)行改性處理，其中，微弧氧化技術(shù)簡(jiǎn)單、高效、清潔，成了研究的熱點(diǎn)[13]。

本實(shí)驗(yàn)將AZ31B鎂合金表面進(jìn)行微弧氧化處理制作自體牙根支架，并將其移植到比格犬缺失牙模型上，通過(guò)Micro-CT檢測(cè)和組織學(xué)檢測(cè)觀察移植牙的愈合及成骨情況，同時(shí)植入鈦合金種植體、自體牙進(jìn)行三者對(duì)比，對(duì)鎂合金支架應(yīng)用于自體牙異位移植領(lǐng)域提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。通過(guò)Micro-CT對(duì)樣本進(jìn)行掃描重建，結(jié)果表明相較于自體牙移植和鈦合金種植體，鎂合金支架具有良好的成骨能力，但是植入前期牙根周圍仍有疑似氣體的低密度影像，說(shuō)明鎂合金支架的降解速率仍然大于比格犬機(jī)體的吸收速率，這會(huì)不會(huì)影響到組織愈合以及會(huì)不會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性還需要進(jìn)一步研究。以往研究表明，當(dāng)鎂合金的降解速率與組織愈合各階段相匹配且腐蝕方式為均勻腐蝕時(shí)，才能實(shí)現(xiàn)鎂合金植入物的可控降解[14]。組織學(xué)切片染色觀察可見(jiàn)，鎂合金支架組牙根周圍基本沒(méi)有炎性細(xì)胞聚集且牙根周圍骨量較多，可以判斷，鎂合金支架具有良好的成骨作用及保證移植牙良好的初期穩(wěn)定性的作用。模擬鎂合金外支架應(yīng)用于牙移植的三維有限元研究也得出了相同的結(jié)論[15]。另外，種植體植入后即可負(fù)載是否會(huì)影響初期穩(wěn)定性也存在爭(zhēng)議。有學(xué)者認(rèn)為種植體植入后不應(yīng)使種植體即刻負(fù)載，以順利達(dá)到良好的骨性結(jié)合[16]；而另有些學(xué)者認(rèn)為，種植體植入后即刻負(fù)載與延期負(fù)載對(duì)其長(zhǎng)期穩(wěn)定性影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[17]。本實(shí)驗(yàn)采用截冠的方法去除牙冠，使種植體不受咬合力，避免了咬合力對(duì)種植體愈合的影響，而在臨床移植牙的過(guò)程中無(wú)法去除移植牙的牙冠，這個(gè)問(wèn)題還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

由于本研究納入樣本量較少，檢驗(yàn)效能相對(duì)較低，因此后續(xù)研究將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，對(duì)鎂合金支架輔助的自體牙異位移植能更有效促進(jìn)機(jī)體形成新骨，有利于提高移植牙的初期穩(wěn)定性進(jìn)行更深入研究。

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[收稿日期]2022-09-21

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