刺梨果渣酵素復合發(fā)酵工藝優(yōu)化

陳秋慧,魏建敏,穆先,盧紅梅,楊雙全,陳莉*

(1.貴州大學 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室,貴陽 550025;2.貴州大學 釀酒與食品工程學院,貴陽 550025;3.貴州大學 化學與化工學院,貴陽 550025)

刺梨(RosaroxburghiiTratt.)又叫送春歸、茨梨,是薔薇科落葉灌木植物繅絲花的果實,適宜生長在海拔500～1 500 m的高山丘陵地帶,如中國西南地區(qū)的貴州、云南、四川等省份,其中貴州刺梨產量居全國之首[1-2]。截至2021年,作為刺梨種植大省的貴州省,其種植面積已達到210萬畝,鮮果產量達28.91萬噸。隨著國內外果蔬汁飲料逐漸向營養(yǎng)型方向轉變,刺梨因富含營養(yǎng)成為營養(yǎng)型飲料的研究熱點之一[3]。

刺梨果渣是刺梨鮮果壓榨刺梨原汁所留下的副產物,刺梨果渣含有豐富的營養(yǎng)物質[4],具有抗氧化、降血糖等功效[5-7],有很高的價值,但不易儲存,造成大量浪費且污染環(huán)境[8]。酵素因富含益生菌、脂肪酶、淀粉酶、超氧化物歧化酶和多酚、黃酮、氨基酸、有機酸等生物活性成分而在食品和健康領域受到廣泛關注[9-10]。大量研究表明,酵素具有抗氧化、抗腫瘤、解酒護肝、調節(jié)腸道菌群、減肥、抑菌等功效[11-16]。相關研究表明,酵素經發(fā)酵后不僅能大量保留發(fā)酵基質原有的營養(yǎng)物質,而且能促進多酚、黃酮等次級產物的形成,具有促進新陳代謝、抗氧化、抗疲勞等生理功能[17]。因此,本試驗以酶解后的刺梨果渣為發(fā)酵物料,采取先酵母菌發(fā)酵后植物乳桿菌發(fā)酵的方式,在單因素試驗的基礎上進行優(yōu)化試驗,探究不同因素對刺梨果渣酵素中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性及活菌數的影響,以期得到刺梨果渣酵素的最佳發(fā)酵工藝條件,為刺梨果渣的開發(fā)利用提供數據支撐。

1 材料和方法

1.1 原料

刺梨干果渣:貴州省盤州市某刺梨加工企業(yè)提供。

1.2 試劑

活性干酵母(BV818、CECA、SY、RW):安琪酵母股份有限公司;植物乳桿菌1.191:廣東省微生物菌種保藏中心;SOD試劑盒:南京建成生物工程研究所;果漿酶、氯化鈉、次甲基藍、氯化鉀、無水氯化鈣(均為分析純):成都金山化學試劑有限公司;碳酸氫鈉、葡萄糖、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、MRS肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、蔗糖:天津永大化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器與設備

FA2004N精密電子天平 上海菁海儀器有限公司;HH-B數顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;ZD-2A 自動電位滴定儀 上海大普儀器有限公司:SPX-250B生化培養(yǎng)箱 上?，槴\實驗設備有限公司;YXQ-LS-5DS11壓力蒸汽滅菌鍋、SN-CJ-IF無菌操作臺 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;TG16-WS 臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;722S可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;Smart生物顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 刺梨果渣酵素制備工藝

工藝流程圖見圖1。

圖1 工藝流程圖Fig.1 Process flow diagram

酵母菌的活化:取一定量的安琪酵母(以發(fā)酵物料的質量計),加入適量的蒸餾水,于37 ℃的恒溫水浴鍋中活化30 min后待用。

植物乳桿菌的活化:取一管于EP管中甘油保藏的植物乳桿菌37 ℃活化后,接入100 mL滅菌后的MRS肉湯培養(yǎng)基中,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后待用。

1.4.2 酵母菌發(fā)酵階段單因素試驗

采用單因素輪換法,分別考察酵母菌菌種(BV 818、CECA、SY、RW)、發(fā)酵時間(8,16,24,32,40 h)、發(fā)酵溫度(21,23,25,27,29 ℃)、糖添加量(3%、4%、5%、6%、7%)、酵母菌接種量(0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%)對SOD活性和酵母菌活菌數的影響,確定各因素的最佳值。

1.4.3 酵母菌發(fā)酵階段響應面試驗

在單因素試驗的基礎上,以發(fā)酵時間、糖添加量、發(fā)酵溫度、酵母菌接種量4個因素為研究因素,以SOD活性和酵母菌活菌數為評價指標,根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理,并采用Design Expert 8.0.6軟件進行數據分析,確定刺梨果渣酵素的最優(yōu)發(fā)酵條件。酵母菌發(fā)酵階段響應面試驗因素水平表見表1。

表1 酵母菌發(fā)酵階段響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test in yeast fermentation stage

1.4.4 乳酸菌發(fā)酵階段單因素試驗

以SOD活性和乳酸菌活菌數為評價指標,在發(fā)酵溫度37 ℃、乳酸菌接種量2%、發(fā)酵時間24 h、乳酸菌接種量2%的條件下,固定其他因素條件,確定發(fā)酵時間(8,16,24,32,40 h)、乳酸菌接種量(1%、1.5%、2%、2.5%、3%)、發(fā)酵溫度(35,36,37,38,39 ℃)等因素的最佳值。

1.4.5 乳酸菌發(fā)酵階段正交試驗

在單因素試驗的基礎上,以發(fā)酵時間、乳酸菌接種量、發(fā)酵溫度為因素,以SOD活性和乳酸菌活菌數為評價指標,設計L9(33)正交試驗,每組試驗平行測定3次,因素水平表見表2。

表2 乳酸菌發(fā)酵階段正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test in lactic acid bacteria fermentation stage

1.4.6 SOD的測定

取1.0 g發(fā)酵物料,加入4 mL pH 6.8的磷酸緩沖液于研缽中研磨1～2 min后,轉入離心管中,4 000 r/min離心10 min,取上清液參照SOD試劑盒進行測定。

1.4.7 酵母菌活菌數的測定

采用血球計數法進行測定[18]。

1.4.8 乳酸菌活菌數的測定

參照GB 4789.35-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》中的平板計數法進行測定。

1.4.9 數據處理及分析

每組試驗進行3次平行。采用Design Expert 8.0.6進行響應面試驗設計,SPSS 19.0、Excel 2010進行數據分析,Origin 2018進行作圖。

2 結果與分析

2.1 酵母菌發(fā)酵階段單因素試驗

2.1.1 酵母菌菌種及發(fā)酵時間的確定

酵母菌種類及發(fā)酵時間對SOD活性和酵母菌活菌數的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵時間對不同菌種發(fā)酵的SOD活性及酵母菌活菌數的影響Fig.2 Effect of fermentation time on SOD activity and viable number of yeast fermented with different strains注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下圖同。

由圖2可知,不同酵母菌菌種對SOD活性的影響很小,從整體來看,SOD活性與酵母菌活菌數成正比,均隨時間的增加呈先升高后降低的趨勢,這可能是因為隨著時間的增加,可利用的碳源減少,不能正常給酵母菌提供營養(yǎng)物質,從而導致酵母菌活菌數減少。當以SOD活性作為評價指標時,菌種RW在發(fā)酵時間為24 h時達到最大值261.22 U/g,此時酵母菌活菌數為1.24×108CFU/g;當以酵母菌活菌數為評價指標時,菌種CECA在發(fā)酵時間為24 h時達到最大值1.30×108CFU/g,此時SOD活性為259.67 U/g。綜合考慮,選擇菌種CECA進行發(fā)酵,取發(fā)酵時間16～32 h進行后續(xù)研究。

首先，如今財務管理也進入了信息化時代，如果沒有專業(yè)過硬的財務相關知識，中小學的財務管理水平就不會與時俱進，所以在對財務人員進行入職選擇時，應考慮該財務人員是否持有相關的專業(yè)資格證書，是否具有財務工作經驗，以保證將來學校財務人員的專業(yè)性和實踐能力。

2.1.2 糖添加量的確定

糖添加量對SOD活性和酵母菌活菌數的影響見圖3。

圖3 糖添加量對SOD活性和酵母菌活菌數的影響Fig.3 Effect of sugar addition amount on SOD activity and viable number of yeast

由圖3可知,隨著糖添加量的增加,SOD活性和酵母菌活菌數呈先上升后下降的趨勢,當糖添加量從3%上升到5%時,酵母菌活菌數隨著可利用碳源的增加而增加,SOD活性隨之增加,在糖添加量為5%時達到最大值,此時SOD活性為257.54 U/g,酵母菌活菌數為1.29×108CFU/g;當糖添加量從5%上升至7%時,發(fā)酵體系中糖量過高,形成高滲狀態(tài),抑制菌種的生長和代謝,產酶活力下降,SOD活性和酵母菌活菌數逐漸降低[19];同時,糖添加量過高會使pH值增加,不利于第二步發(fā)酵中植物乳桿菌的生長,因此選擇4%～6%的糖添加量進行后續(xù)研究。

2.1.3 發(fā)酵溫度的確定

發(fā)酵溫度對SOD活性和酵母菌活菌數的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對SOD活性和酵母菌活菌數的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on SOD activity and viable number of yeast

由圖4可知,隨著發(fā)酵溫度的增加,SOD活性和酵母菌活菌數均呈先升高后降低的趨勢,在25 ℃時達到最大值,此時SOD活性為259.09 U/g,酵母菌活菌數為1.30×108CFU/g。溫度過高或過低都不利于酵素的發(fā)酵,溫度過低,酵母菌生長緩慢,發(fā)酵周期長;溫度過高,會對機體的酶及代謝活動產生不利影響,使活菌數的增長速度減緩,因此選擇23～27 ℃進行工藝優(yōu)化。

2.1.4 酵母菌接種量的確定

酵母菌接種量對SOD活性和酵母菌活菌數的影響見圖5。

由圖5可知,SOD活性隨著酵母菌接種量的增加先升高,在0.2%時達到最大值260.08 U/mL,之后隨著酵母菌接種量的增加而降低,接種量在0.1%～0.2%范圍內酵母菌活菌數隨著接種量的增加而增加,在0.2%時達到最大值1.31×108CFU/g后趨于平穩(wěn),不再上升。初始接種量過低,菌種密度低,不能充分利用發(fā)酵體系中的碳源,使SOD活性不能達到最大值;若初始接種量過高,菌體密度過大,導致前期繁殖速度過快,產生的大量有機酸使SOD活性降低[19],綜合考慮,選擇0.15%～0.25%進行響應面優(yōu)化。

2.2 酵母菌發(fā)酵階段響應面試驗

在單因素試驗的基礎上,選取發(fā)酵時間(A)、糖添加量(B)、發(fā)酵溫度(C)、酵母菌接種量(D)4個因素,以SOD活性、酵母菌活菌數為響應值,通過Design Expert 8.6.0軟件進行試驗設計,試驗設計及結果見表3。

以SOD活性、酵母菌活菌數為響應值,利用Design Expert 8.0.6軟件對表3中的數據進行多元回歸擬合,得到SOD活性(Y1)、酵母菌活菌數(Y2)的回歸方程分別為:

Y1=259.45-3.44A-0.27B-15.83C+1.00D-7.21AB-27.41AC-4.91AD-2.75BC-4.00BD+18.40CD-32.82A2-16.54B2-27.85C2-27.29D2;

Y2=1.42+0.015A-0.021B-0.023C+0.074D+0.073AB+(5.000E-004)AC+0.065AD+(7.125E-003)BC+0.053BD+(8.125E-003)CD-0.19A2-0.19B2-0.13C2-0.086D2。

SOD活性、酵母菌活菌數方差分析及顯著性結果見表4和表5。

表4 SOD活性方差分析及顯著性結果Table 4 SOD activity variance analysis and significance results

表5 酵母菌活菌數方差分析及顯著性結果Table 5 Variance analysis and significance results of viable number of yeast

由表4和表5可知,兩個回歸模型均極顯著(P<0.000 1),說明該模型能很好地描述試驗結果,得出的方程有意義。失擬項的P值分別為0.444 2,0.182 8,均大于0.05,差異不顯著,說明該模型擬合度較好。相關系數分別為0.980 4,0.979 5,調整相關系數分別為0.960 8,0.958 9,說明試驗誤差較小,具有較高的參考價值,可以對SOD活性和酵母菌活菌數進行預測分析。

當以SOD活性為響應值時,一次項C極顯著,A顯著,B、D不顯著;交互項AC、CD極顯著,AB顯著,AD、BC、BD不顯著;二次項A2、B2、C2、D2均極顯著。由F值可知,各因素對SOD活性的影響大小為C>A>D>B,即發(fā)酵溫度>發(fā)酵時間>酵母菌接種量>糖添加量。當以酵母菌活菌數為響應值時,一次項D極顯著,B、C顯著,A不顯著;交互項AB、AD、BD極顯著,AC、BC、CD不顯著,二次項A2、B2、C2、D2均極顯著。由F值可知,各因素對酵母菌活菌數的影響大小為D>C>B>A,即酵母菌接種量>發(fā)酵溫度>糖添加量>發(fā)酵時間。

各因素對響應值影響的響應面及等高線見圖6和圖7。

圖6 各因素交互作用對SOD活性的影響Fig.6 Effects of interaction of various factors on SOD activity

圖7 各因素交互作用對酵母菌活菌數的影響Fig.7 Effects of interaction of various factors on viable number of yeast

響應面圖曲面坡度越陡峭,其對應的等高線越密集,形狀呈橢圓形或馬鞍形,說明兩因素間交互作用影響越大[20]。由圖6可知,因素A與因素C、因素C與因素D間的曲面最陡峭,因素A與因素B間的陡峭程度次之,且等高線均呈橢圓形,說明兩兩因素間交互作用較強,影響顯著;因素A與因素D、因素B與因素C、因素B與因素D間響應面曲面較平緩,等高線近似圓形,表明各因素間交互作用較弱,影響不顯著。由圖7可知,因素A與因素B、因素A與因素D、因素B與因素D間所形成的坡面陡峭,等高線密集,呈橢圓形,說明兩兩因素間對酵母菌活菌數的影響較大,交互作用顯著;因素A與因素C、因素B與因素C、因素C與因素D間的響應面曲面較平緩,等高線較稀疏,交互作用影響不顯著。

2.3 響應面驗證試驗

利用軟件Design Expert 8.6.0對兩個模型聯(lián)合求解,得到酵母菌發(fā)酵階段最佳工藝條件為發(fā)酵時間24.3 h、糖添加量4.97%、發(fā)酵溫度24.67 ℃、酵母菌接種量0.21%,在此條件下SOD活性預測值為260.30 U/g,酵母菌活菌數預測值為1.43×108CFU/g。考慮到試驗操作問題,將最佳工藝條件修正為發(fā)酵時間24.5 h、糖添加量5%、發(fā)酵溫度24.7 ℃、酵母菌接種量0.21%,在此條件下進行3次平行驗證試驗,得到SOD活性為(267.64±3.43) U/g,酵母菌活菌數為(1.41±0.04)×108CFU/g,試驗值與預測值接近,表明該模型確定的工藝條件較可靠。

2.4 乳酸菌發(fā)酵階段單因素試驗

2.4.1 發(fā)酵時間的確定

發(fā)酵時間對SOD活性和乳酸菌活菌數的影響見圖8。

圖8 發(fā)酵時間對SOD活性和乳酸菌活菌數的影響Fig.8 Effect of fermentation time on SOD activity and viable number of lactic acid bacteria

由圖8可知,發(fā)酵時間少于24 h時,SOD活性隨著發(fā)酵時間的增加而上升,發(fā)酵時間為24 h時,SOD活性達到最大值271.99 U/g,此時乳酸菌活菌數為5.25×107CFU/g,繼續(xù)進行發(fā)酵,隨著發(fā)酵時間的延長,SOD活性逐漸降低;乳酸菌活菌數在發(fā)酵初始階段迅速上升,在16 h時達到最大值5.79×107CFU/g,此時SOD活性為269.84 U/g,當發(fā)酵時間超過16 h時,乳酸菌活菌數出現(xiàn)下降趨勢,說明此時接近植物乳桿菌生長繁殖的活躍期。綜合考慮,選擇發(fā)酵時間8～24 h進行優(yōu)化。

2.4.2 乳酸菌接種量的確定

乳酸菌接種量對SOD活性和乳酸菌活菌數的影響見圖9。

圖9 乳酸菌接種量對SOD活性和乳酸菌活菌數的影響Fig.9 Effect of inoculation amount of lactic acid bacteria on SOD activity and viable number of lactic acid bacteria

由圖9可知,當乳酸菌接種量較低時,SOD活性及乳酸菌活菌數都較低,當乳酸菌接種量為2%時,SOD活性達到最大值270.47 U/g,此時繼續(xù)增大接種量,乳酸菌活菌數先小幅度上升后開始出現(xiàn)下降趨勢,而SOD活性急劇下降,這是因為當乳酸菌初始菌種密度過大時,其生長代謝速度過快,發(fā)酵過度,產生的總酸含量過高,影響了SOD的活性[21]。因此,選擇接種量1.5%～2.5%進行優(yōu)化。

2.4.3 發(fā)酵溫度的確定

發(fā)酵溫度對SOD活性和乳酸菌活菌數的影響見圖10。

圖10 發(fā)酵溫度對SOD活性和乳酸菌活菌數的影響Fig.10 Effect of fermentation temperature on SOD activity and viable number of lactic acid bacteria

由圖10可知,隨著發(fā)酵溫度的增加,SOD活性和乳酸菌活菌數先略微上升,SOD活性在37 ℃時達到最大值270.83 U/g,此時乳酸菌活菌數為5.05×107CFU/g;乳酸菌活菌數在36 ℃時達到最大值5.55×107CFU/g,此時SOD活性為270.18 U/g,當溫度超過37 ℃時,兩個指標均隨著溫度的增加呈下降的趨勢。因此,選擇發(fā)酵時溫度35～37 ℃進行后續(xù)優(yōu)化。

2.4.4 乳酸菌發(fā)酵階段正交試驗

乳酸菌發(fā)酵階段正交試驗結果及分析見表6。

表6 乳酸菌發(fā)酵階段正交試驗結果及分析Table 6 Orthogonal test results and analysis of lactic acid bacteria fermentation stage

由表6可知,3個因素對SOD活性影響的主次順序為A>C>B,即發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度>乳酸菌接種量,最優(yōu)組合為A3C3B2,即發(fā)酵時間為24 h,發(fā)酵溫度為37 ℃,乳酸菌接種量為2%,在此條件下進行發(fā)酵,測得SOD活性為(264.98±2.23) U/g,乳酸菌活菌數為(1.48±0.17)×108CFU/g;3個因素對乳酸菌活菌數影響的主次順序為A>B>C,即發(fā)酵時間>乳酸菌接種量>發(fā)酵溫度,最優(yōu)組合為A2B2C1,即發(fā)酵時間為16 h,乳酸菌接種量為2%,發(fā)酵溫度為35 ℃,在此條件下進行發(fā)酵,測得SOD活性為(275.24±1.12) U/g,乳酸菌活菌數為(1.97±0.17)×108CFU/g,優(yōu)于組合A3C3B2。因此,以發(fā)酵時間16 h、乳酸菌接種量2%、發(fā)酵溫度35 ℃為最適發(fā)酵條件。

3 結論

在酵母菌與乳酸菌復合發(fā)酵的條件下發(fā)酵刺梨果渣,經響應面分析得出酵母菌發(fā)酵階段的最優(yōu)條件為發(fā)酵時間24.5 h、糖添加量5%、發(fā)酵溫度24.7 ℃、酵母菌接種量0.21%,在此條件下刺梨果渣酵素發(fā)酵物料的SOD活性為267.64 U/g,酵母菌活菌數為1.41×108CFU/g;在正交試驗優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵階段,通過分析得到最佳條件為發(fā)酵時間16 h、乳酸菌接種量2%、發(fā)酵溫度35 ℃,在此條件下刺梨果渣酵素發(fā)酵物料的SOD活性為275.24 U/g,乳酸菌活菌數為1.97×108CFU/g。

刺梨果渣酵素經優(yōu)化后,其活菌數顯著增加,這與郭玉如[22]的研究結果相似,說明酵母菌和乳酸菌對刺梨果渣發(fā)酵具有積極影響;其SOD活性較大,多發(fā)酵產品高[23-24],說明刺梨果渣在發(fā)酵過程中能很好地保留其原有和發(fā)酵所產生的營養(yǎng)基質,這與王霞等[17]的研究結果一致,因此,后期可進一步對該產品進行功能性研究,以探究其生理功能。