PICU重癥肺炎患兒纖維支氣管鏡肺泡灌洗液中PI3K、MMP-9表達及其臨床意義

姜家利 陳婷 童文佳 丁潔 徐衛(wèi)華

安徽省兒童醫(yī)院兒科（合肥 230001）

兒科重癥監(jiān)護病房（pediatric intensive care unit，PICU）重癥肺炎具有發(fā)病率高、病變進展快的特點［1?2］。重癥肺炎不僅可進展為肺不張、壞死性肺炎等嚴重疾病，還可誘發(fā)肺外并發(fā)癥，造成多組織器官功能障礙［3-4］。纖維支氣管鏡肺泡灌洗術(shù)是臨床治療PICU 重癥肺炎患兒常用的方法，可清除患兒肺部痰液，阻止肺內(nèi)分泌物堆積，有效控制肺部感染，但不同PICU 重癥肺炎患兒治療療效具有明顯差異［5］。早期評估PICU 重癥肺炎患兒纖維支氣管鏡肺泡灌洗術(shù)后治療轉(zhuǎn)歸情況，可指導臨床早期及時調(diào)整醫(yī)療方案，改善患兒預后。目前國內(nèi)外研究［6-7］指出，磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B 信號通路是調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、運動、代謝和存活的核心信號通路之一，參與肺部感染炎性反應過程，與肺炎發(fā)生、病情進展有關(guān)的炎癥級聯(lián)反應關(guān)系密切，抑制該信號通路途徑可促進自噬反應。基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metal?loproteinase 9，MMP-9）是含鋅內(nèi)肽酶家族成員之一，可降解細胞外基質(zhì)蛋白，損壞呼吸系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，在炎性反應造成的呼吸系統(tǒng)結(jié)構(gòu)改變中具有重要作用［8］。筆者推測PICU 重癥肺炎患兒纖維支氣管鏡肺泡灌洗液中PI3K、MMP-9 表達與患兒病情、預后有關(guān)，但目前尚缺乏其關(guān)系驗證的有關(guān)報道。明確PICU 重癥肺炎患兒纖維支氣管鏡肺泡灌洗液中PI3K、MMP-9 表達與預后的關(guān)系，可能為臨床治療重癥肺炎提供更多新的靶點方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2021 年1 月到2022 年6 月醫(yī)院PICU 收治的103 例重癥肺炎患兒為研究對象，其中男53 例，女50 例，年齡6 個月至6 歲，平均（4.19±0.53）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批（編號：EYLL-2019-013）。納入標準：（1）符合《中國急診重癥肺炎臨床實踐專家共識》［9］中重癥肺炎診斷標準，即符合至少1 項主要標準：需機械通氣，體液復蘇后仍需血管活性藥物；或滿足至少3 項次要標準：發(fā)熱，呼吸頻率≥ 50 次/min，動脈血氧分壓/吸入氧濃度< 250 mmHg，影像學檢查顯示多肺葉浸潤，出現(xiàn)意識障礙，血尿素氮≥ 7 mmol/L，低血壓且需液體復蘇；（2）預計生存時間> 3 d；（3）入院前未接受相關(guān)治療者；（4）患兒監(jiān)護人簽署研究知情同意書。

排除標準：（1）入住PICU 24 h 內(nèi)死亡者；（2）長期使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、免疫增強劑等藥物者；（3）入院治療前已行機械通氣、氣管切開者；（4）伴先天性發(fā)育異常、先天性心臟病等疾病者；（5）伴肺結(jié)核、支氣管肺炎、肺纖維化、間質(zhì)性肺部疾病、呼吸衰竭者；（6）伴免疫系統(tǒng)疾病者；（7）無法配合完成本研究者；（8）家屬放棄治療者。

1.2 方法

1.2.1 治療方案所有患兒入院后參照《中國急診重癥肺炎臨床實踐專家共識》［9］，依據(jù)個體情況給予抗感染（根據(jù)病原菌測定結(jié)果給予萬古霉素、美羅培南抗菌治療）、機械通氣、補液支持治療、血管活性藥物維持循環(huán)、營養(yǎng)支持、纖維支氣管鏡肺泡灌洗術(shù)等對癥治療。

1.2.2 纖維支氣管鏡肺泡灌洗術(shù)所有研究對象均經(jīng)纖維支氣管鏡肺泡灌洗（采用0.9%氯化鈉溶液，灌洗量1 mL/kg），術(shù)前常規(guī)禁食、禁飲，鼻咽部局部麻醉采用1%利多卡因，靜脈鎮(zhèn)靜使用咪達唑侖，監(jiān)測血壓等生命體征，仰臥位，通過鼻腔單側(cè)置入纖維支氣管鏡，觀察并確定病變區(qū)域，送檢氣管、支氣管與鼻咽位置分泌物，調(diào)整負壓多次灌洗氯化鈉溶液，灌洗結(jié)束后，在感染病變支氣管內(nèi)注入5～10 mL 敏感抗生素（生理鹽水稀釋），多次灌洗后吸出灌洗液，術(shù)后禁食2 h。

1.2.3 纖維支氣管鏡肺泡灌洗液中PI3K、MMP?9測定術(shù)后離心分離肺泡灌洗液（轉(zhuǎn)速3 500 r/min，離心時間15 min，離心半徑10 cm），采用酶聯(lián)免疫吸附法測定肺泡灌洗液中MMP-9 水平，試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）測定PI3K 表達情況，Trizol 裂解液提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國Qiagen 公司）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板進行qRT-PCR，反應體系：cDNA 1 μL、正反向引物各0.5 μL、PCR 緩沖液10 μL、蒸餾水8 μL，95 ℃預變性3 min，95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，70 ℃延伸5 min，共35個循環(huán)。內(nèi)參用GAPDH（正向：5'-ACG?GCTGCCTGGTCTGGTCCGCCG-3'，反向：5'-GCTG?GCTGGCGGCGTGCCGGGC-3'），2-ΔΔCt法計算PI3K（正向：5'-AGCCGGTCCCGGGTCGGGTCTGCGG-3'，反向：5'-GTTGCCTGGGCGTCGTGTCCGCC-3'）mRNA相對表達量。

1.2.4 收集資料收集所有患兒基本資料及纖維支氣管鏡肺泡灌洗術(shù)后的指標，包括性別、年齡、身高、體質(zhì)量、喂養(yǎng)方式、體溫、是否休克、是否伴并發(fā)癥，入住重癥監(jiān)護室48 h 內(nèi)的兒童危重病例評分（pediatric critical illness score，PCIS）［10］、兒童器官功能障礙2（pediatric logistic organ dysfunction-2，PELOD-2）評分［11］，纖維支氣管鏡肺泡灌洗術(shù)后心率、呼吸頻率、平均動脈壓、氧合指數(shù)、血小板（platelets，PLT）計數(shù)、血紅蛋白、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）、血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（as?partate aminotransferase，AST）、白細胞（white blood cell，WBC）計數(shù)、機械通氣時間、PICU 停留時間及肺泡灌洗液中PI3K、MMP-9 水平、肺泡灌洗治療藥物（萬古霉素、美羅培南）。

1.2.5 患兒預后情況評價方法患兒入院后隨訪21 d，參照《中國急診重癥肺炎臨床實踐專家共識》［9］評價預后情況，將患兒治療后發(fā)熱、呼吸困難等體征基本消失或明顯好轉(zhuǎn)，胸部X 線顯示肺部病灶基本吸收，生存良好記為預后良好，否則記為預后不良。

1.3 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)處理采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較做χ2檢驗；相關(guān)分析用Pearson 法；繪制ROC 曲線；影響因素的分析采用logistic 回歸分析模型。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PICU 重癥肺炎患兒近期預后情況103 例PICU 重癥肺炎患兒隨訪期間預后不良29 例（28.16%），其余74 例（71.84%）預后良好。

2.2 PICU 重癥肺炎患兒預后不良組及預后良好組基本資料預后不良組及預后良好組患兒的性別、年齡、身高、體質(zhì)量、喂養(yǎng)方式、體溫、心率、呼吸頻率、平均動脈壓、PLT、血紅蛋白、FIB、ALT、AST、WBC、重癥監(jiān)護室停留時間、肺泡灌洗治療藥物對比，差異均無統(tǒng)計學意義（P> 0.05）；預后不良組的合并休克占比、伴并發(fā)癥占比、PELOD-2評分、機械通氣時間、PI3K mRNA 相對表達量、MMP-9 水平均高于預后良好組（P< 0.05），預后不良組的PCIS 評分、氧合指數(shù)均低于預后良好組（P< 0.05）。見表1。

表1 PICU 重癥肺炎患兒預后不良組及預后良好組基本資料比較Tab.1 Comparison of basic data between poor prognosis group and good prognosis group of PICU children with severe pneumonia ±s

表1 PICU 重癥肺炎患兒預后不良組及預后良好組基本資料比較Tab.1 Comparison of basic data between poor prognosis group and good prognosis group of PICU children with severe pneumonia ±s

因素性別［例（%）］女男年齡（歲）身高（cm）體質(zhì)量（kg）喂養(yǎng)方式［例（%）］母乳喂養(yǎng)奶源喂養(yǎng)混合喂養(yǎng)體溫（℃）合并休克［例（%）］伴并發(fā)癥［例（%）］PCIS評分（分）PELOD-2評分（分）心率（次/min）呼吸頻率（次/min）平均動脈壓（mmHg）氧合指數(shù)（mm Hg）PLT（×109/L）血紅蛋白（g/L）FIB（g/L）ALT（U/L）AST（U/L）WBC（×109/L）機械通氣時間（d）重癥監(jiān)護室停留時間（d）PI3K mRNA 相對表達量MMP-9（μg/L）肺泡灌洗治療藥物［例（%）］萬古霉素美羅培南預后不良組（n=29）預后良好組（n=74）t/χ2值1.820 P值0.177 11（37.93）18（62.07）4.21±0.52 103.19±3.82 14.27±1.69 39（52.70）35（47.30）4.34±0.56 104.21±3.92 14.53±1.75 1.080 1.196 0.685 1.413 0.283 0.234 0.495 0.493 7（24.14）9（31.03）13（44.83）38.76±0.61 5（17.24）15（51.72）83.01±10.89 4.02±0.63 111.92±14.39 31.25±3.47 61.31±9.54 278.57±26.09 198.49±20.15 132.68±13.03 3.25±0.46 34.01±4.05 36.13±4.16 18.17±2.61 5.12±0.81 12.08±2.19 7.23±1.15 43.14±6.03 23（31.08）27（36.49）24（32.43）38.59±0.58 3（4.05）22（29.73）91.27±12.55 2.78±0.41 108.37±13.91 32.84±4.02 64.48±10.13 297.95±32.54 206.56±31.41 136.17±12.59 3.43±0.51 32.32±4.13 34.49±3.82 17.12±2.48 4.58±0.69 11.25±2.02 6.08±1.04 33.27±5.18 1.319 5.058 4.379 3.113 11.763 1.154 1.873 1.451 2.864 1.282 1.253 1.654 1.878 1.911 1.904 3.399 1.832 4.898 8.298 0.345 0.190 0.025 0.036 0.002 0.000 0.251 0.064 0.150 0.005 0.203 0.213 0.101 0.063 0.059 0.060 0.001 0.070 0.000 0.000 0.557 14（48.28）15（51.72）31（41.89）43（58.11）

2.3 影響PICU 重癥肺炎患兒預后的logistic 多因素分析以PICU 重癥肺炎患兒預后為因變量（預后良好=0，預后不良=1），合并休克占比、伴并發(fā)癥占比、PELOD-2 評分、機械通氣時間、PI3K mRNA 相對表達量、MMP-9 水平、PCIS 評分、氧合指數(shù)為自變量（賦值為原始數(shù)值），進行l(wèi)ogistic 回歸分析（引入水準為0.05，排除水準0.10），多因素分析結(jié)果顯示：合并休克（OR=4.104，95%CI：1.689～9.974）、PELOD-2 評分（OR=4.764，95%CI：1.960～11.577）、PCIS 評分（OR=5.068，95%CI：2.085～12.318）、PI3K（OR=3.924，95%CI：1.614～9.536）、MMP-9（OR=3.873，95%CI：1.594～9.412）是影響PICU 重癥肺炎患兒預后的因素（P< 0.05）。見表2。

表2 影響PICU 重癥肺炎患兒預后的多因素分析Tab.2 Analysis of multiple factors affecting prognosis of PICU children with severe pneumonia

2.4 肺泡灌洗液中PI3K、MMP?9表達水平與患兒PELOD?2 評分、PCIS 評分的相關(guān)性分析Pearson相關(guān)性分析顯示：PICU 重癥肺炎患兒肺泡灌洗液中PI3K、MMP-9 表達水平與患兒PCIS 評分均呈負相關(guān)（r=-0.598，P=0.000；r=-0.537，P=0.000），肺泡灌洗液中PI3K、MMP-9 表達水平與患兒PELOD-2 評分均呈正相關(guān)（r=0.546，P=0.000；r=0.571，P=0.000）。

2.5 肺泡灌洗液中PI3K、MMP?9 預測PICU 重癥肺炎患兒預后的價值ROC 曲線結(jié)果顯示，PI3K、MMP-9及二者聯(lián)合預測PICU 重癥肺炎患兒預后的靈敏度分別為75.86%（95%CI：56.08%～88.98%）、72.41%（95%CI：52.51%～86.55%）、82.76%（95%CI：63.51%～93.47%），特異度分別為75.68%（95%CI：64.07%～84.58%）、79.73%（95%CI：68.47%～87.85%）、89.19%（95%CI：79.28%～94.88%），AUC 分別為0.762（95%CI：0.666～0.859）、0.767（95%CI：0.670～0.873）、0.909（95%CI：0.848～0.971）。見表3與圖1。

圖1 肺泡灌洗液中PI3K、MMP9 預測PICU 重癥肺炎患兒預后的ROC 曲線Fig.1 ROC curve of PI3K and MMP9 in alveolar lavage fluid to predict prognosis of PICU children with severe pneumonia

表3 PI3K、MMP-9 預測PICU 重癥肺炎患兒預后的價值分析Tab.3 Value analysis of PI3K and MMP-9 in predicting prognosis of PICU children with severe pneumonia

3 討論

PICU 重癥肺炎若不及時治療可誘發(fā)多臟器功能衰竭，增大預后不良風險［12-14］。纖維支氣管鏡下敏感抗生素肺泡灌洗可清除炎性分泌物，阻止致病菌毒素吸收，改善肺炎患兒肺部氣道功能［15-16］。但臨床工作中發(fā)現(xiàn)PICU 重癥肺炎患兒預后仍不甚理想，影像學檢查是評估PICU 重癥肺炎患兒病情的常用手段之一，但具有一定滯后性，此外患兒病情進展迅速，易錯過最佳治療時機［17］。臨床迫切需求更多安全、高效、客觀的生化標志物輔助早期預測、指導PICU 重癥肺炎患兒的治療。本研究從PICU 重癥肺炎患兒肺泡灌洗液中收集炎性反應相關(guān)的客觀因子PI3K、MMP-9，分析并驗證其與患兒預后的關(guān)系，以便為肺炎患兒的防治提供參考。

本研究logistic 多因素回歸分析結(jié)果提示并印證PICU 重癥肺炎患兒肺泡灌洗液中PI3K、MMP-9表達與其預后關(guān)系密切。Pearson 相關(guān)性分析顯提示PICU 重癥肺炎患兒肺泡灌洗液中PI3K、MMP-9表達與其病情有關(guān)。肺部炎癥的特征是肺部炎性細胞消耗增加和促炎介質(zhì)分泌，導致肺泡間隙蛋白質(zhì)滲漏，肺順應性降低和肺功能損害。PICU 重癥肺炎患兒因肺部感染多伴有自噬反應，可誘導、加劇肺部炎性反應，PI3K 信號通路參與調(diào)節(jié)氣道中性粒細胞募集和支氣管上皮功能改變，PICU 重癥肺炎患兒可能通過激活PI3K/蛋白激酶B 信號通路來抑制支氣管上皮細胞自噬，進而抑制肺部感染，有助于臨床控制病情，獲取良好預后。PU等［18］研究指出，降低PI3K 表達在小兒肺炎中的泛素化，可抑制活性氧誘導的線粒體損傷及炎性反應。王艷瓊等［19］研究指出，抑制PI3K/蛋白激酶B信號/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路可促進人肺泡上皮細胞自噬，激活PI3K/蛋白激酶B 信號/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路可抑制人肺泡上皮細胞自噬，進而緩解肺炎鏈球菌導致的人肺泡上皮細胞損傷。

正常情況下肺組織中僅表達少量MMP-9，但在致病菌刺激下，支氣管上皮肺泡細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞等肺實質(zhì)細胞均可產(chǎn)生MMP-9，MMP-9 可降解肺泡壁內(nèi)幾乎所有的膠原纖維、彈性纖維、蛋白聚糖等細胞外基質(zhì)成分，增加肺泡毛細血管通透性，改變形態(tài)，增加微血管通透性，促進肺部炎性反應。此外MMP-9 可誘導中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞等炎性細胞向PICU 重癥肺炎患兒肺部炎癥病灶聚集，同時也可增強炎性細胞的殺傷能力，誘導炎性細胞過量釋放炎癥蛋白及介質(zhì)，參與、促進炎癥反應，誘導器官損傷及炎癥擴散，可造成全身炎癥反應綜合征，并出現(xiàn)炎癥級聯(lián)反應，嚴重影響PICU 重癥肺炎患兒病情及預后［20］。病理研究［8］指出，MMP-9 表達水平與顯微鏡下局部肺部炎癥和肺泡破壞的程度呈正相關(guān)。潘小翠等［21］研究指出，支氣管肺炎患兒血清MMP-9 表達水平與炎癥反應、肺功能關(guān)系密切。吳琳琳等［22］研究顯示支氣管肺泡灌洗液中MMP-9 表達升高會加重氣道炎癥程度。ROC 曲線結(jié)果顯示，PI3K 聯(lián)合MMP-9 預測PICU 重癥肺炎患兒預后的靈敏度、特異度、AUC 最高，說明PICU 重癥肺炎患兒肺泡灌洗液中PI3K、MMP-9 聯(lián)合預測患兒預后效能良好。

綜上所述，纖維支氣管鏡肺泡灌洗液中PI3K、MMP-9 表達與PICU 重癥肺炎患兒預后有關(guān)，二者聯(lián)合預測患兒預后效能良好，將其作為預測PICU重癥肺炎患兒預后的敏感指標具有一定臨床價值。但是影響PICU 重癥肺炎患兒病情、預后的因素較多，且本研究樣本量有限，在預測患兒預后時不可避免出現(xiàn)偏差，后期仍需針對不足進一步佐證本研究結(jié)論。