大動脈粥樣硬化型缺血性腦卒中患者外周血miR-29c和miR-370水平與頸動脈內(nèi)中膜厚度的相關(guān)性

劉坦,趙星鵬,劉輝

(鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院 a.檢驗科;b.超聲科 河南 洛陽 471009)

缺血性腦卒中是因缺血缺氧導(dǎo)致的腦組織病變壞死,進(jìn)而引起神經(jīng)功能缺損的一種疾病,其致死致殘率極高,預(yù)后不良[1-2]。根據(jù)TOAST分型,缺血性腦卒中可分為大動脈粥樣硬化型(large artery-atherosclerosis,LAA)、心源性栓塞型、小動脈閉塞型、其他原因型和原因不明型。其中,LAA型缺血性腦卒中較為常見,發(fā)病原因多為頸動脈粥樣硬化所致[2]。目前,LAA型缺血性腦卒中的診斷主要依靠超聲檢查、血管造影及磁共振血管成像,而檢測其發(fā)病及進(jìn)展的實驗室指標(biāo)相對缺乏。在腦卒中miRNA表達(dá)譜的研究中發(fā)現(xiàn),miRNA可能是診斷缺血性腦卒中的有效生物標(biāo)志物,并且,研究證明腦損傷后血漿中miRNA表達(dá)會有明顯變化,且在卒中進(jìn)展過程中miRNA表達(dá)也發(fā)生暫時性變化[3-7]。頸動脈內(nèi)中膜厚度(carotid intima-media thickness,IMT)是超聲檢查中最直觀檢測到的與動脈粥樣硬化性病變相關(guān)的指標(biāo),被認(rèn)為是早期動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)與腦卒中風(fēng)險的亞臨床標(biāo)志物[8-10]。有數(shù)據(jù)證明miR-29c可以介導(dǎo)動脈粥樣硬化氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)[11-14],miR-370通過靶向SIRT6、MPK1和調(diào)節(jié)Nrf2/ARE信號通路來加速腦缺血再灌注損傷的形成[15-16],但miR-29c及miR-370表達(dá)水平變化與LAA型缺血性腦卒中發(fā)生、進(jìn)展之間的關(guān)系尚缺乏有力的數(shù)據(jù)支撐,且三者之間是否存在相關(guān)性及相互作用進(jìn)而促進(jìn)了LAA型缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展仍有待進(jìn)一步闡明。

基于此,本研究選取69例LAA型缺血性腦卒中患者和54例健康對照者,分析兩組人群血漿miR-29c和miR-370表達(dá)水平的差異及與IMT值之間的相關(guān)性,同時結(jié)合已證實的與缺血性腦卒中密切相關(guān)的氧化應(yīng)激和炎癥指標(biāo),如缺血修飾白蛋白(ischemia modified albumin,IMA)、超敏C反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP),旨在探討將其作為LAA型缺血性腦卒中生物標(biāo)志物的應(yīng)用價值,以期對LAA型缺血性腦卒中進(jìn)行早期發(fā)現(xiàn)、干預(yù)和預(yù)防。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2020年10月至2022年3月在鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院進(jìn)行就診的經(jīng)頭顱CT或MRI診斷為LAA型缺血性腦卒中的69例患者作為觀察組,其中男40例,女29例;年齡34～86歲,平均(64.90±12.67)歲;并選取同期在醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的54名體檢者作為健康對照組,其中男27例,女27例,年齡41～72歲,平均(63.04±5.92)歲。兩組在年齡和性別上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。該研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。(1)納入標(biāo)準(zhǔn):①病史采集和體格檢查符合第4屆腦血管病學(xué)術(shù)會議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn),影像學(xué)檢查CT或MRI發(fā)現(xiàn)梗死灶,支持LAA型缺血性腦卒中的診斷;②入院24 h內(nèi)進(jìn)行完善的實驗室檢查、相關(guān)資料完整;③進(jìn)行頸部多普勒超聲檢查;④患者對本研究知情,簽署知情同意書。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①其他類型的缺血性腦卒中、出血性卒中、自身免疫性腦炎等腦血管疾病,其他原因?qū)е碌纳窠?jīng)功能缺損、腫瘤或診斷不明確者;②臨床資料、實驗室資料或頸部超聲資料不完整者。

1.2 樣本收集

觀察組和對照組均抽取空腹靜脈血2 mL(EDTA-K2抗凝),3 000 r·min-1離心10 min分離血漿,置-70 ℃冰箱待用(觀察組留取入院后治療前第1次血樣)。

1.3 方法與試劑

1.3.1miR-29c和miR-370表達(dá)水平檢測

取出-70 ℃血漿室溫復(fù)融后,使用血清/血漿miRNA提取分離試劑盒分離并提取外周血漿中的miRNA,按照miRcute增強(qiáng)型miRNAcDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,使用miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測,相關(guān)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行(所用試劑盒均來自天根生化科技有限公司)。選擇U6為內(nèi)參,正向引物為5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’,反向引物為5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’;miR-29c正向引物為5’-GTAGCACCATTTGAAATCAG-3’,反向引物為5’-TTGGCACTAGCACATT-3’;miR-370正向引物為5’-TAGCCTGCTGGGGTGGAA-3’,反向引物為5’-TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT-3’。參照試劑說明書、經(jīng)預(yù)實驗后,設(shè)定反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性15 min,94 ℃ 20 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 34 s共5個循環(huán)富集低豐度miRNA,94 ℃變性20 s、60 ℃退火延伸34 s,共40個循環(huán)。于61 ℃時采集熒光,用實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司生產(chǎn),型號stepone plus)檢測其表達(dá)量。通過2-△△ct方法計算miR-29c和miR-370的相對表達(dá)量(每個樣本測定2次,取平均值)。

1.3.2IMT檢查

采用飛利浦Q5彩色多普勒超聲檢查儀,探頭頻率4～12 MHz,由醫(yī)院資深超聲科醫(yī)生(副主任醫(yī)師及以上者)進(jìn)行檢查,嚴(yán)格按照中國血管超聲操作規(guī)范進(jìn)行,測量雙側(cè)頸總動脈IMT值,取平均值進(jìn)行分析(每側(cè)測量2次)。IMT≥1.0 mm定義為增厚[17]。

1.3.3IMA和hs-CRP檢測

所用儀器為日立7600-110全自動生化分析儀,分別采用白蛋白-鈷結(jié)合法和膠乳免疫比濁法,嚴(yán)格按照儀器及試劑說明進(jìn)行操作。檢測所用試劑均購自寧波瑞源生物科技有限公司(只對健康對照組進(jìn)行檢測,觀察組從病例中調(diào)取相應(yīng)結(jié)果)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-29c和miR-370相對表達(dá)量及IMT值

觀察組miR-29c的相對表達(dá)量低于健康對照組,miR-370的相對表達(dá)量高于健康對照組,IMT值高于健康對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組miR-29c、miR-370相對表達(dá)量和IMT值比較[M(P25,P75)]

2.2 miR-29c和miR-370相對表達(dá)量、氧化應(yīng)激和炎癥指標(biāo)與IMT值間的相關(guān)性分析

通過Pearson相關(guān)性分析得到,隨著頸總動脈IMT的增厚,外周血漿miR-29c相對表達(dá)量呈逐漸下降趨勢,miR-370相對表達(dá)量呈逐漸上升趨勢,miR-29c相對表達(dá)量與IMT呈低度負(fù)相關(guān)(r=-0.229,P<0.05),miR-370相對表達(dá)量與IMT呈中度正相關(guān)(r=0.492,P<0.05)。同時,IMT與IMA、IMT與hs-CRP及IMA與hs-CRP之間也存在正相關(guān)(r=0.459、0.260、0.322,P<0.05)。見表2。

表2 miR-29c和miR-370相對表達(dá)量、氧化應(yīng)激和炎癥指標(biāo)與IMT值間的相關(guān)性分析(r)

2.3 miR-29c、miR-370和IMT值對LAA型缺血性腦卒中的診斷效能

分別對miR-29c、miR-370和IMT值進(jìn)行ROC曲線分析得到:miR-29c、miR-370和IMT單獨預(yù)測LAA型缺血性腦卒中發(fā)生的AUC分別為0.722、0.978、0.903,其中miR-370的預(yù)測價值最優(yōu),將3個指標(biāo)聯(lián)合檢測分析,較其單獨預(yù)測的靈敏度及特異度均有所增加,AUC達(dá)到最大。見表3、圖1。

圖1 ROC曲線分析miR-29c、miR-370和IMT對LAA型缺血性腦卒中的診斷效能

表3 miR-29c、miR-370和IMT預(yù)測LAA型缺血性腦卒中的ROC曲線結(jié)果

3 討論

缺血性腦卒中作為全球重大公共衛(wèi)生問題,是導(dǎo)致人類死亡和殘疾的重要原因之一,對患者健康安全及生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[18],LAA型缺血性腦卒中為臨床急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke,AIS)最常見的類型,動脈粥樣硬化是其發(fā)生發(fā)展過程中的重要一環(huán)[19],而IMT增厚和頸動脈斑塊形成被認(rèn)為是早期AS的亞臨床標(biāo)志物,與缺血性腦卒中的發(fā)生密切相關(guān),并且可以預(yù)測AIS的發(fā)生[8-10]。及早診斷并進(jìn)行病情程度評估對于臨床治療及預(yù)后具有重要意義[20-21],目前主要通過影像學(xué)檢查對神經(jīng)功能缺損進(jìn)行有效評估,但對于短暫性腦缺血發(fā)作等也存在一定局限性,也尚未發(fā)現(xiàn)評估LAA型缺血性腦卒中的特異性血清生物標(biāo)志物[22]。

以往研究已證明miR-29c通過調(diào)節(jié)編碼細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(如A型膠原和3A型膠原)的miRNA靶點來調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化[23],也可以通過調(diào)節(jié)凝血因子纖維蛋白原等途徑影響動脈粥樣硬化斑塊的形成,是早期發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化的潛在生物標(biāo)志物[24]。也有研究報道,急性腦梗死患者腦脊液中miR-29c-3p表達(dá)異常下降[25];血清miR-33a、miR-29c、miR-126單項檢測診斷腦動脈粥樣硬化均具有較好的靈敏度和特異度[22]。這些都已證明miR-29c通過多種途徑參與了LAA型缺血性腦卒中的發(fā)生過程,可以作為其潛在的生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示,miR-29c在LAA型缺血性腦卒中患者的相對表達(dá)水平低于健康人群,這與張玲等[25]的研究相一致。

miR-370在脂質(zhì)代謝中起著關(guān)鍵作用,且在冠狀動脈粥樣硬化患者外周血中的水平較非冠脈硬化患者顯著增加[26],miR-370的過度表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞的遷移與侵襲,從而參與了動脈粥樣硬化的重要過程[27],并且Tian等[28]的研究表明miR-370能夠抑制由氧化的低密度脂蛋白引發(fā)的血管炎癥和氧化應(yīng)激。以上研究都表明了miR-370可能通過多種途徑參與LAA型缺血性腦卒中的發(fā)生。本研究結(jié)果也證實了外周血漿miR-370在發(fā)生LAA型缺血性腦卒中后,相對表達(dá)量顯著增加,這也與上述結(jié)果相一致。

另外,對miR-29c和miR-370與IMT的相關(guān)性分析也發(fā)現(xiàn),二者與IMT都存在關(guān)聯(lián),miR-29c相對表達(dá)量與IMT呈負(fù)相關(guān),miR-370相對表達(dá)量與IMT呈正相關(guān),同時,其他氧化應(yīng)激及炎癥相關(guān)指標(biāo)IMA和hs-CRP與IMT之間也存在正相關(guān),這些也從一定程度印證了他們之間可能存在一定協(xié)同作用,共同參與了LAA型缺血性腦卒中的發(fā)生。ROC曲線分析也顯示,miR-29c、miR-370和IMT可以作為LAA型缺血性腦卒中發(fā)生的預(yù)測因子,單獨預(yù)測時,以miR-370表現(xiàn)最優(yōu)(靈敏度0.986、特異度0.926、AUC 0.978),三者聯(lián)合檢測時,診斷效能達(dá)到最大(AUC 0.995)。這也證實了外周血漿miR-29c、miR-370聯(lián)合IMT檢測更有助于提升LAA型缺血性腦卒中的臨床診斷效能。

但是本研究也有一定不足,首先是樣本數(shù)據(jù)量偏小,不可避免地會有數(shù)據(jù)偏差存在,需要多中心大數(shù)據(jù)的進(jìn)一步驗證。其次超聲檢查是由資深超聲科醫(yī)生完成的,但未固定人員,存在一定程度人員測量誤差;頸總動脈IMT測量采用的是左、右頸總動脈分別測量后取平均值來計算,但若患者只有單側(cè)頸總動脈IMT增厚,則也可能會導(dǎo)致平均IMT正常從而造成結(jié)果偏差。

4 結(jié)論

外周血漿miR-29c、miR-370水平及頸總動脈IMT值與LAA型缺血性腦卒的發(fā)生密切相關(guān),三者聯(lián)合檢測對提高LAA型缺血性腦卒中的臨床診斷效能具有重要意義。