哮喘患兒血清CircZNF652的表達(dá)水平及其臨床意義▲

榮會(huì)蓉 周金成 夏 思 楊 凡

(1 長(zhǎng)江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)院兒科,湖北省仙桃市 433000;2 湖北省仙桃市仙桃職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)院,湖北省仙桃市 433000;3 長(zhǎng)江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)院內(nèi)科,湖北省仙桃市 433000)

哮喘是一種臨床上常見的慢性呼吸道疾病,兒童的肺功能發(fā)育尚未成熟,免疫功能尚不健全,因此哮喘在兒童中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較高[1]。近年來,兒童哮喘的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[2-3]。哮喘患兒主要癥狀為咳嗽、胸悶等,同時(shí)伴隨喘息反復(fù)發(fā)作,長(zhǎng)期反復(fù)的炎癥刺激還可能會(huì)引起氣道重塑及氣道狹窄,嚴(yán)重影響患兒日常生活及健康[4-6]。哮喘的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確,目前認(rèn)為與遺傳因素、環(huán)境因素、免疫功能等有關(guān)[7]。因此,積極探索兒童哮喘的發(fā)病機(jī)制,尋找相關(guān)治療靶點(diǎn)對(duì)于改善哮喘患兒預(yù)后具有重要意義。環(huán)狀RNA(circular RNA,CircRNA)是環(huán)狀共價(jià)閉合環(huán)狀非編碼RNA,2013年Hansen等發(fā)現(xiàn)CircRNA可以通過靶向調(diào)控miRNA參與各種生理過程的調(diào)控[8],此后,CircRNA逐漸受到人們的重視。Circ鋅指蛋白652(zinc finger protein 652,ZNF652)是CircRNA家族成員之一,其在炎癥相關(guān)疾病中表達(dá)異常[9],推測(cè)其可能參與炎癥反應(yīng)過程。哮喘本質(zhì)上是一種氣道炎癥反應(yīng),目前CircZNF652與哮喘的相關(guān)研究鮮有報(bào)告。因此,本研究探討哮喘患兒血清CircZNF652表達(dá)水平及其臨床意義,旨在為兒童哮喘的診斷及靶向治療提供新方向。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年5月至2021年3月長(zhǎng)江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)院收治的105例哮喘患兒作為觀察組,年齡5～12(7.90±2.25)歲,男童57例、女童48例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[10]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)患兒配合度較好,患兒家屬同意本研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并先天性心肺功能不全者;(2)合并肝、腎功能不全者;(3)合并其他過敏性疾病及免疫系統(tǒng)疾病者;(4)一個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)過呼吸道感染者。另選取同期在長(zhǎng)江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)兒童保健科體檢的80例健康兒童作為對(duì)照組,年齡6～12(8.24±2.37)歲,男童43例、女童37例。觀察組與對(duì)照組兒童性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),具有可比性。本研究所有實(shí)驗(yàn)過程均符合《赫爾辛基宣言》相關(guān)要求,并經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 分組 根據(jù)觀察組患兒的臨床表現(xiàn),依照《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[10]相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)將觀察組的105例哮喘患兒分為急性發(fā)作期組57例和慢性緩解期組48例,其中急性發(fā)作期組男童32例、女童25例,年齡5～11(7.85±2.22)歲;慢性緩解期組男童30例、女童18例,年齡5～12(7.96±2.29)歲。急性發(fā)作期組與慢性緩解期組的性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),具有可比性。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集:采集觀察組入院第1天、對(duì)照組體檢時(shí)晨起空腹的外周靜脈血4 mL,3 000 r/min離心15 min,留取上清液,于-80 ℃條件下保存待檢。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)血清CircZNF652的表達(dá)水平:取上清液,按照TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific,批號(hào):10296010CN)的操作步驟分離、提取上清液中的總RNA,并檢測(cè)其純度和濃度,嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):RP1105)的操作步驟合成cDNA。采用Bio-Rad T100型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)檢測(cè)各組樣品,以GAPDH做內(nèi)參,反應(yīng)條件為95 ℃ 預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s、60 ℃退火20 s、68℃延伸15 s 35個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算CircZNF652的相對(duì)表達(dá)量。CircZNF652上游引物:5′-GGGCACAAACAGTTCATGTG-3′,下游引物:5′-TGCGTTTGAATGATTTTCCA-3′,引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.3 血清炎癥因子水平檢測(cè):采用ELISA檢測(cè)血清腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6表達(dá)水平(試劑盒均購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,批號(hào):E-EL-H0109c、E-EL-H6156),嚴(yán)格按照說明書方法進(jìn)行操作。

1.3.4 肺功能指標(biāo)檢測(cè):由同一位醫(yī)生操作,指導(dǎo)研究對(duì)象按照正確的步驟進(jìn)行檢測(cè),記錄觀察組入院第1天、對(duì)照組體檢時(shí)1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second,FEV1)、呼氣峰值流速(peak expiratory flow,PEF)、用力肺活量(forced vital capacity,FVC),計(jì)算FEV1/FVC值。肺功能指標(biāo)檢測(cè)重復(fù)3次,取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(%)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);采用Pearson檢驗(yàn)分析觀察組血清CircZNF652表達(dá)水平與肺功能指標(biāo)及血清TNF-α、IL-6表達(dá)水平的相關(guān)性;采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析血清CircZNF652表達(dá)水平對(duì)兒童哮喘的診斷價(jià)值,并計(jì)算ROC曲線下面積(area under the curve,AUC);采用多因素Logistic回歸模型分析兒童哮喘急性發(fā)作的影響因素。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 觀察組與對(duì)照組血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表達(dá)水平與肺功能指標(biāo)的比較 觀察組FEV1、PEF、FEV1/FVC值均低于對(duì)照組,而血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表達(dá)水平均高于對(duì)照組(均P<0.05)。見表1。

表1 觀察組與對(duì)照組血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表達(dá)水平及肺功能指標(biāo)的比較(x±s)

2.2 急性發(fā)作期組與慢性緩解期組血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表達(dá)水平及肺功能指標(biāo)的比較 急性發(fā)作期組的FEV1、PEF、FEV1/FVC值均低于慢性緩解期組,而血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表達(dá)水平均高于慢性緩解期組(均P<0.05)。見表2。

表2 急性發(fā)作期組與慢性緩解期組血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表達(dá)水平及肺功能指標(biāo)的比較(x±s)

2.3 觀察組血清CircZNF652表達(dá)水平與肺功能指標(biāo)及血清TNF-α、IL-6表達(dá)水平的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,觀察組血清CircZNF652表達(dá)水平與FEV1、PEF、FEV1/FVC值均呈負(fù)相關(guān),與血清TNF-α、IL-6表達(dá)水平均呈正相關(guān)(均P<0.05)。見表3。

表3 血清CircZNF652表達(dá)水平與肺功能指標(biāo)及血清TNF-α、IL-6表達(dá)水平的相關(guān)性

2.4 血清CircZNF652表達(dá)水平對(duì)兒童哮喘的診斷價(jià)值 以是否哮喘作為狀態(tài)變量(無哮喘=0,哮喘=1),以血清CircZNF652表達(dá)水平作為檢驗(yàn)變量繪制ROC曲線。結(jié)果顯示,血清CircZNF652表達(dá)水平診斷兒童哮喘的AUC為0.741(95%CI:0.671,0.802),靈敏度和特異度分別為75.24%、67.50%,最佳截?cái)嘀禐?.12。見圖1。

圖1 血清CircZNF652水平對(duì)兒童哮喘診斷價(jià)值的ROC曲線圖

2.5 哮喘患兒急性發(fā)作的影響因素分析 以哮喘患兒哮喘發(fā)展期作為因變量(0=急性發(fā)作期,1=慢性緩解期),以FEV1、PEF、FEV1/FVC值及血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表達(dá)水平作為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,FEV1、PEF、FEV1/FVC值,以及血清TNF-α、IL-6、CircZNF652表達(dá)水平均是哮喘患兒急性發(fā)作的影響因素(均P<0.05)。見表4。

表4 多因素Logistic回歸分析兒童哮喘急性發(fā)作的影響因素

3 討 論

哮喘是兒童常見的一種慢性呼吸道疾病之一,是由多種炎癥因子共同參與導(dǎo)致的變態(tài)反應(yīng)性疾病[11-12],以持續(xù)性氣道炎癥、氣道高反應(yīng)為主要特征[13],患兒會(huì)出現(xiàn)反復(fù)咳嗽、呼吸困難等臨床表現(xiàn),嚴(yán)重影響患兒的生活質(zhì)量。由于呼吸系統(tǒng)處于高敏狀態(tài),哮喘患兒氣道極易受到外界因素的影響[14],誘發(fā)哮喘急性發(fā)作,嚴(yán)重時(shí)可危及生命。哮喘的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,受多種因素的影響,若能盡早評(píng)估哮喘發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn),及時(shí)采取早期預(yù)防手段,將極大地降低高風(fēng)險(xiǎn)兒童哮喘的發(fā)病率,具有重要的臨床意義。

血清生物學(xué)分子標(biāo)志物是近年來疾病研究的熱點(diǎn),其能夠客觀快速地反映疾病進(jìn)程,這為哮喘的早期診斷及靶向治療提供了新的研究方向。目前仍無特異性較強(qiáng)的血清生物學(xué)分子標(biāo)志物用于診斷早期哮喘的發(fā)生,因此尋找與哮喘相關(guān)的血清生物學(xué)分子標(biāo)志物具有重要的臨床意義。CircRNA是近年來新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA,許多研究已經(jīng)報(bào)告了CircRNA作為血清生物學(xué)分子標(biāo)志物用于診斷疾病具有巨大的潛力,但目前相關(guān)研究多集中在腫瘤領(lǐng)域[15-16]。例如,CircRNA-100367被發(fā)現(xiàn)能夠增強(qiáng)抗輻射的食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞(KYSE-150R)的抗放射性,促進(jìn)KYSE-150R細(xì)胞的生長(zhǎng),促進(jìn)食管癌進(jìn)展[17];CircWHSC1在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)上調(diào),能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和侵襲[18]。研究表明,CircRNA與支氣管哮喘具有密切的關(guān)系,CircRNA可以通過參與先天免疫應(yīng)答過程和調(diào)控支氣管上皮的炎癥反應(yīng)過程來調(diào)節(jié)支氣管哮喘的發(fā)病過程,CircRNA為哮喘的早期診斷提供了新的研究思路[19],但不同的刺激源、不同的CircRNA會(huì)對(duì)支氣管上皮炎癥反應(yīng)發(fā)揮不同的作用,具體的作用機(jī)制還需更深入的研究。

CircZNF652是最新發(fā)現(xiàn)的一類CircRNA分子,Liu等[20]發(fā)現(xiàn)下調(diào)CircZNF652的表達(dá)可以緩解脂多糖誘導(dǎo)的炎癥損傷,提示CircZNF652可能參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控過程。本研究結(jié)果顯示,觀察組血清CircZNF652表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05),與Wang等[21]的研究結(jié)果一致,提示CircZNF652可能參與兒童哮喘的發(fā)病過程。本研究結(jié)果顯示,急性發(fā)作期組患兒的血清CircZNF652表達(dá)水平高于慢性緩解期組(P<0.05),提示血清CircZNF652表達(dá)水平與兒童哮喘的疾病發(fā)展期具有一定的相關(guān)性。本研究Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,哮喘患兒血清CircZNF652表達(dá)水平與FEV1、PEF、FEV1/FVC值均呈負(fù)相關(guān),與血清TNF-α、IL-6表達(dá)水平均呈正相關(guān),而FEV1、PEF、FEV1/FVC值及血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表達(dá)水平均是哮喘患兒急性發(fā)作的影響因素(均P<0.05),提示臨床監(jiān)測(cè)肺功能和血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表達(dá)水平對(duì)哮喘患兒病情判定、疾病發(fā)展具有重要意義。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示,血清CircZNF652表達(dá)水平診斷兒童哮喘的AUC為0.741,靈敏度和特異度分別為75.24%、67.50%,提示CircZNF652表達(dá)水平診斷的效能良好,當(dāng)血清CircZNF652表達(dá)水平>1.12時(shí),應(yīng)采取合理的防治措施,預(yù)防兒童出現(xiàn)哮喘癥狀。目前關(guān)于CircZNF652在哮喘發(fā)病過程中的作用機(jī)制尚不完全清楚,Wang等[21]認(rèn)為CircZNF652的作用機(jī)制可能是通過充當(dāng)miR-452-5p的海綿體并激活miR-452-5p/酪氨酸激酶2的信號(hào)通路及轉(zhuǎn)錄激活因子6信號(hào)通路促進(jìn)杯狀細(xì)胞化生,導(dǎo)致氣道阻塞,進(jìn)而誘發(fā)哮喘,但具體的作用機(jī)制還有待更深入的研究。

肺功能檢測(cè)對(duì)哮喘的診斷、鑒別、病情嚴(yán)重程度評(píng)估、治療效果判斷及預(yù)后起著重要作用,也是臨床診斷兒童哮喘的重要指標(biāo)。FEV1反映中央氣道的氣流流速,PEF反映大氣道流速,二者均能評(píng)估哮喘患者未來不良事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn);FEV1/FVC值是臨床醫(yī)生判斷哮喘嚴(yán)重程度的重要因素,有研究證實(shí)FEV1/FVC值每下降5%,受試者哮喘嚴(yán)重程度表型可能會(huì)增加2.36倍[22-24]。另外,炎癥因子表達(dá)水平升高也能增加氣道炎癥,容易出現(xiàn)氣道管壁增厚、管腔狹窄,增加氣道外周阻力,促進(jìn)哮喘的發(fā)展[25]。許惠娟等[26]發(fā)現(xiàn),急性發(fā)作期哮喘患者FEV1、PEF、FEV1/FVC值低于緩解期患者和健康受試者,且哮喘患者血清IL-33表達(dá)水平高于健康受試者。本研究結(jié)果顯示,觀察組FEV1、PEF、FEV1/FVC值均低于對(duì)照組(均P<0.05),而血清TNF-α、IL-6表達(dá)水平均高于對(duì)照組(均P<0.05);急性發(fā)作期組患兒的FEV1、PEF、FEV1/FVC值均低于慢性緩解期組(均P<0.05),而血清TNF-α、IL-6表達(dá)水平均高于慢性緩解期組(均P<0.05),這一研究結(jié)果與許惠娟等[26]研究結(jié)果相似。

綜上所述,哮喘患兒血清CircZNF652表達(dá)上調(diào),并與哮喘急性發(fā)作相關(guān),且血清CircZNF652表達(dá)水平與肺功能指標(biāo)呈負(fù)相關(guān),與血清TNF-α及IL-6表達(dá)水平呈正相關(guān),因此檢測(cè)血清CircZNF652表達(dá)水平有助于哮喘患兒的病情判定,但其具體作用機(jī)制尚不十分明確,今后還需增加樣本量、延長(zhǎng)觀察時(shí)間,并開展多中心的深入研究。