芪蛭通脈顆粒對(duì)冠心病模型大鼠MMP-9/TIMP-1影響的研究*

佟晴晴 趙 淳 李 易 葉 勇 柳 堯 宋欠紅△

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650021）

芪蛭通脈顆粒是第三、四、五、六批全國名老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承工作指導(dǎo)老師趙淳教授的經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)優(yōu)化劑型而成。本研究團(tuán)隊(duì)對(duì)芪蛭通脈顆粒進(jìn)行的前期研究結(jié)果顯示：氣虛血瘀證之冠心病患者應(yīng)用芪蛭通脈顆粒后可以明顯減輕氣短、胸悶、胸痛等癥狀，并有明確的調(diào)節(jié)血脂作用［1-2］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)芪蛭通脈顆粒能通過調(diào)控前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（PCSK9）/低密度脂蛋白受體（LDLR）及血管細(xì)胞間黏附分子1（VCAM-1）/細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）信號(hào)通路降低大鼠血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TAG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，提高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平，具有調(diào)節(jié)血脂的作用。該方還可以調(diào)控TLR4/NF-κB 信號(hào)通路，抑制動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠冠狀動(dòng)脈炎癥反應(yīng)［3］?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）的平衡是反映動(dòng)脈粥樣硬化穩(wěn)定性的重要指標(biāo)［4］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察芪蛭通脈顆粒對(duì)冠心病模型大鼠血清及心肌組織MMP-9、TIMP-1 表達(dá)水平的影響，分析血清、心肌組織中MMP-9、TIMP-1 含量及相關(guān)性，探討該方治療冠心病的機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只Wistar雄性健康大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量200～250 g，購于昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滇）2018-0003。大鼠合格證號(hào)：430067000017126。對(duì)大鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物 自擬方芪蛭通脈顆粒由黃芪20 g，燈盞細(xì)辛15 g，紅曲6 g，三七6 g，水蛭粉3 g組成，以上均為配方顆粒（四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：2008029）。對(duì)照藥物血塞通滴丸（昆藥集團(tuán)藥業(yè)有限公司，5 mg/粒，批號(hào)：2001820）。垂體后葉素注射液（上海禾豐制藥股份有限公司，6 U/mL，批號(hào)：2002014）。注射用異戊巴比妥鈉（上海上藥新亞藥業(yè)有限公司，0.25 g/10 mL，批號(hào)：20201006）。

1.3 試劑與儀器 MMP-9、TIMP-1 ELISA 試劑盒（上海藍(lán)基生物科技有限公司，批號(hào)：20200714、20200710）、電子分析天平產(chǎn)自德國sartorius 公司（CX-BA 型）。酶標(biāo)儀型號(hào)：DENLEY DRAGON Wellscan MK 3，Thermo公司；高通量組織研磨器：上海豫明YM-80LD。PT、APTT、TT、FIB 檢測(cè)試劑盒（上海太陽生物科技有限公司.批號(hào)：B202012023、B202011011、B202012021、B202012013）。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、血清尿素氮（BUN）、血清肌酐（Cr）檢測(cè)試劑盒（上海藍(lán)基生物科技有限公司，批號(hào)：20201014、20200910、20201010）。

1.4 造模與分組 60 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，空白組、模型組、血塞通滴丸組以及芪蛭通脈低、中、高劑量組，每組10 只。在潘繼興制作冠心病模型大鼠的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，建立冠心病動(dòng)物模型［5］。除空白組之外的其余各組均給予高脂飼料喂養(yǎng)。具體配方為：膽固醇3%，豬油15%，膽酸鈉1%，丙硫氧嘧啶1%，基礎(chǔ)飼料80%。連續(xù)喂養(yǎng)8 周，按5 mL/kg 液體量每日灌胃2 次，空白組給予等量純凈水灌胃。從第8 周第4 日開始，除空白組之外的其余組給予垂體后葉素（每次3 U/kg，每日1 次）腹腔注射，連續(xù)給藥3 d；空白組繼續(xù)予以等量純凈水灌胃。在給藥第3日，于注射藥物后30 min 內(nèi)對(duì)大鼠進(jìn)行心電圖檢測(cè)，若大鼠心電圖存在QRS 波群的終點(diǎn)與ST 段交接處的J 點(diǎn)位移，且位移＞0.1 mV，則表明大鼠存在心肌缺血，以及心電圖ST 段抬高大于0.1 mV，并且心律不齊，則表明造模成功［6］。

1.5 干預(yù)方法 于第9周開始給藥，共干預(yù)治療28 d。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與健康人用藥量的換算方法：給藥劑量（g/kg）=給出的人的劑量（g/kg）×70 kg×系數(shù)（0.018）×（1/0.2）。除空白組和模型組予等量純凈水灌胃外，芪蛭通脈低、中、高劑量組分別予以相應(yīng)劑量芪蛭通脈水溶液給藥，血塞通滴丸組給予血塞通滴丸水溶液灌胃。

1.6 取材 藥物干預(yù)4 周后進(jìn)行檢測(cè)，將大鼠按體質(zhì)量予以1%異戊巴比妥鈉40 mg/kg 劑量腹腔注射麻醉大鼠，固定大鼠，使大鼠呈仰臥位，對(duì)大鼠皮膚進(jìn)行消毒，暴露大鼠腹主動(dòng)脈，采血5 mL，于室溫2 500 r/min離心20 min，取上清液即血清分裝于1.5 mL 的ependor管中，放入-20 ℃冰箱保存，切開大鼠胸部皮膚、胸大肌、肋骨、取出心臟，每個(gè)心臟取左心室室壁3×3 mm心肌2塊，放入-80 ℃冰箱保存待檢。

1.7 血清及心肌組織相關(guān)指標(biāo) 凝血四項(xiàng)檢測(cè)［活化部分凝血酶時(shí)間（APTT）、凝血酶原時(shí)間（PT）、凝血酶時(shí)間（TT）、纖維蛋白酶（FIB）］：按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)血清ALT、BUN、Cr水平。剪取左心室心肌組織3×3 mm，研磨后用酸鹽緩沖液制成心肌組織勻漿液，離心后取上清液，ELISA法檢測(cè)心肌組織MMP-9、TIMP-1［7-8］。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，運(yùn)用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清MMP-9、TIMP-1 水平的比較 見表1（模型組大鼠死亡2 只，芪蛭通脈中劑量組大鼠死亡1 只）。與空白組比較，模型組、血塞通滴丸組、芪蛭通脈低、中劑量組大鼠血清MMP-9 水平升高（P＜0.05）；芪蛭通脈中、高劑量組、血塞通滴丸組與模型組比較MMP-9 水平降低（P＜0.05）。與空白組比較，模型組大鼠血清TIMP-1 水平降低（P＜0.05）；芪蛭通脈中、高劑量組大鼠血清TIMP-1 水平升高（P＜0.05）。芪蛭通脈中、高劑量組與模型組比較，TIMP-1 水平升高（P＜0.05）；芪蛭通脈中、高劑量組與血塞通滴丸組比較TIMP-1水平升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清中MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平比較（ng/mL，±s）

表1 各組大鼠血清中MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平比較（ng/mL，±s）

注：與空白組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。下同。

TIMP-1 22.69±2.35 13.41±3.05*17.61±3.39 18.58±3.32 29.52±4.12*△△28.93±3.55*△△組 別空白組模型組血塞通滴丸組芪蛭通脈低劑量組芪蛭通脈中劑量組芪蛭通脈高劑量組n 10 8 10 10 9 10 MMP-9 26.60±2.95 48.53±7.22**41.89±5.16**△42.24±6.31**36.91±4.17*△32.79±3.92△△

2.2 各組大鼠心肌組織MMP-9、TIMP-1水平比較 見表2。芪蛭通脈中、高劑量組，血塞通滴丸組與模型組比較，MMP-9 水平均降低（P＜0.05）。與空白組比較，模型組、芪蛭通脈低劑量組大鼠心肌組織TIMP-1水平降低（P＜0.05）；芪蛭通脈中劑量組與空白組比較TIMP-1 水平升高（P＜0.05）。芪蛭通脈中、高劑量組與模型組比較TIMP-1水平顯著升高（P＜0.01）。

表2 各組大鼠心肌組織MMP-9、TIMP-1水平比較（ng/mL，±s）

表2 各組大鼠心肌組織MMP-9、TIMP-1水平比較（ng/mL，±s）

組 別空白組模型組血塞通滴丸組芪蛭通脈低劑量組芪蛭通脈中劑量組芪蛭通脈高劑量組n 10 8 10 10 9 10 MMP-9 3.58±0.57 20.31±3.12**17.66±3.21**16.33±3.54**7.20±2.06**△9.54±2.24**△TIMP-1 2.42±0.35 1.02±0.24*1.63±0.32 1.54±0.55*3.69±0.61*△△2.78±0.84△△

2.3 各組大鼠凝血功能指標(biāo)比較 見表3。各組間凝血功能檢測(cè)未見明顯差異（均P＞0.05）。

表3 各組凝血功能指標(biāo)比較（±s）

表3 各組凝血功能指標(biāo)比較（±s）

組 別空白組模型組血塞通滴丸組芪蛭通脈低劑量組芪蛭通脈中劑量組芪蛭通脈高劑量組n 10 8 10 10 9 10 APTT（s）23.74±5.56 25.31±6.43 28.62±5.24 30.52±6.28 29.87±6.77 26.32±5.01 PT（s）10.70±1.02 9.11±1.23 11.02±2.24 10.25±2.09 11.54±2.74 9.18±2.55 TT（s）11.70±1.19 10.85±1.02 12.03±1.56 10.93±0.99 12.15±1.45 11.40±1.32 FIB（g/L）2.64±0.32 3.31±0.76 3.25±0.47 4.83±0.61 4.50±0.99 3.69±0.25

2.4 各組大鼠ALT、BUN、Cr水平比較 見表4。與空白組比較，模型組ALT 水平升高（P＜0.05），各組間BUN 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其他所有組Cr水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，血塞通滴丸組ALT水平降低，芪蛭通脈高劑量組Cr水平下降（均P＜0.05）。

表4 各組大鼠ALT、BUN、Cr水平比較（±s）

表4 各組大鼠ALT、BUN、Cr水平比較（±s）

組 別空白組模型組血塞通滴丸組芪蛭通脈低劑量組芪蛭通脈中劑量組芪蛭通脈高劑量組n 10 8 10 10 9 10 ALT（U/L）43.74±5.56 65.31±7.43*43.62±5.24△55.52±6.28 49.87±6.77 56.32±8.01 BUN（mmol/L）7.70±1.02 10.11±1.23 11.02±2.24 10.25±2.09 11.54±2.74 9.18±2.55 Cr（μmol/L）53.64±6.32 101.31±13.76*88.25±13.47*93.83±10.61*114.50±11.99*78.69±10.25*△

3 討 論

冠心病屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”“心痛”范疇，多表現(xiàn)為胸部有短暫的壓榨性疼痛或有憋悶感，其基本病機(jī)為心脈痹阻，為本虛標(biāo)實(shí)之證［9］。絡(luò)病理論對(duì)胸痹心痛治療具有重要指導(dǎo)意義，其最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》。由吳以嶺教授推動(dòng)“絡(luò)病證治”進(jìn)入到“脈絡(luò)學(xué)說”新階段，創(chuàng)立“三維立體網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)”成為現(xiàn)代絡(luò)病學(xué)理論基礎(chǔ)［10］。經(jīng)是經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)的主體，而絡(luò)是由經(jīng)分出的行于淺表的支脈，經(jīng)絡(luò)共同構(gòu)成了人體氣血運(yùn)行的通道。血管及毛細(xì)血管、微血管等在解剖形態(tài)和功能上與中醫(yī)學(xué)中“經(jīng)絡(luò)”聯(lián)系密切，人體運(yùn)行血液的循環(huán)及微循環(huán)系統(tǒng)與運(yùn)行氣血的脈絡(luò)共同形成了“脈絡(luò)-血管系統(tǒng)病”“孫絡(luò)-微血管病”等新概念［11］。許多具有心絞痛癥狀，且心電圖多數(shù)導(dǎo)聯(lián)呈ST 段壓低提示有心肌缺血或心肌標(biāo)志物異常反映心肌壞死，而冠狀動(dòng)脈造影未見異常的患者大多與冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙有關(guān)［12］。2013 年歐洲心臟病學(xué)會(huì)在冠心病原本定義的基礎(chǔ)上加入了冠脈微血管功能障礙導(dǎo)致的胸部癥狀［13］，主要依靠功能評(píng)估來判斷冠脈微循環(huán)功能狀態(tài)。

冠脈微循環(huán)具有調(diào)節(jié)心臟血流分布，滿足心肌代謝需要以及調(diào)節(jié)外周血管阻力的功能［14］。冠狀動(dòng)脈微循環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能改變使冠狀動(dòng)脈血流儲(chǔ)備受損，引起心肌缺血，血管痙攣、內(nèi)皮功能障礙、血管重構(gòu)、毛細(xì)血管密度降低、血管周圍纖維化、再灌注損傷等原因?qū)е鹿诿}微循環(huán)障礙［15］。冠脈微循環(huán)在生理結(jié)構(gòu)及功能上相當(dāng)于心臟的孫絡(luò)，冠脈微循環(huán)功能障礙屬于絡(luò)病理論中的“孫絡(luò)-微血管病”。血脂異常會(huì)損傷血管內(nèi)皮，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損后，血管內(nèi)壁中脂質(zhì)遷移沉積，形成斑塊并不斷加重，同時(shí)血液黏度增加，促使血小板黏附、聚集，誘導(dǎo)血栓形成，使外周微循環(huán)受損［16］；動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定程度和纖維帽的薄厚密切相關(guān)［17］，而纖維帽的主要成分是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）能夠降解ECM，使纖維帽變薄，斑塊更易破裂。MMP-9 是其家族中重要一員，大量存在于易損斑塊中。TIMP-1 是MMP-9 的特異性抑制劑，可反映抑制膠原降解的程度。兩者的動(dòng)態(tài)平衡是維持動(dòng)脈硬化斑塊穩(wěn)定的關(guān)鍵因素［18］。

對(duì)基于絡(luò)病理論指導(dǎo)下所組方藥的相關(guān)研究表明，通絡(luò)的方藥可保護(hù)微血管內(nèi)皮細(xì)胞，改善內(nèi)皮舒縮功能［19］。治療冠心病宜采用活血通絡(luò)之法，改善血液循環(huán)，使血運(yùn)通暢，通則不痛，緩解胸痛癥狀。芪蛭通脈由炙黃芪、燈盞細(xì)辛、三七、紅曲、水蛭粉等組成，具有益氣活血化瘀、通絡(luò)止痛之效。根據(jù)藥理研究，本方藥物具有抗凝血、改善血液循環(huán)、保護(hù)微血管內(nèi)皮細(xì)胞，加速膽固醇代謝等作用［20］。

本研究表明，模型組大鼠血清及心肌組織中MMP-9均升高，TIMP-1水平均降低，芪蛭通脈中、高劑量組能明顯降低血清及心肌組織MMP-9 水平，并提高血清及心肌組織TIMP-1水平，MMP-9/TIMP-1比值有良好的相關(guān)性，其相關(guān)性在血清中表達(dá)更為明顯，這表明血清中MMP-9、TIMP-1 含量對(duì)檢測(cè)患者斑塊穩(wěn)定程度具有重要意義；與此同時(shí)，芪蛭通脈中、高劑量組對(duì)MMP-9/TIMP-1 的調(diào)控作用明顯，其可能作用機(jī)制是抑制MMP-9 的釋放的同時(shí)促進(jìn)TIMP-1 生成，促進(jìn)生成MMP-9/TIMP-1 復(fù)合物，抑制ECM 降解。根據(jù)APTT、PT、TT、FIB 檢測(cè)結(jié)果，芪蛭通脈低、中、高劑量組未導(dǎo)致凝血功能異常。此外，模型組大鼠ALT、Cr升高，肝、腎功能有一定損傷，用血塞通滴丸干預(yù)后，肝、腎功能有一定程度的恢復(fù)，而芪蛭通脈低、中、高劑量組與血塞通滴丸組相比較沒有明顯肝腎損害，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

芪蛭通脈可以抑制MMP-9 釋放以及促進(jìn)TIMP-1生成，抑制ECM 降解，穩(wěn)定斑塊，防止斑塊破損，減少血栓形成，維持心臟血液循環(huán)，使冠脈循環(huán)障礙得到有效緩解；而芪蛭通脈對(duì)冠脈微循環(huán)障礙的改善程度有待進(jìn)一步研究。