HS-SPME-GC-MS/MS結(jié)合ROAV值鑒定新疆庫車小白杏的關(guān)鍵香氣物質(zhì)

趙彩，孫金奎，李甜，史學(xué)偉，程衛(wèi)東，王斌

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000）

杏（Prunus armeniacaL.），為薔薇科（Rosaceae）李亞科（Prunoideae）杏屬（ArmeniacaMill）植物[1]。作為一種美味的水果，杏受到全世界消費(fèi)者的喜愛，尤其在地中海、南非以及北美等地[2]。杏起源于中國新疆，適宜的氣候和優(yōu)越的地理環(huán)境使得新疆杏子的年產(chǎn)量居全國之首[3]。在眾多杏種資源中，小白杏是新疆南疆地區(qū)種植最為廣泛的杏子品種之一，其果皮呈鵝黃色、大小適中、皮薄肉厚、味甜多汁。并且小白杏具有極高的營養(yǎng)價值，平均每顆杏果中含有約25%的蛋白質(zhì)，50%的粗脂肪以及豐富的維生素、有機(jī)酸和糖類等[4]。

小白杏除了滋味可口、營養(yǎng)豐富，還具有非常獨(dú)特且濃郁的香氣。這些香氣來源于杏果中所含有的揮發(fā)性物質(zhì)。先前的研究已從新疆主要種植的14種杏子品種中共檢測出208種揮發(fā)性化合物，包括39種醇類、25種醛類、80種酯類、21種酮類、27種萜烯類以及其他濃度較低的香氣物質(zhì)[5]。周圍等[6]也分析了6種杏中所含有的揮發(fā)性成分，在組成和含量上具有較大的差異。事實上，大多數(shù)的揮發(fā)性物質(zhì)因其含量較低、香氣閾值較高而不易被人體嗅覺器官所感知。只有少數(shù)呈香性較強(qiáng)的揮發(fā)性成分才能被人體感知到，這類物質(zhì)被稱為關(guān)鍵香氣成分，其含量越高，香氣越濃郁。

不同杏品種所含有的關(guān)鍵香氣成分差異較大，這些關(guān)鍵性香氣構(gòu)成了該品種的特征性香氣指紋。對小白杏中揮發(fā)性化合物進(jìn)行定性和定量分析是找出其關(guān)鍵性香氣物質(zhì)的關(guān)鍵。然而，想要得到理想的分析結(jié)果，前提是對這些揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行提取濃縮和富集。頂空固相微萃?。℉eadspace Solid Phase Microextraction，HS-SPME）屬于固相微萃取技術(shù)的一種，該技術(shù)集萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體[7]，與傳統(tǒng)的液-液萃取等其他萃取技術(shù)相比，更加快速簡便、準(zhǔn)確有效。本文采用HS-SPME與氣相色譜雙質(zhì)譜（Gas Chromatography Coupled to Tandem Mass Spectrometry，GC-MS/MS）結(jié)合的技術(shù)對小白杏中所含有的揮發(fā)性化合物進(jìn)行提取與分析，將影響HS-SPME萃取效率的各因素進(jìn)行條件優(yōu)化，以期獲得最佳的萃取條件和萃取效果。根據(jù)相對香氣活性值（Relative Odor Activity Value，ROAV）鑒定出關(guān)鍵性香氣物質(zhì)，并對小白杏呈香屬性指紋進(jìn)行分析，為后續(xù)探索具有小白杏風(fēng)味的產(chǎn)品研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實驗所用小白杏于2021年6月采自新疆庫車縣牙哈鎮(zhèn)杏園。采用五點(diǎn)取樣法，于果園的東西南北中五個方位選取五棵杏樹，分別從杏樹的上、中、下部位隨機(jī)采摘成熟（可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.7%～15.8%）、大小均一且無病蟲害的新鮮小白杏。共收獲300顆小白杏，放置于泡沫保溫箱中，隨后被立即送往實驗室。

1.2 儀器與試劑

ME104E電子分析天平，美國Mettler Toledo；DF-101S恒溫磁力攪拌器，河南予華；8890-7000 D氣相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent；手動SPME進(jìn)樣器（50/30 μm DVB/CAR/PDMS，75 μm CAR/PDMS，100 μm PDMS），美國Supelco。

2-辛醇（純度GC≥98%），Sigma-Aldrich上海貿(mào)易有限公司；氯化鈉和氯化鈣（分析純），天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 頂空固相微萃取條件優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取5.0 g杏肉于20 mL頂空瓶中，依次加入1.0 g氯化鈉，5 mL飽和氯化鈣溶液，1 μL 2-辛醇溶液（用正己烷稀釋3倍后作為內(nèi)標(biāo)）和磁力轉(zhuǎn)子后，將頂空瓶密封，將磁力攪拌器轉(zhuǎn)速設(shè)置為300 r/min。選擇三種常見涂層類型的萃取纖維，即三重混合涂層：聚二乙烯基苯/碳吸附劑/聚二甲基硅氧烷（Divinylbenzene/Carboxen/Polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS），灰色，50/30 μm；雙重混合涂層：碳吸附劑/聚二甲基硅氧烷（Carboxen/Polydimethylsiloxane，CAR/PDMS），黑色，75 μm以及單一涂層：聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS），紅色，100 μm。分別設(shè)置四個平衡萃取溫度（35、45、55、65 ℃）和四個萃取時間（30、40、50、60 min），平衡時間設(shè)置為10 min。萃取完成后，立刻將萃取頭插入GC-MS/MS進(jìn)樣口，230 ℃下解析5 min。

1.3.2 GC-MS條件

選擇HP-Innowax（30 m×0.25 mm×0.25 μm）石英毛細(xì)管色譜柱。進(jìn)樣口溫度設(shè)置為230 ℃，載氣為氦氣（純度99.999%），流量為1.0 mL/min，進(jìn)樣采用不分流模式。升溫程序為初始溫度40 ℃，保持5 min；先以2 ℃/min升溫至68 ℃，然后以3 ℃/min升溫至180 ℃，最后以16 ℃/min升溫至230 ℃，保持1 min。

MS條件采用EI電離模式，電子能量為70 eV，離子源溫度270 ℃，質(zhì)量掃描范圍為30～350。

1.3.3 揮發(fā)性化合物的定性與定量

將所測樣品中分離出的未知物與NIST17.L數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索比對，初步篩選出匹配度大于75的化合物。利用數(shù)據(jù)庫中每種化合物的保留指數(shù)（Retention Index，RI）進(jìn)一步確定小白杏中所含有的揮發(fā)性成分。

小白杏中揮發(fā)性化合物的含量計算如下：

式中：

C1——目標(biāo)化合物的含量，μg/kg；S1——目標(biāo)化合物的峰面積；

S0——內(nèi)標(biāo)的峰面積；

C0——內(nèi)標(biāo)的含量，μg/kg。

1.3.4 關(guān)鍵香氣化合物的分析

根據(jù)以下公式[8]計算香氣活性值（Odor Activity Value，OAV）：

式中：

OAV——香氣活性值；

C——揮發(fā)性化合物的含量，μg/kg；

T——該揮發(fā)性化合物的香氣閾值，μg/L。

根據(jù)計算結(jié)果，規(guī)定OAV最大的香氣化合物其相對香氣活性值（ROAV）為100，其他揮發(fā)性化合物的ROAV計算如下[9]：

式中：

Ci——揮發(fā)性化合物的含量，μg/kg；

Ti——該揮發(fā)性化合物的香氣閾值，μg/L；

Cmax——OAV最大的香氣化合物的含量，μg/kg；

Tmax——OAV最大的香氣化合物的香氣閾值，μg/L；

ROAVmax——OAV最大的香氣化合物的ROAV值。

關(guān)鍵香氣化合物的判定依據(jù)為：ROAV≥1，該揮發(fā)性物質(zhì)對小白杏整體風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)，判定為關(guān)鍵性香氣化合物；0.1≤ROAV＜1，該揮發(fā)性物質(zhì)對小白杏整體風(fēng)味有修飾作用，判定為修飾性化合物；ROAV＜0.1，該揮發(fā)性物質(zhì)對小白杏整體風(fēng)味無貢獻(xiàn)，判定為潛在性香氣化合物[8]。

1.3.5 小白杏呈香屬性指紋分析

小白杏的香氣分析由一個專業(yè)的感官評定小組進(jìn)行，該小組包括10位成員（5名男性和5名女性，年齡22～31歲）。小組成員通過多次（至少三次）感官評估會議分析小白杏的香氣特征，選擇六個香氣術(shù)語（即青草香、果香、椰子香、柑橘香、花香和松香）來描述杏子的風(fēng)味特征。小組成員使用三點(diǎn)評分法（0分，不能感知；1分，香味較弱；2分，香味顯著；3，香味強(qiáng)烈）對每個杏子樣品的氣味強(qiáng)度進(jìn)行評分。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，每組實驗進(jìn)行三次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Origin 2018進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 頂空固相微萃取條件優(yōu)化

2.1.1 DVB/CAR/PDMS（50/30 μm，灰色）涂層纖維的萃取條件優(yōu)化

使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS（灰色）涂層的萃取纖維，設(shè)置四種不同的平衡萃取溫度（35、45、55、65 ℃），在這四種溫度下平衡樣品10 min，接著在相同條件下萃取50 min。萃取完成后，將萃取頭插入MS系統(tǒng)進(jìn)行解析。結(jié)果如圖1a所示，隨著溫度升高，峰面積增大，峰個數(shù)增多。當(dāng)溫度為65 ℃時，峰面積和峰個數(shù)達(dá)到最大。這表明，升溫可以加快分子熱運(yùn)動，揮發(fā)性物質(zhì)更容易釋放出來，萃取效率增加[10]。

圖1 DVB/CAR/PDMS涂層纖維萃取溫度（a）與萃取時間（b）的優(yōu)化Fig.1 Optimization of extraction temperatures (a) and times (b)by DVB/CAR/PDMS coated fiber

選擇65 ℃為平衡萃取溫度，設(shè)置四種不同的萃取時間（30、40、50、60 min），研究萃取時間對萃取效果的影響。當(dāng)萃取時間為30 min和40 min時，峰面積和峰個數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于50 min。當(dāng)萃取時間為60 min時，峰面積和峰個數(shù)又急速下降（圖1b）。這可能是由于當(dāng)萃取時間為50 min時，該萃取纖維（DVB/CAR/PDMS，50/30 μm）的吸附量已經(jīng)達(dá)到飽和，繼續(xù)延長萃取時間，導(dǎo)致萃取纖維的解析作用大于吸附作用，從而降低了萃取效率。萃取纖維對揮發(fā)性物質(zhì)的吸附是一個動態(tài)變化的過程，只有當(dāng)樣品量、萃取纖維和頂空部分這三者之間達(dá)到動態(tài)平衡，才能保證吸附量達(dá)到最大[11]。綜合考慮，當(dāng)使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS（灰色）涂層的萃取纖維時，最佳的萃取條件為平衡萃取溫度65 ℃，萃取時間50 min。

2.1.2 CAR/PDMS（75 μm，黑色）涂層纖維的萃取條件優(yōu)化

使用75 μm CAR/PDMS（黑色）涂層的萃取纖維，設(shè)定萃取時間為50 min，研究不同平衡萃取溫度（35、45、55、65 ℃）對萃取效率的影響（圖2a）。結(jié)果表明，隨著溫度的升高，峰面積與峰個數(shù)先增大后降低。當(dāng)萃取溫度為55 ℃時，峰面積和峰個數(shù)均達(dá)到峰值。造成這種現(xiàn)象的原因在于當(dāng)使用75 μm CAR/PDMS涂層的萃取纖維時，溫度過高會降低萃取纖維涂層的分配系數(shù)，從而減小了揮發(fā)性物質(zhì)的吸附量，同時分子質(zhì)量較小的易揮發(fā)性成分再次從萃取纖維頭上解析出來[12]，最終導(dǎo)致萃取效率降低。因此，選擇55 ℃為最佳平衡萃取溫度，設(shè)定不同萃取時間（30、40、50、60 min），研究其對萃取效果的影響（圖2b）。結(jié)果表明，當(dāng)萃取時間為50 min時，萃取效果最高，峰面積和峰個數(shù)最大。綜合考慮，當(dāng)使用75 μm CAR/PDMS（黑色）涂層的萃取纖維時，最佳的萃取條件為平衡萃取溫度55 ℃，萃取時間50 min。

圖2 CAR/PDMS涂層纖維萃取溫度（a）與萃取時間（b）的優(yōu)化Fig.2 Optimization of extraction temperatures (a) and times (b)by CAR/PDMS coated fiber

2.1.3 PDMS（100 μm，紅色）涂層纖維的萃取條件優(yōu)化

圖3a研究了使用100 μm PDMS（紅色）涂層的萃取纖維在四種平衡萃取溫度（35、45、55、65 ℃）下對萃取效率的影響。當(dāng)溫度從35 ℃升至65 ℃時，峰面積和峰個數(shù)呈現(xiàn)先逐漸增加后降低的趨勢，當(dāng)溫度為55 ℃時，峰面積和峰個數(shù)達(dá)到最大，故選擇55 ℃為最適溫度。圖3b研究了當(dāng)平衡萃取溫度為55 ℃時，四種萃取時間（30、40、50、60 min）對萃取效率的影響。當(dāng)萃取時間為50 min時，峰面積和峰個數(shù)達(dá)到最大，故選擇50 min為最適萃取時間。綜合考慮，當(dāng)使用100 μm PDMS（黑色）涂層的萃取纖維時，最佳的萃取條件為平衡萃取溫度55 ℃，萃取時間50 min。

圖3 PDMS涂層纖維萃取溫度（a）與萃取時間（b）的優(yōu)化Fig.3 Optimization of extraction temperatures (a) and times (b)by PDMS coated fiber

2.2 最佳涂層纖維的選擇

不同涂層的萃取纖維，其吸附和解析能力不同，只有選擇適合待測樣品的萃取纖維才能得到最佳的檢測結(jié)果[13]。本文選擇了三種常見的萃取纖維即50/30 μm DVB/CAR/PDMS（灰色），75 μm CAR/PDMS（黑色）與100 μm PDMS（紅色）對小白杏中揮發(fā)性化合物進(jìn)行提取，并結(jié)合GC-MS/MS進(jìn)行分析。離子流圖（圖4）表明三種涂層纖維所萃取到的揮發(fā)性化合物在種類和濃度上有很大的差異。其中，共有22種揮發(fā)性物質(zhì)被這三種涂層的萃取纖維同時萃取出來。9種化合物僅被50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取，11種化合物僅被75 μm CAR/PDMS萃取，3種化合物僅被100 μm PDMS萃?。▓D5a）。不同涂層的萃取纖維所提取到的揮發(fā)性化合物的類型也不同。在50/30 μm DVB/CAR/PDMS所萃取的化合物中醇類物質(zhì)含量最高，其次是酯類化合物，這與100 μm PDMS涂層的萃取結(jié)果相同。當(dāng)使用75 μm CAR/PDMS萃取纖維時，醛類化合物含量最高，酯類化合物其次（圖5b）。綜合考慮，使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS進(jìn)行小白杏中揮發(fā)性化合物的提取時，萃取效果最好，最佳的萃取條件為平衡萃取溫度65 ℃，萃取時間50 min。

圖4 三種涂層的萃取纖維所測揮發(fā)性化合物的離子流圖Fig.4 Ion chromatogram of volatile compounds measured by three kinds of coated extracted fibers

圖5 三種涂層萃取纖維所提取的揮發(fā)性化合物的韋恩圖分析（a）與含量（b）Fig.5 Venn diagram analysis (a) and content (b) of volatile compounds extracted from three extraction fibers

2.3 小白杏中揮發(fā)性化合物的分析

采用HS-SPME-GC-MS/MS分析了小白杏中揮發(fā)性化合物的組成，共鑒定出46種揮發(fā)性化合物：包括8種醇類，8種醛類，13種酯類，5種酮類，7種萜烯類和5種其他類化合物（表1）。其中，醇類物質(zhì)最為豐富（34.57%），其次為酯類（33.77%）和醛類物質(zhì)（24.77%）。酮類，萜烯類和其他類揮發(fā)性物質(zhì)占比非常少，總計僅為6.89%（圖6）。

表1 小白杏中揮發(fā)性化合物的含量Table 1 Content of volatile compounds in Xiaobai apricot

圖6 不同種類的揮發(fā)性化合物的百分比圖Fig.6 Percentage diagram of different types of volatile compounds

如表1所示，在醇類物質(zhì)中，含量最高的為芳樟醇（1 011.72 μg/kg），其次為α-松油醇（470.74 μg/kg），其他醇類化合物含量都相對較低。另外，芳樟醇作為一種天然香料，也廣泛存在于其他新鮮的水果，如蘋果[14]、芒果[15]和西柚[16]中。在醛類物質(zhì)中，苯甲醛的含量最為豐富（957.34 μg/kg），其次是(E)-2-己烯醛（69.73 μg/kg）、糠醛（19.22 μg/kg）以及正己醛（11.31 μg/kg）。此外，兔耳草醛含量最低，僅為0.45 μg/kg。苯甲醛也是日本杏子品種中主要的揮發(fā)性物質(zhì)，含量為305.40 μg/kg[17]，與本文的小白杏相比，含量較低。在C6化合物中，正己醛和(E)-2-己烯醛是杏子中重要的香氣化合物，賦予其草本的香氣[18]。酯類和內(nèi)酯類化合物是使杏子具有果香味的主要物質(zhì)[19]。在酯類化合物中，2-糠酸乙酯的含量最高，為1 076.16 μg/kg。而γ-癸內(nèi)酯是小白杏中最豐富的內(nèi)酯類物質(zhì)，含量為276.13 μg/kg。在先前的研究中，富士蘋果中的酯類物質(zhì)也是主要的香氣組分[20]。

在杏子發(fā)育過程中，前期主要積累醇類、醛類和萜烯類物質(zhì)，成熟時則以酮類和酯類物質(zhì)為主。杏果實中揮發(fā)性香氣也由己醛和己烯醛等清香型物質(zhì)轉(zhuǎn)變成酯類等果香型或酮類等花香型化合物[21]。在杏子成熟后期，脂氧化酶活性降低，這可能與C6醛類物質(zhì)的含量降低有關(guān)[22]。在小白杏中，二氫-β-紫羅蘭酮（49.96 μg/kg）是最豐富的酮類物質(zhì)，β-紫羅蘭酮（39.32 μg/kg）其次。而在“Tokaloglu Yalova”杏中，β-紫羅蘭酮（151.00 μg/kg）卻是含量最高的酮類物質(zhì)。在土耳其的杏子品種中，與其他類的化合物相比，烯萜類物質(zhì)含量較低（104.90～213.60 μg/kg）[23]，在本研究中，其含量與小白杏中萜烯類物質(zhì)的總含量相似。小白杏中濃度最高的萜烯類物質(zhì)為d-檸檬烯，其含量為33.00 μg/kg。在其他類物質(zhì)中，茶螺烷最為豐富（37.94 μg/kg），該物質(zhì)是一種螺環(huán)氧化物，具有天然的紅茶香氣。

2.4 小白杏中香氣化合物的ROAV分析

事實上，并不是所有的揮發(fā)性物質(zhì)都對小白杏的整體風(fēng)味作出貢獻(xiàn)，僅僅依靠物質(zhì)的含量來判斷其重要性的方法具有很大的局限性。香氣閾值是描述風(fēng)味貢獻(xiàn)時的一個重要因素，表示人們開始聞到某種揮發(fā)性物質(zhì)的最低濃度。本研究利用ROAV表征了對小白杏風(fēng)味輪廓起重要貢獻(xiàn)的關(guān)鍵香氣物質(zhì)。

小白杏中β-紫羅蘭酮的含量雖然與其他香氣物質(zhì)的含量相比較低，但因其具有非常低的香氣閾值，因此OAV最大。如表2所示，根據(jù)香氣化合物的ROAV，共篩選出6種對小白杏香氣具有重要貢獻(xiàn)的關(guān)鍵香氣物質(zhì)（ROAV＞1）。除β-紫羅蘭酮之外，γ-癸內(nèi)酯的ROAV也非常高（ROAV=57.45），賦予小白杏強(qiáng)烈的椰子香。其次是二氫-β-紫羅蘭酮（ROAV=11.44）、芳樟醇（ROAV=9.26）、月桂烯（ROAV=4.34）和α-紫羅蘭酮（ROAV=1.44），這些物質(zhì)賦予小白杏果香、花香以及木香等。另外，有9種揮發(fā)性物質(zhì)對小白杏的香氣輪廓起修飾作用（0.1＜ROAV＜1）。它們對小白杏中的青草香、黃瓜味、蜂蜜味、桃香以及果香等也具有一定的貢獻(xiàn)。

表2 小白杏中香氣化合物的ROAV分析Table 2 ROAV analysis of aroma compounds in Xiaobai apricot

2.5 小白杏呈香屬性指紋分析

選擇新疆杏子種植基地另一種受歡迎的品種（吊干杏）作對照，小白杏和吊干杏的香氣輪廓由青草香、果香、椰子香、柑橘香、花香和松香這六種香氣所描述，進(jìn)行呈香屬性指紋分析（圖7）。與吊干杏相比，小白杏具有更濃郁的青草香、果香、椰子香、柑橘香和花香，得分更高。值得注意的是，小白杏在“花香”上的得分幾乎滿分，這可能與小白杏中所含有的β-紫羅蘭酮（ROAV=100）有關(guān)。另外，吊干杏的“松香”得分比小白杏的得分更高，但從整體的香氣輪廓來說，松香遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如其它香氣強(qiáng)烈。小白杏中的青草香和柑橘香與其他香型相比，得分較低。這說明小白杏在成熟期時，其香氣化合物主要由酯類和酮類物質(zhì)為主。除“花香”以外，吊干杏的整體香氣較弱。

圖7 杏子的呈香屬性指紋分析Fig.7 The aroma fingerprint of apricot

3 結(jié)論

在進(jìn)行小白杏香氣提取時，對三種不同涂層的萃取纖維，即DVB/CAR/PDMS（灰色，50/30 μm）、CAR/PDMS（黑色，75 μm）和PDMS（紅色，100 μm）進(jìn)行了條件優(yōu)化，最終選擇使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS的萃取纖維，萃取溫度65 ℃，萃取時間50 min，此時萃取效率最好，峰面積最大，峰個數(shù)最多。

采用HS-SPME-GC-MS/MS技術(shù)鑒定出小白杏中共含有46種揮發(fā)性物質(zhì)，包括8種醇類、8種醛類、13種酯類、5種酮類、7種萜烯類和5種其他類化合物。其中醇類物質(zhì)含量最高（34.57%），其次是酯類（33.77%）和醛類化合物（24.77%）。芳樟醇，苯甲醛，2-糠酸乙酯，二氫-β-紫羅蘭酮，d-檸檬烯以及茶螺烷分別是含量最為豐富的醇類、醛類、酯類、酮類、萜烯類以及其他類別的化合物。利用ROAV表征了小白杏的整體香氣輪廓。除β-紫羅蘭酮（ROAV=100）之外，γ-癸內(nèi)酯、二氫-β-紫羅蘭酮、芳樟醇、月桂烯和α-紫羅蘭酮的ROAV都大于1，被認(rèn)為是關(guān)鍵的香氣物質(zhì)，這些物質(zhì)賦予小白杏濃郁的花香、果香以及木香。另外，本研究分析了小白杏的呈香屬性指紋。與吊干杏相比，小白杏的青草香、果香、椰子香、柑橘香以及花香更為強(qiáng)烈，只有木香較弱。