鮰魚蛋白ACE抑制肽的酶法制備及分離純化

李佳伶,關(guān)詩(shī)琦,蔣思雨,蔡寅川,郝剛*

(1.西南民族大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,成都 610041; 2.四川阿壩州工業(yè)經(jīng)濟(jì)研究所,四川 汶川 623000)

高血壓是引發(fā)心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素,嚴(yán)重威脅著人類的健康。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin I-converting enzyme inhibitor,ACEI)作為有效治療高血壓的藥物被廣泛用于臨床治療。化學(xué)合成類抑制劑通常藥效短,停藥后易反彈,長(zhǎng)期服用還具有一定的毒副作用[1-2]。食源性ACE抑制肽由于安全性高、副作用小、易吸收,逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。許多研究表明魚源蛋白是很好的ACE抑制肽來源。目前已通過酶解方法生產(chǎn)出多種ACE抑制肽,如鲅魚源ACE抑制肽[3]、鰱魚源ACE抑制肽[4]、鱈魚源ACE抑制肽[5]、沙丁魚ACE抑制肽等[6]。斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)具有適養(yǎng)范圍廣、生長(zhǎng)速度快、體積大、肉質(zhì)優(yōu)良等特點(diǎn)[7]。中國(guó)鮰魚產(chǎn)量占世界產(chǎn)量的比例基本穩(wěn)定在65%左右[8]。隨著市場(chǎng)需求的提高,鮰魚養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模逐漸擴(kuò)大,我國(guó)鮰魚產(chǎn)業(yè)面臨著供大于求、品種淘汰等諸多問題[9]。因此,大力開發(fā)轉(zhuǎn)化鮰魚加工產(chǎn)品、促進(jìn)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)發(fā)展是改變現(xiàn)狀的不二選擇。

在酶解魚類蛋白生產(chǎn)ACE抑制肽過程中,為了維持pH值恒定需不斷加入堿液,導(dǎo)致酶解產(chǎn)物鹽分過高,用大孔樹脂脫鹽具有吸附、解吸迅速、回收率高、再生容易等優(yōu)點(diǎn)。許多研究表明ACE抑制肽呈現(xiàn)分子量小的特點(diǎn)[10],因此可采用超濾和分子排阻色譜根據(jù)分子量大小對(duì)ACE抑制肽進(jìn)行分離純化。本試驗(yàn)以脫脂后的鮰魚肉為原料,采用分步酶解法制備ACE抑制肽[11-12],對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分子量分布分析,采用超濾離心、大孔吸附樹脂和葡聚糖凝膠G-15對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化,獲得活性更高的ACE抑制肽,為拓寬國(guó)內(nèi)市場(chǎng),開發(fā)來源廣泛、安全性高的鮰魚加工產(chǎn)品提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

斑點(diǎn)叉尾鮰魚:農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);胰蛋白酶(250 U/g)、胃蛋白酶(3 000 U/mg)和堿性蛋白酶(200 000 U/g):北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司;血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)和馬脲酰組氨酰亮氨酸(HHL):美國(guó)Sigma公司;馬尿酸(HA)、羅恩試劑、2,4,6-三硝基苯磺酸:北京伊諾凱科技有限公司;DA201-C大孔樹脂和葡聚糖凝膠Sephadex G-15:北京索萊寶科技有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純與色譜純。

Centrifuge 5804R高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf(艾本德)公司;真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司;UV1810S紫外可見分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司;1260高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司;3 000 Da超濾離心管 Millipore公司;玻璃層析柱(1.6 cm×50 cm)、恒流泵、自動(dòng)部分收集器、紫外檢測(cè)器和電腦采集器 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理

采用離心法脫脂[13],將魚肉清洗后去皮,用蒸餾水漂洗20 min后,以4 000 r/min離心10 min,得到脫脂后的魚肉,分裝,于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 雙酶分步酶解鮰魚蛋白的用酶篩選

向預(yù)處理的魚肉中加入蒸餾水,勻漿后調(diào)節(jié)第一種酶的最適pH值、溫度、底物濃度及酶活/底物量,加入酶攪拌均勻,置于控溫磁力攪拌器酶解,保持反應(yīng)體系pH值、溫度恒定,達(dá)到反應(yīng)時(shí)間后調(diào)節(jié)第二種酶的最適pH值、溫度,加入第二種酶繼續(xù)反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后,將酶解液置于80 ℃水浴鍋中滅酶20 min,冷卻后,以10 000 r/min離心20 min,取上清液,測(cè)定水解度及ACE抑制活性,酶解條件及酶解組合順序見表1和表2。酶解液冷凍干燥后待用。

表1 不同蛋白酶酶解條件Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of different proteases

表2 分步酶解組合Table 2 Stepwise enzymatic hydrolysis combinations

1.2.3 鮰魚蛋白酶解條件的優(yōu)化

以pH、溫度、酶解反應(yīng)時(shí)間、底物濃度和酶活/底物量5個(gè)酶解條件為因素,以水解度為指標(biāo),考察各因素對(duì)酶解的影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn),用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 18.0對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,確定最佳酶解工藝。

1.2.4 水解度(DH)的測(cè)定

采用TNBS法測(cè)定水解度,參考周慧江等[14]的方法略作修改。配制濃度為0.02,0.04,0.06,0.08,0.10 mmol/L的亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。吸取0.1 mL亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)液,加入2 mL 50 ℃預(yù)熱的0.2 mol/L、pH為8.2的磷酸鹽緩沖液(PBS),加入1 mL 0.1%的2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)快速振蕩,于50 ℃水浴鍋中避光反應(yīng)60 min,再加入4 mL 0.1 mol/L的HCl快速終止反應(yīng),于室溫下靜置30 min后在340 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值,以蒸餾水代替亮氨酸反應(yīng)作參比,以亮氨酸濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo),繪制亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.124 3x,R2為0.999 2。

取酶解液1 mL(空白對(duì)照為純水),加入15 mL 1%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液,得到待測(cè)液。吸取0.1 mL待測(cè)液,加入2 mL 50 ℃預(yù)熱的0.2 mol/L、pH 8.2的PBS,加入1 mL 0.1%的TNBS快速振蕩,于50 ℃水浴鍋中避光反應(yīng)60 min,再加入4 mL 0.1 mol/L的HCl快速終止反應(yīng),室溫下靜置30 min后于340 nm下測(cè)定吸光值,測(cè)定供試液的吸光度為B。水解度DH(%)的計(jì)算公式如下:

(1)

式中:B為樣品在340 nm下的吸光度;M為酶解樣品的質(zhì)量,g;Pro%為酶解樣品中的蛋白質(zhì)含量,g/g;htot為蛋白質(zhì)總肽鍵數(shù)。

1.2.5 ACE抑制活性的測(cè)定

采用HPLC法測(cè)定ACE抑制活性,參考王毅梅[15]的方法并略作修改。配制pH為8.3、濃度為0.1 mol/L的硼酸鹽緩沖液(含300 mmol/L NaCl),用此緩沖液配制0.1 U/mL的ACE溶液和6.5 mmol/L的HHL溶液。于1.5 mL離心管中加入10 μL 的抑制劑樣品(空白對(duì)照用硼酸鹽緩沖液代替抑制劑)與30 μL HHL混合均勻,放置于37 ℃水浴中預(yù)熱5 min,然后加入20 μL ACE溶液于37 ℃下恒溫反應(yīng)1 h,最后在反應(yīng)液中加入70 μL 1 mol/L的HCl終止反應(yīng),得到供試液,以硼酸鹽緩沖液為空白,供試液總體積130 μL。

色譜柱:ODS C18分析型色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);檢測(cè)波長(zhǎng):UV 228 nm;流速:0.8 mL/min;流動(dòng)相A:水(含0.05%三氟乙酸);流動(dòng)相B:乙腈(含0.05%三氟乙酸);進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:25 ℃;梯度洗脫條件:0～10 min,流動(dòng)相B:10%～60%;10～12 min,流動(dòng)相B:60%～10%。ACE抑制率的計(jì)算:

(2)

式中:A0為對(duì)照組中生成馬尿酸的峰面積;A1為加入抑制劑組中生成馬尿酸的峰面積。

1.2.6 分子量分布分析

參考吳悅[16]、姜惠敏[17]的方法并略作修改。吸取上清液2 mL,添加流動(dòng)相稀釋至100 mL,經(jīng)0.45 μm孔徑的微孔濾膜過篩后上樣分析。色譜條件:TSKgel 2000 SWXL色譜柱(300 mm×7.8 mm,10 μm);柱溫:25 ℃;流動(dòng)相:乙腈∶水為45∶55(其中含TFA 0.1);紫外檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm;流速:0.5 mL/min。通過Waters M32GPC軟件自動(dòng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及計(jì)算。

選用細(xì)胞色素C (Mw=12 500 Da)、抑肽酶(Mw=6 500 Da)、桿菌酶(Mw=1 450 Da)、Gly-Gly-Tyr-Arg(Mw=451 Da)和Gly-Gly-Gly(Mw=189 Da)5種分子量不同的標(biāo)準(zhǔn)多肽樣品繪制分子質(zhì)量(Mw)校正曲線,得到分子質(zhì)量與保留時(shí)間的線性回歸方程為lgMw=5.441 8-0.054 1t。其中r=0.996 0,P<0.01,說明各標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值與其保留時(shí)間具有良好的線性關(guān)系,因此可以由保留時(shí)間準(zhǔn)確定量酶解產(chǎn)物中多肽的分子質(zhì)量。多肽的分子質(zhì)量除以氨基酸平均分子質(zhì)量(128 Da)即為多肽大小。

1.2.7 超濾分離

用超純水將3 kDa分子量的超濾離心管的濾膜完全淹沒,冰浴10 min,然后將水倒出,將10 mL適當(dāng)濃度的酶解液緩慢移入超濾離心管中,4 ℃下4 000 r/min離心20 min。收集濾液,經(jīng)冷凍干燥后測(cè)定ACE抑制活性。

1.2.8 DA201-C大孔樹脂吸附

1.2.8.1 DA201-C大孔樹脂靜態(tài)吸附試驗(yàn)

向50 mL錐形瓶中加入預(yù)處理過的干樹脂5 g,乙醇浸泡溶脹后,加入蒸餾水洗凈乙醇,吸干水分。向錐形瓶中加入超濾后的酶解液20 mL,濃度為10 mg/mL,將錐形瓶放置于30 ℃恒溫?fù)u床中振蕩,轉(zhuǎn)速110 r/min,每隔2 h在280 nm紫外波長(zhǎng)下測(cè)定一次吸光度,反應(yīng)總時(shí)長(zhǎng)12 h,計(jì)算大孔樹脂對(duì)酶解液的吸附量及吸附率,繪制關(guān)系曲線。吸附量及吸附率計(jì)算公式如下:

(3)

(4)

式中:A0為原液蛋白濃度,mg/mL;A1為吸附液蛋白濃度,mg/mL;V為原液體積,mL;m為干樹脂質(zhì)量,g。

1.2.8.2 DA201-C大孔樹脂靜態(tài)解吸試驗(yàn)

稱取完全吸附飽和的樹脂5 g,加入70%的乙醇洗脫液15 mL,置于恒溫?fù)u床中振蕩,每隔60 min測(cè)定一次洗脫液的吸光值,反應(yīng)總時(shí)長(zhǎng)6 h,計(jì)算大孔樹脂對(duì)酶解液的解吸率,繪制解吸率與時(shí)間的關(guān)系曲線。解吸率的計(jì)算公式如下:

(5)

式中:A0為原液蛋白濃度,mg/mL;A1為吸附液蛋白濃度,mg/mL;A2為解吸液蛋白濃度,mg/mL;V0為原液體積,mL;V1為解吸液體積,mL。

1.2.8.3 DA201-C大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)

配制適當(dāng)濃度的ACE抑制肽溶液,以2 mL/min的流速上樣大孔樹脂層析柱,上樣完成后用75%的乙醇溶液流經(jīng)層析柱進(jìn)行洗脫,每5 min收集一管洗脫液,A280 nm≤0.05時(shí)停止洗脫[18]。洗脫液冷凍干燥后測(cè)定ACE抑制率。

1.2.9 葡聚糖凝膠G-15柱層析

經(jīng)大孔樹脂純化后的ACE抑制肽用凝膠柱層析進(jìn)一步分離純化。色譜條件:凝膠柱:1.6 cm×50 cm;上樣濃度:10 mg/mL;上樣量:1 mL;洗脫液:超純水;流脫流速:1 mL/min。按峰收集各組分,各組分冷凍干燥后測(cè)定ACE抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳雙酶酶解組合的確定

由表3可知,3種蛋白酶的酶解產(chǎn)物對(duì)ACE均有一定的抑制作用,酶的種類對(duì)水解度及ACE抑制率的影響較大,水解度由大到小排序?yàn)?>1>2,ACE抑制率與水解度呈正相關(guān)關(guān)系,由水解度及ACE抑制率結(jié)果選擇3號(hào)酶解組合,即選用胰蛋白酶為第一步酶解用酶,酶解1 h;選用堿性蛋白酶為第二步酶解用酶,酶解4 h,此條件下測(cè)定酶解產(chǎn)物的水解度為5.7%,ACE抑制率為16.3%。試驗(yàn)結(jié)果也表明只使用堿性蛋白酶(組1)也能獲得接近雙酶(組2)的酶解效果,說明在對(duì)鮰魚蛋白酶解中起主要作用的是堿性蛋白酶,因此接下來主要對(duì)堿性蛋白酶的水解條件進(jìn)行優(yōu)化。

表3 雙酶分步酶解試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Stepwise enzymatic hydrolysis test results of double enzymes

2.2 酶解條件的優(yōu)化

根據(jù)堿性蛋白酶酶解的單因素試驗(yàn)結(jié)果,選擇溫度、pH、酶活/底物量3個(gè)反應(yīng)條件作為試驗(yàn)因素,以水解度為指標(biāo),設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn),見表4。正交試驗(yàn)結(jié)果、極差分析結(jié)果見表5,方差分析結(jié)果見表6。

表4 酶解反應(yīng)的正交試驗(yàn)因素水平表Table 4 Factors and levels of orthogonal test of enzymatic hydrolysis reaction

表5 堿性蛋白酶正交試驗(yàn) L9(33)結(jié)果表Table 5 Results of orthogonal test L9(33) of alkaline protease

表6 堿性蛋白酶正交試驗(yàn)L9(33)方差分析表Table 6 Analysis of variance of orthogonal test L9 (33) of alkaline protease

極差分析和方差分析結(jié)果表明,影響堿性蛋白酶酶解反應(yīng)的3個(gè)因素中,pH對(duì)反應(yīng)的影響最顯著,溫度次之,酶活/底物量對(duì)反應(yīng)的影響不是很顯著。以水解度為指標(biāo),由K值大小可以判斷出3個(gè)因素的最優(yōu)水平,得出蛋白酶酶法制備的最佳酶解工藝為A2B2C2,即水解溫度50 ℃、pH 9.0、酶活/底物量6 U/mg。對(duì)該最佳酶解工藝進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明,鮰魚蛋白經(jīng)雙酶分步酶解,即選用胰蛋白酶為第一步酶解用酶,酶解1 h;選用堿性蛋白酶為第二步酶解用酶,酶解4 h,此條件下酶解產(chǎn)物的水解度為12.63%,ACE抑制率為18.7%。

2.3 分子量分布分析

鮰魚蛋白酶解液分子量分布HPLC圖見圖1。

圖1 鮰魚蛋白酶解液分子量分布HPLC圖Fig.1 HPLC diagram of molecular weight distribution of longsnout catfish protein enzymatic hydrolysate 注:圖中數(shù)值為 Mp值(峰位分子量)。

相比于游離氨基酸,小分子肽被人體吸收具有速度快、消耗能量低、轉(zhuǎn)運(yùn)效率高、載體不易飽和等優(yōu)勢(shì)[19]。本試驗(yàn)采用雙酶分步酶解能使鮰魚蛋白酶解得更充分,從而得到小分子肽。采用HPLC法對(duì)最優(yōu)酶解條件下制備的酶解產(chǎn)物進(jìn)行分子量分布分析,由表7可知,酶解產(chǎn)物中分子量低于1 000 Da的組分占總體的99.6%,主要分布在500 Da以下,即4肽以下的肽占多肽總量的98.23%。研究發(fā)現(xiàn)海洋源ACE抑制肽中,分子量最小的二肽(Gly-Gly)分子量為132 Da,分子量最大的三肽(Trp-Trp-Trp)分子量為576 Da[20]。本試驗(yàn)所得的酶解產(chǎn)物分子量處于此范圍內(nèi),由此表明,酶解產(chǎn)物主要為二肽和三肽,可被人體不經(jīng)消化直接吸收[21]。

表7 鮰魚蛋白酶解液分子量分布分析Table 7 Analysis of molecular weight distribution of longsnout catfish protein enzymatic hydrolysate

2.4 超濾分離

超濾技術(shù)是一種利用膜對(duì)溶質(zhì)按分子量大小進(jìn)行分離的技術(shù)[22]。用3 kDa的超濾離心管來篩分溶液中的多肽物質(zhì),得到經(jīng)初步分離的鮰魚肽組分。由圖2中(a)、(b)色譜圖可以計(jì)算出超濾后的ACE抑制率為35.4%,高于原酶解液的16.7%。

(a)未加入抑制劑

(b)加入抑制劑圖2 超濾離心組分ACE抑制活性HPLC圖Fig.2 HPLC diagrams of ACE inhibitory activity of ultrafiltration centrifugal components

2.5 DA201-C大孔樹脂吸附

2.5.1 DA201-C大孔樹脂的靜態(tài)吸附曲線

大孔吸附樹脂是一類新型的高分子吸附劑,其具有良好的再生能力和機(jī)械強(qiáng)度[23],本試驗(yàn)選用DA201-C大孔樹脂對(duì)超濾離心后的組分進(jìn)一步分離純化。由圖3可知,前4 h內(nèi)大孔樹脂對(duì)酶解液的吸附量及吸附速率與時(shí)間呈正相關(guān),但隨著時(shí)間的增加,吸附量及吸附率不再提高。這是由于在大孔樹脂吸附過程中,被吸附物質(zhì)具有疏水性基團(tuán),通過疏水相互作用與樹脂的疏水部分結(jié)合,由于隨時(shí)間延長(zhǎng)樹脂表面的結(jié)合位點(diǎn)逐漸減少,樹脂會(huì)出現(xiàn)一種吸附飽和的現(xiàn)象。大孔吸附樹脂已經(jīng)趨于飽和,吸附趨于平衡狀態(tài),大孔樹脂對(duì)多肽的吸附屬于快速平衡型[24],12 h時(shí)吸附率為54.6%,吸附量為44.6 mg/g。

(a)靜態(tài)吸附時(shí)間-吸附量關(guān)系曲線

(b)靜態(tài)吸附時(shí)間-吸附率關(guān)系曲線圖3 DA201-C大孔樹脂靜態(tài)吸附曲線Fig.3 Static adsorption curves of DA201-C macroporous resin

2.5.2 DA201-C大孔樹脂的靜態(tài)解吸曲線

本試驗(yàn)采用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇作為洗脫劑。DA201-C大孔樹脂靜態(tài)解吸曲線見圖4,在2 h內(nèi)大部分多肽可被乙醇洗脫下來,此時(shí)解吸率為62.1%,2 h后解吸曲線趨于平緩。由DA201-C大孔樹脂對(duì)鮰魚ACE抑制肽解吸達(dá)到平衡所需的時(shí)間較短可以判斷,解吸性能良好,屬于快速平衡型。

圖4 DA201-C大孔樹脂靜態(tài)解吸曲線Fig.4 Static desorption curve of DA201-C macroporous resin

2.5.3 DA201-C大孔樹脂對(duì)酶解液的動(dòng)態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)

DA201-C大孔樹脂吸附層析圖見圖5。經(jīng)吸附得到單一組分,該組分ACE抑制活性HPLC圖見圖6。

圖5 大孔吸附樹脂層析圖Fig.5 Chromatogram of macroporous adsorption resin

(a)未加入抑制劑

(b)加入抑制劑圖6 大孔樹脂吸附組分ACE抑制活性色譜圖Fig.6 Chromatograms of ACE inhibitory activity of the adsorption components of macroporous resin

由圖6可知,經(jīng)大孔樹脂純化后的組分ACE抑制率可達(dá)到56.6%,高于超濾離心組分21.2%,說明大孔樹脂吸附可有效去除組分中的無機(jī)鹽等雜質(zhì),進(jìn)一步提高了組分的ACE抑制活性。

2.6 葡聚糖凝膠Sephadex G-15柱層析

組分經(jīng)大孔樹脂吸附后采用Sephadex G-15凝膠柱層析,超純水洗脫進(jìn)一步分離純化。根據(jù)采集圖譜,按峰收集各組分,測(cè)定各組分ACE抑制活性。Sephadex G-15層析圖譜見圖7。

圖7 Sephadex G-15層析圖譜Fig.7 Sephadex G-15 chromatogram

由圖7可知,Sephadex G-15層析分離酶解物,分離出3個(gè)組分,分別標(biāo)記為G1、G2、G3,凝膠層析分離是按照組分分子量大小進(jìn)行分離的,分子量較小的后被洗脫出來,因此,3個(gè)組分分子量大小為G2>G1>G3。3個(gè)組分經(jīng)上樣分析,計(jì)算出G1組分ACE抑制率為60.3%,G2組分ACE抑制率為66.9%,G3組分ACE抑制率為57.7%,G2組分ACE抑制率最大,高出大孔樹脂純化組分10.3%。為進(jìn)一步提高酶解液純度及ACE抑制活性,在后期研究中可以將活性最強(qiáng)的G2組分用來進(jìn)一步分離純化。

3 結(jié)論

本文以脫脂鮰魚肉為原料,水解度和ACE抑制活性為考察指標(biāo),采用胰蛋白酶和堿性蛋白酶雙酶分步酶解的方法對(duì)鮰魚肉進(jìn)行酶解,最佳酶解工藝:調(diào)節(jié)pH 為8,溫度37 ℃,底物濃度0.17 g/mL,加入胰蛋白酶,酶活/底物量為6 U/mg,水解1 h,再調(diào)節(jié)pH為 9,溫度55 ℃,加入堿性蛋白酶,酶活/底物量為6 U/mg,水解4 h,此時(shí)水解度為12.63%,酶解產(chǎn)物的ACE抑制率為18.7%。分子量分布分析發(fā)現(xiàn)酶解產(chǎn)物分子量主要分布在500 Da以下,即4肽以下的肽占多肽總量的98.23%。

經(jīng)分子量為3 kDa的超濾離心管分離后的組分ACE抑制活性為35.4%。用DA201-C大孔吸附樹脂對(duì)超濾組分進(jìn)一步脫鹽,靜態(tài)吸附結(jié)果表明,吸附約在4 h內(nèi)達(dá)到飽和,12 h時(shí)吸附率為54.6%,吸附量為44.6 mg/g;靜態(tài)解吸結(jié)果表明,大孔樹脂約在2 h內(nèi)解吸完全,解吸率為62.1%,DA201-C大孔樹脂展現(xiàn)出良好的吸附和解吸性能。大孔樹脂脫鹽后的組分ACE抑制率可達(dá)56.6%,是超濾離心組分的1.6倍。采用Sephadex G-15凝膠柱層析進(jìn)一步分離純化,得到3個(gè)組分G1、G2、G3,其中G2組分的抑制活性最高,為66.9%,是大孔樹脂分離組分的1.2倍。經(jīng)過分離純化后的ACE抑制肽活性相比原酶解液提高了3.6倍。