牦牛肉肌原纖維蛋白在不同pH值條件下的分子結(jié)構(gòu)變化

屈莎，胡婷，唐善虎，李思寧，郝剛

（西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610000）

蛋白質(zhì)氧化被認(rèn)為是食品變質(zhì)的原因之一，它對(duì)食品質(zhì)量的影響包括嫩度降低、變色和風(fēng)味劣變，普遍存在于肉及肉制品加工與儲(chǔ)藏過程中。蛋白氧化不僅會(huì)導(dǎo)致蛋白分子間和分子內(nèi)的共價(jià)交聯(lián)，還會(huì)引起蛋白主鏈斷裂和氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的修飾，進(jìn)而引起蛋白質(zhì)功能性質(zhì)如凝膠特性、界面性質(zhì)及保水性發(fā)生改變[1]。肉及肉制品中的蛋白質(zhì)氧化反應(yīng)主要由活性促氧化物質(zhì)（如活性氧物質(zhì)、活性氮物質(zhì)、脂類次級(jí)氧化產(chǎn)物及內(nèi)源性氧化酶等）直接或間接地誘導(dǎo)發(fā)生。從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性質(zhì)的改變，包括通過非共價(jià)和共價(jià)分子間相互作用的斷裂、交聯(lián)聚集?；钚匝酰≧OS）傾向于攻擊蛋白質(zhì)，以促進(jìn)功能和巰基的喪失。氧化蛋白的其他變化包括羰基衍生物的形成、蛋白質(zhì)的去折疊、表面疏水性的增加和構(gòu)象的變化。在ROS中，羥基自由基分子量小，易于擴(kuò)散，氧化能力強(qiáng)，是引起肌肉中脂肪和蛋白氧化的主要發(fā)起者，它是在過氧化氫、還原過渡金屬和細(xì)胞還原劑存在下通過羥自由基（Fenton）反應(yīng)形成的[2]。

pH值不僅是影響肌原纖維蛋白（MP）萃取效率的因素，也是引起蛋白構(gòu)象改變的主要條件之一。pH值可以通過改變氨基酸側(cè)鏈電荷的數(shù)量及分布，改變蛋白質(zhì)分子間的相互作用及蛋白質(zhì)分子的折疊狀態(tài)，從而引起蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變，最終影響著蛋白質(zhì)的各種功能性質(zhì)[3]。

牦牛分布在中國(guó)青藏高原海拔3 000 m以上地區(qū)，被譽(yù)為“高原之舟”，具有高蛋白、低脂肪、豐富的氨基酸等優(yōu)點(diǎn)，但在其加工儲(chǔ)藏運(yùn)輸過程中受環(huán)境影響易發(fā)生蛋白氧化。pH值是影響蛋白品質(zhì)變化最為重要的因素之一，但目前研究多是pH值對(duì)大豆分離蛋白[4]、乳清蛋白[5]、羔羊[6]、豬肉[7]等特性的研究，對(duì)于牦牛肉的研究甚少，因此本研究在之前研究的基礎(chǔ)上模擬酸性、中性、堿性條件下，建立了羥基自由基氧化體系（Fenton體系），從分子結(jié)構(gòu)方面探究在不同pH值下不同H2O2濃度對(duì)牦牛肉MP理化特性的影響，充分挖掘蛋白氧化機(jī)理及本質(zhì)，以期為深入研究肉及肉制品中蛋白質(zhì)氧化的相關(guān)性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛肉購(gòu)于四川省阿壩州，宰殺后冷卻排酸，快速冷凍后低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室-20 ℃保存。

EGTA（乙二醇雙(2-氨基乙基酸)四乙酸）、NaH2PO4·H2O、2,4-二硝基苯肼（DNPH)、Na2HPO4·12H2O、抗壞血酸、EDTA（乙二胺四乙酸）、三氯乙酸，成都科隆化學(xué)品有限公司；鹽酸胍、Tris，德國(guó)BioFroxx公司；5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（DTNB），上海源葉生物；2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS），成都化夏化學(xué)；所有試劑都為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

5804R冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；T-25高速勻漿機(jī)，德國(guó)IKA公司；UV1810S紫外分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；F-4700型熒光分光光度計(jì)，日本那珂事務(wù)所；ASD Field Spec Pro FR傅里葉變換紅外色譜，美國(guó)Boulder公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維蛋白（MP）的提取

參考Park等[8]的方法從牦牛背最長(zhǎng)肌中分離提取肌原纖維蛋白，最終得到的沉淀MP于4 ℃冰箱中保存，48 h內(nèi)使用。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度用雙縮脲法進(jìn)行測(cè)定，牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白（y=0.048 1x+0.001 2，R2=0.999 7）。

1.3.2 肌原纖維蛋白氧化模型構(gòu)建

參考Xiong等[9]的方法略作修改，將肌原纖維蛋白質(zhì)用15 mmol/L PIPES（0.6 mol/L NaCl，pH值6.0）溶解后質(zhì)量濃度為10 mg/mL的MP分散于Fenton氧化體系（0.01 mmol/L FeCl3，0.1 mmol/L抗壞血酸，5、10、15、20、40、60 mmol/L H2O2）中，用NaOH和HCl調(diào)節(jié)所需pH值（5.0、6.0、7.0、8.0），于4 ℃下氧化24 h，以1 mmol/L EDTA（最終濃度）終止氧化。對(duì)照組用去離子水代替H2O2。氧化結(jié)束后確定MP的pH值為5.0、6.0、7.0、8.0。

1.3.3 羰基的測(cè)定

羰基含量的測(cè)定參照Oliver等[10]的方法，使用2,4-二硝基苯肼（DNPH）反應(yīng)方法進(jìn)行測(cè)定。羰基含量表示為nmol/mg pro。

式中：

C——羰基含量，nmol/mg pro；

A1——樣品吸光值；

c——MP質(zhì)量濃度，mg/mL；

D——比色光徑，cm；

n——稀釋倍數(shù)。

1.3.4 巰基的測(cè)定

總巰基和游離巰基參考Ellman[11]的方法，采用DTNB法進(jìn)行測(cè)定。巰基含量（nmol/mg pro）使用摩爾吸光系數(shù)13 600 L/(mol·cm)計(jì)算。

式中：

S——巰基含量，nmol/mg pro；

A2——樣品吸光度；

c——MP質(zhì)量濃度，mg/mL；

n——稀釋倍數(shù)。

1.3.5 游離氨基測(cè)定

參考吳偉[12]的方法，略作修改。將一定量的肌原纖維蛋白樣液分散于含1%（m/V）SDS，0.1 mol/L pH值9.3的四氫硼酸鈉緩沖液中，攪拌1 h后8 000g離心20 min，取2 mL上清液與100 μL 0.03 mol/L TNBS混勻后在37 ℃保溫1 h，反應(yīng)結(jié)束后加入0.5 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至4.0，在335 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值，代入甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.009 5x-0.001 2，R2=0.999 2），求其游離氨基。

1.3.6 溶解度的測(cè)定

參考Peyrano等[13]的方法，將1 mg/mL的MP樣液離心（4 ℃，5 000g，10 min），用雙縮脲法測(cè)定其上清液的蛋白濃度。溶解度表示以離心前后蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的比值來(lái)表示。

1.3.7 表面疏水性的測(cè)定

表面疏水性測(cè)定參考簡(jiǎn)華君[14]的方法，用1-苯氨基萘-8-磺酸（ANS）作為熒光探針對(duì)表面疏水性進(jìn)行測(cè)定的，在激發(fā)波長(zhǎng)374 nm，發(fā)射波長(zhǎng)484 nm條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度。后以相對(duì)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，蛋白濃度為橫坐標(biāo)作圖，初始斜率即為肌原纖維蛋白質(zhì)溶液的表面疏水指數(shù)。

1.3.8 內(nèi)源熒光測(cè)定

參考Jiang等[15]的方法適當(dāng)修改測(cè)定蛋白內(nèi)源熒光光譜。用與蛋白pH值相對(duì)應(yīng)的磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L，pH值5.0、6.0、7.0、8.0）調(diào)節(jié)肌原纖維蛋白濃度至0.5 mg/mL，在激發(fā)波長(zhǎng)295 nm條件下，測(cè)定色氨酸在300～400 nm間的熒光光譜。

1.3.9 傅里葉紅外光譜測(cè)定

參考Kang等[16]的方法，略作修改。將氧化后的蛋白真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥后，用傅立葉紅外光譜儀測(cè)定。結(jié)果用Peak fit 4.0軟件分析1 600～1 700 cm-1的圖譜。

1.3.10 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

參考Xiong等[17]的方法，略作修改。將蛋白質(zhì)量濃度調(diào)至1.0 mg/mL，與5×上樣緩沖液混合（蛋白:上樣緩沖液=4:1，V/V），水浴5 min冷卻至室溫，離心（10 000g，10 min），取上清液用于電泳分析。樣品上樣體積10 μL，分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%，電極緩沖液為Tris-甘氨酸緩沖液（0.05 mol/L Tris，0.384 mol/L甘氨酸，0.1% SDS（V/V，pH值8.3）。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，用洗脫液（10%乙醇，10%冰醋酸，V/V）進(jìn)行脫色。

1.3.11 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理和差異顯著性分析分別采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，SPSS軟件中的Duncan比較進(jìn)行顯著性水平分析，繪圖采用Origin軟件進(jìn)行，所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白氧化對(duì)牦牛肉MP羰基含量的影響

如圖1所示，隨著MP中H2O2濃度的升高，羰基含量增加，與對(duì)照組相比，羰基含量增加顯著（P＜0.05)，但10～15 mmol/L、15～20 mmol/L、40～60 mmol/L之間羰基含量不顯著（P＞0.05），蛋白氧化產(chǎn)生的羰基可與其他蛋白分子的氨基（賴氨酸殘基的ε-氨基）發(fā)生席夫堿反應(yīng)使蛋白間產(chǎn)生共價(jià)交聯(lián)，因此蛋白氧化過程中羰基在不斷產(chǎn)生的同時(shí)也在一定程度上消耗[18]。pH值對(duì)H2O2濃度為5 mmol/L的MP羰基含量無(wú)顯著影響（P＞0.05），隨著H2O2濃度的加深，pH值7.0、8.0時(shí)（遠(yuǎn)離肌原纖維蛋白等電點(diǎn)（pI，5.0～5.5）[19]）羰基含量上升速率明顯低于pH值5.0、6.0（pI附近）的羰基增速，尤其是pH值6.0，說明在同等氧化條件下，等電點(diǎn)附近的MP更易受羥自由基（·OH）攻擊導(dǎo)致蛋白主肽鏈斷裂。

圖1 不同pH值（5.0、6.0、7.0、8.0）下不同H202濃度對(duì)MP羰基含量的影響Fig.1 Effect of different H2O2 concentration on carbonyl of MP at different pH values (5.0, 6.0, 7.0, 8.0)

2.2 蛋白氧化對(duì)牦牛肉MP巰基的影響

半胱氨酸的巰基是對(duì)氧化最敏感的蛋白側(cè)鏈基團(tuán)之一，是MP中一個(gè)關(guān)鍵的活性官能團(tuán)，微環(huán)境的變化誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開可以暴露半胱氨酸殘基，最終導(dǎo)致二硫鍵的形成進(jìn)一步導(dǎo)致蛋白分子聚集，因此巰基是除羰基外另一個(gè)衡量蛋白氧化的重要指標(biāo)[20]。如圖2所示，隨著蛋白氧化程度的加深，總巰基含量降低顯著（P＜0.05），同時(shí)，隨著H2O2濃度的增加，游離巰基顯著降低（P＜0.05）。氧化后，總巰基和游離巰基顯著低于對(duì)照組，表明牦牛肉MP巰基對(duì)羥基自由基敏感。巰基氧化可分為可逆狀態(tài)（二硫鍵結(jié)合和次磺酸）和不可逆狀態(tài)（亞硫酸鹽和磺酸）[12]，在同等氧化條件下，pH值為7.0、8.0時(shí)（遠(yuǎn)離pI），MP總巰基下降的絕對(duì)值大于游離巰基下降的絕對(duì)值，表明蛋白氧化使得MP二硫鍵含量下降，即MP巰基被氧化成不可逆狀態(tài)，形成了含硫化合物。而pH值為5.0、6.0時(shí)（pI附近），MP游離巰基下降的絕對(duì)值大于總巰基下降的絕對(duì)值，表明蛋白氧化使得MP二硫鍵含量上升，說明游離巰基氧化成二硫鍵的量大于二硫鍵轉(zhuǎn)化成不可逆氧化狀態(tài)的量。在酸性條件下巰基下降速率大于在堿性條件下，這表明酸處理的蛋白更容易通過硫醇-二硫化物交換反應(yīng)在分子間形成新的二硫鍵[21]。

圖2 不同pH值下不同H2O2濃度對(duì)MP于巰基含量的影響Fig.2 Effect of different H2O2 degree on MP sulfhydryl under different pH values

2.3 蛋白氧化對(duì)牦牛肉MP游離氨基的影響

游離氨基是用來(lái)反映蛋白氧化程度的常用指標(biāo)。如圖3所示隨著H2O2濃度的增加，游離氨基含量顯著降低（P＜0.05），當(dāng)MP中H2O2濃度達(dá)到60 mmol/L時(shí)，游離氨基大約是對(duì)照組的一半。蛋白氧化產(chǎn)生的羰基會(huì)與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)形成席夫堿，導(dǎo)致蛋白分子中游離氨基下降；肉制品中脂肪氧化產(chǎn)物烯醛類物質(zhì)可以與半胱氨酸、賴氨酸殘基、組氨酸發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白中游離氨基的下降；當(dāng)氧化引起蛋白共價(jià)交聯(lián)形成聚集體時(shí)，由于氨基包裹在聚集體內(nèi)部而未被試劑檢測(cè)到，這也會(huì)造成游離氨基量的下降[22]。隨著氧化條件的加強(qiáng)，pH值7.0、8.0時(shí)（遠(yuǎn)離pI）游離氨基下降速率明顯低于pH值5.0、6.0時(shí)（pI附近），pH值為6.0時(shí)MP氧化程度最深，這一結(jié)果與羰基結(jié)果相吻合。

圖3 不同pH值下不同H202濃度對(duì)MP游離氨基的影響Fig.3 Effects of different H2O2 levels on MP free amino groups at different pH values

2.4 蛋白氧化對(duì)牦牛肉MP溶解度的影響

蛋白溶解度主要受蛋白質(zhì)分子間相互作用（如疏水相互作用、二硫鍵等）與蛋白質(zhì)-水相互作用（如離子-偶極、偶極-偶極等）兩方面作用力的影響[23]。蛋白質(zhì)-水相互作用增強(qiáng)則蛋白溶解度上升，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用增強(qiáng)則蛋白溶解度下降。不同pH值、不同H2O2濃度下MP溶解度變化如圖4所示。相同H2O2濃度下隨著pH值的增加蛋白溶解度顯著增加（P＜0.05）。MP在pI（5.3左右）附近所帶的電荷最少，蛋白質(zhì)之間缺乏靜電排斥，分子間作用由于疏水相互作用而得到增強(qiáng)，導(dǎo)致蛋白聚集或沉淀。隨著pH值遠(yuǎn)離pI，MP所帶負(fù)電荷增加，靜電斥力分子間相互作用力減弱，使得蛋白質(zhì)-水相互作用逐漸增強(qiáng)，導(dǎo)致蛋白溶解度升高。在同一pH值下，隨著蛋白氧化濃度的增加，MP溶解度與對(duì)照組相比溶顯著減低（P＜0.05）。這主要是由于蛋白氧化引起共價(jià)交聯(lián)，形成不溶性聚集體，而且隨H2O2濃度不斷上升不溶性聚集體越多，引起蛋白溶解度進(jìn)一步下降[22]。

圖4 不同pH值下不同H202濃度對(duì)MP溶解度的影響Fig.4 Effect of different H2O2 levels on MP solubility at different pH values

2.5 蛋白氧化對(duì)牦牛肉MP表面疏水性的影響

表面疏水性是評(píng)估蛋白質(zhì)化學(xué)和物理狀態(tài)變化的一個(gè)指標(biāo)[24]。熒光探針1-苯氨基萘-8-磺酸（ANS）處于水相環(huán)境時(shí)幾乎不發(fā)射熒光，當(dāng)處于疏水環(huán)境中時(shí)，ANS熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)，因此ANS探針的熒光強(qiáng)度變化可反應(yīng)其所處微環(huán)境的疏水性改變。ANS傾向與蛋白疏水區(qū)域結(jié)合，采用ANS可測(cè)定蛋白表面疏水性變化。由圖5可知，當(dāng)pH值一定時(shí)，隨著H2O2濃度的增加，與對(duì)照組相比疏水性顯著升高（P＜0.05），H2O2濃度越大，蛋白表面疏水性越大。這是因?yàn)榈鞍籽趸瘜?dǎo)致蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，蛋白質(zhì)去折疊，大量疏水基團(tuán)暴露。另外，氧化過程中球蛋白表面氨基酸殘基被氧化修飾引起的疏水性變化較為復(fù)雜，Met的疏水性側(cè)鏈轉(zhuǎn)化為親水基團(tuán)；Lys的ε-氨基氧化成電中性的羰基衍生物，降低了正電荷性，導(dǎo)致親水性下降；而Lys、Cys及His能與肉品中脂類的氧化產(chǎn)物α,β-不飽和醛發(fā)生邁克爾加成，在蛋白側(cè)鏈上接上長(zhǎng)鏈烷烴，從而使疏水性增加[25]。pH值5.0時(shí)的疏水性顯著高于其他組（P＜0.05），在等電點(diǎn)附近時(shí)，MP表面電荷減少，分子間斥力降低，蛋白彼此形成疏水性聚集體，隨著pH值增加逐漸遠(yuǎn)離pI，分子間排斥力增強(qiáng)，靠疏水相互作用驅(qū)動(dòng)的蛋白質(zhì)聚集行為削弱，疏水性降低[24]。

圖5 不同pH值下不同H202濃度對(duì)MP表面疏水性的影響Fig.5 Effect of different H2O2 degrees on the hydrophobicity of MP surfaces at different pH values

圖6 不同pH值下不同H2O2濃度對(duì)MP內(nèi)源熒光的影響Fig.6 Effect of different H2O2 levels on endogenous fluorescence of MP at different pH values

2.6 蛋白氧化對(duì)牦牛肉MP內(nèi)源熒光的影響

色氨酸內(nèi)源熒光可以反應(yīng)MP色氨酸所處微環(huán)境和氧化狀態(tài)的變化[26]，進(jìn)而能夠表征蛋白氧化對(duì)MP高級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。在各pH值組中，隨著H2O2濃度的增加各樣品的λmax藍(lán)移，且與對(duì)照組相比，λmax藍(lán)移顯著（P＜0.05），且熒光強(qiáng)度（FI）持續(xù)下降，各處理組間差異顯著（P＜0.05），λmax從最初的342左右藍(lán)移至339左右，F(xiàn)I下降了1.3倍，色氨酸是蛋白質(zhì)氨基酸中單電子氧化勢(shì)能最低的氨基酸，對(duì)·OH較為敏感，很容易被氧化成色氨酸自由基，與分子氧結(jié)合后形成色氨酸過氧化自由基，最終形成犬尿氨酸，引起內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降。λmax與色氨酸所處微環(huán)境有關(guān)，當(dāng)色氨酸殘基由水相環(huán)境轉(zhuǎn)移到疏水環(huán)境時(shí)，其熒光光譜會(huì)藍(lán)移，當(dāng)色氨酸殘基由疏水環(huán)境轉(zhuǎn)移到水相環(huán)境時(shí)，熒光光譜會(huì)紅移。Trp熒光光譜的藍(lán)移表明，由于氧化引起蛋白質(zhì)聚集，MP中最先暴露的色氨酸殘基嵌入到了氧化MP聚集體的內(nèi)部[25]。pH值為5.0時(shí)的λmax顯著高于其它pH值組（P＜0.05），即隨著pH值的增加，λmax藍(lán)移，這一結(jié)果是由于當(dāng)pH值在pI附近時(shí)，易發(fā)生蛋白氧化，發(fā)生去折疊現(xiàn)象，三級(jí)結(jié)構(gòu)展開引起疏水基團(tuán)暴露[27]，疏水性增強(qiáng)，這與之前疏水性研究一致。而pH值在7.0和8.0時(shí)TrpFI顯著高于pH值為5.0時(shí)，這可能是因?yàn)榇蠖鄶?shù)具有酸性或堿性官能團(tuán)的芳香化合物的熒光與溶液的pH值有關(guān)。不同的pH值、化合物的不同狀態(tài)、化合物分子和離子的不同電子構(gòu)型，使得熒光強(qiáng)度就有了一定差異[28]。

2.7 蛋白氧化對(duì)牦牛肉MP二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)氧化引起的主肽鏈斷裂和共價(jià)交聯(lián)都會(huì)伴隨著內(nèi)部結(jié)構(gòu)的改變，其中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變是最為重要的指標(biāo)之一，可利用紅外光譜（FT-IR)進(jìn)行測(cè)量。在酰胺I區(qū)（1 600～1 700 cm-1）可以反映蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。肽鏈中N-H基團(tuán)的平面彎曲和C-O基團(tuán)的伸縮振動(dòng)會(huì)影響這一區(qū)域，此外，肽鍵中C-N的伸縮振動(dòng)也能改變這一區(qū)域[29]。牦牛肉MP的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無(wú)規(guī)則卷曲變化如圖7所示，不同pH值條件下，隨著H2O2濃度的增加，無(wú)規(guī)則卷曲顯著增加（P＜0.05），即二級(jí)結(jié)構(gòu)總比例顯著下降。其中β-折疊顯著增加（P＜0.05），α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角顯著減少（P＜0.05），蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由有序變?yōu)闊o(wú)序，朝著不穩(wěn)定的方向轉(zhuǎn)變。而與pH值7.0相比，pH值5.0和6.0處理的肌原纖維蛋白質(zhì)具有較高的β-折疊結(jié)構(gòu)和較低的α-螺旋。

圖7 不同pH值下不同H2O2濃度對(duì)MP二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig.7 Effect of different H2O2 degree on MP secondary structure at different pH values

2.8 MP SDS-PAGE分析

蛋白主肽鏈的氧化會(huì)引起肽鏈斷裂，蛋白分子量減少，同時(shí)蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)如半胱氨酸巰基氧化形成二硫鍵、酪氨酸氧化形成二聚酪氨酸，使得蛋白質(zhì)分子間發(fā)生交聯(lián)聚集[30]，此外蛋白氧化產(chǎn)生的羰基衍生物可與其他蛋白的氨基通過席夫堿反應(yīng)形成交聯(lián)聚集，SDS-PAGE電泳可以分析氧化后MP的聚集情況。β巰基乙醇（β-ME）作為一種強(qiáng)還原劑，可還原二硫鍵[31]。由圖8可知，當(dāng)pH值為5.0時(shí)，H2O2濃度＞20 mmol/L時(shí)，未加β-ME的肌球蛋白重鏈（MHC）條帶幾乎消失，隨H2O2濃度深入蛋白交聯(lián)聚集程度逐漸加強(qiáng)，而加入β-ME的MHC還有清晰可見的條帶，但比低濃度組（＜20 mmol/L）顏色淺，可見MP在低濃度氧化時(shí)的交聯(lián)主要依靠二硫鍵，而在較高濃度氧化時(shí)，其他的共價(jià)交聯(lián)占有相當(dāng)比例。pH值為6.0時(shí)，未加β-ME的MHC條帶隨著H2O2濃度增加（＞5 mmol/L）顏色變淺，60 mmol/L時(shí)條帶幾乎消失；而加入β-ME的條帶與pH值為5.0時(shí)的情況類似，H2O2＞5 mmol/L時(shí)，蛋白已經(jīng)發(fā)生聚集，且以二硫鍵交聯(lián)為主，高濃度時(shí)其他的共價(jià)交聯(lián)形式增多。pH值7.0時(shí)，未加β-ME的MHC條帶要在60 mmol/L時(shí)才開始變淺，此前蛋白氧化交聯(lián)程度較低，較少形成二硫鍵。pH值8.0時(shí)，無(wú)論是否加入β-ME，MHC條帶與對(duì)照組相比差別不明顯。因此在氧化過程中，MP在酸性條件下更易發(fā)生交聯(lián)聚集，在低氧化環(huán)境中，二硫鍵是導(dǎo)致蛋白發(fā)生交聯(lián)的主要作用力，H2O2濃度增加也會(huì)導(dǎo)致其他的共價(jià)交聯(lián)，這也證明了半胱氨酸的巰基相對(duì)于其他蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)要對(duì)氧化更敏感。

圖8 在不同pH值下不同H2O2濃度的電泳圖Fig.8 Electrophoresis diagram of different H2O2 levels at different pH values

3 結(jié)論

本研究討論了不同pH值下不同H2O2濃度對(duì)牦牛肉MP在分子水平上的影響。在一定pH值條件下隨著H2O2濃度的增加羰基、表面疏水性顯著增加（P＜0.05），總巰基、游離巰基、游離氨基、溶解度、內(nèi)源熒光強(qiáng)度顯著下降（P＜0.05），λmax藍(lán)移，二級(jí)結(jié)構(gòu)總比例顯著下降（P＜0.05），其中，β-折疊顯著增加（P＜0.05)，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角顯著減少（P＜0.05），蛋白分子間發(fā)生交聯(lián)聚合；在一定氧化條件下，等電點(diǎn)附近，肌原纖維蛋白的氧化程度更高，這是由于等電點(diǎn)附近，靜電荷少，蛋白之間靜電斥力小，蛋白與水之間相互作用力低，MP更易受到羥自由基的攻擊。隨著pH值偏離等電點(diǎn)，表面疏水性顯著降低（P＜0.05），溶解度顯著增加（P＜0.05），λmax藍(lán)移，F(xiàn)I顯著增加（P＜0.05），β-折疊結(jié)構(gòu)降低，α-螺旋結(jié)構(gòu)增加，pH值在6.0時(shí)，蛋白生成的聚集體穩(wěn)定性較好。MP的氧化伴隨著二級(jí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變、骨架斷裂和交聯(lián)聚集，二硫和非二硫共價(jià)鍵都貢獻(xiàn)了蛋白的交聯(lián)，而MP的分子結(jié)構(gòu)的改變進(jìn)一步影響了其功能，包括溶解性、凝膠性和乳化性等的變化。