向日葵花盤蛋白提取工藝優(yōu)化分析酶解物抗氧化活性研究

◎ 董毓卿，張挺嘉，馬惠茹，劉紅微，劉 帥

(河套學(xué)院農(nóng)學(xué)系 長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000)

向日葵作為我國主要的油料作物，對鹽堿、干旱、瘠薄土地等具有較強(qiáng)抗性，有較廣的種植區(qū)域，其中，內(nèi)蒙古、新疆、東北三省的種植面積最大[1]。向日葵種子是主要經(jīng)濟(jì)作物，可食用或榨油。葵花盤作為向日葵副產(chǎn)物，除部分作為飼料加工原料，大多數(shù)都棄之荒野或填埋處理，這樣極易造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。

植物多肽的生物活性很多，抗氧化活性是其重要生物活性之一，也是目前研究的熱點(diǎn)[2，3]，但多數(shù)研究集中在植物籽蛋白[4-6]，對葵花盤、秸稈等農(nóng)業(yè)低值副產(chǎn)物研究較少?？ūP中含有多糖、黃酮、生物堿等多種活性成分[7-9]，其中，總蛋白含量與糧食相近，約為7%～13%[10]。因此，對向日葵花盤蛋白進(jìn)行開發(fā)利用，不僅能提高農(nóng)業(yè)低值副產(chǎn)物利用率，還能減少對環(huán)境造成的污染，為向日葵花盤的綜合利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自然晾曬干制的向日葵花盤，采自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市臨河區(qū)遠(yuǎn)景村；中性蛋白酶、堿性蛋白酶，上海源葉生物科技有限公司；木瓜蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

PR124ZH電子天平，奧豪斯OHAUS儀器有限公司；EU-2200紫外可見分光光度計(jì)，杭州綠博儀器有限公司；PHSJ-3F實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將脫籽后自然晾曬干制的葵花盤，磨粉過篩（70目），正己烷脫脂后40～50 ℃條件下烘干，制得葵花盤粉，備用。

1.3.2 葵花盤蛋白質(zhì)含量測定

葵花盤總蛋白含量采用GB 5009.5—2016中的第1種方法進(jìn)行測定。

葵花盤粉提取液中蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法。蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

1.3.3 葵花盤粗蛋白提取

將上述制得的葵花盤粉，按一定的料液比調(diào)配成水溶液，調(diào)節(jié)浸提液pH及溫度，浸提液于4000 r/min的速度離心20 min。去沉淀后，上清液使用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至等電點(diǎn)，4000 r/min的速度離心20 min，沉淀用蒸餾水洗至中性，真空冷凍干燥制得葵花盤粗蛋白，備用。

1.3.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

以葵花盤蛋白提取率為指標(biāo)，分別考察在料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）、浸提溫度（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃）、浸提時間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min）、堿液pH（pH9、pH10、pH11、pH12、pH13）對葵花盤蛋白提取率的影響，確定葵花盤粗蛋白提取實(shí)驗(yàn)的正交試驗(yàn)條件范圍。

1.3.3.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)葵花盤蛋白提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以料液比（A）、浸提溫度（B）、浸提時間（C）、堿液pH（D）為考察因素，以向日葵花盤蛋白提取率的指標(biāo)，利用正交表L9（34），設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中各因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)水平表

1.3.4 葵花盤蛋白酶解

分別選擇木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)溶液pH至酶反應(yīng)最適pH（如表2所示），對底物濃度為2%葵花盤蛋白水解液進(jìn)行單酶酶解，每隔30 min測定酶解液的pH，使其始終保持在蛋白酶反應(yīng)的最適pH，反應(yīng)時間結(jié)束后，于100 ℃滅酶10 min，酶解液于4000 r/min條件下離心15 min，進(jìn)一步測定上清液抗氧化能力。

表2 酶解反應(yīng)條件表

1.3.5 葵花盤多肽粗提物抗氧化能力測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的測定

參照J(rèn)AMDAR等[11]方法，對不同蛋白酶酶解出的葵花盤多肽粗提物的DPPH自由基清除能力進(jìn)行測定。取樣品提取液3 mL及濃度為0.5 mmol/L的DPPH溶液0.25 mL，先后加入到同一試管中，搖勻，避光37 ℃放置20 min，以溶劑為參比，在吸光度514 nm處測定其吸光度為Ai。再取0.5 mmol/L的DPPH溶液0.75 mL與3 mL70%乙醇，一起放入同一試管，搖勻，在避光37 ℃放置20 min，以溶劑為參比，在吸光度514 nm處測定其吸光度A0。分別取葵花盤蛋白酶解液3 mL與70%乙醇0.75 mL放入同一試管中，混勻后避光置于37 ℃恒溫箱內(nèi)反應(yīng)20 min，以溶劑為參比，在吸光度514 nm處測定其吸光度為Aj。依據(jù)DPPH自由基清除率計(jì)算公式得出結(jié)果。

1.3.5.2 超氧陰離子自由基清除能力的測定

將濃度為0.05 moL/L的Tris-HCL緩沖溶液4 mL加入到10 mL試管中，置于25 ℃水浴20 min，將樣品液和0.2 mmol/L鄰苯三酚分別放入水浴鍋中預(yù)熱20 min，并依次向試管中分別加入葵花盤蛋白酶解液1 mL，將試管內(nèi)溶液混合均勻后于25 ℃水浴鍋中，4 min后立即用濃鹽酸終止反應(yīng)[12]。在波長325 nm處測吸光度A1，同時作參比溶液，參比溶液為10 mL試管中加入緩沖溶液4 mL和1 mL樣液以及1 mL 0.05 mol/L HCl。對照組用蒸餾水代替，最后依據(jù)超氧陰離子清除率計(jì)算公式計(jì)算得出結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 向日葵花盤蛋白提取

2.1.1 向日葵花盤粉粗蛋白含量

利用凱氏定氮法對粉碎過篩干燥后的向日葵花盤粉原料粗蛋白進(jìn)行測定，測定結(jié)果為9.19%。

2.1.2 不同料液比對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響

通過圖2可看出，料液比對向日葵花盤粗蛋白提取率有一定影響，當(dāng)料液比在1∶10～1∶30范圍內(nèi)，向日葵花盤粗蛋白提取率隨提取液體積的增加而升高，并且提取率差距較明顯，而料液比在1∶30～1∶50范圍內(nèi)，提取率略有下降，故選擇葵花盤粗蛋白提取料液比1∶30 g/L。

圖2 不同料液比對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響圖

2.1.3 不同提取溫度對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響

通過圖3可看出，提取溫度對向日葵花盤蛋白質(zhì)提取率有一定影響，提取溫度20～30 ℃范圍內(nèi)，向日葵花盤蛋白提取率增高，在溫度30 ℃時達(dá)到峰值；而提取溫度在30～50 ℃范圍內(nèi)，提取率明顯下降，由此可見，高溫提取條件下可能會導(dǎo)致葵花盤蛋白變性，故不考慮60 ℃或更高提取溫度，選擇30 ℃作為最適提取溫度。

圖3 不同提取溫度對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響圖

2.1.4 不同提取時間對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響結(jié)果

通過圖4可看出，浸提時間在10 min～50 min范圍內(nèi)，向日葵花盤粗蛋白提取率先有增加，后緩慢下降，并趨于平緩；在浸提20 min時，達(dá)到最大值，故選擇20 min為最適提取時間。

圖4 不同提取時間對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響圖

2.1.5 不同堿液pH對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響結(jié)果

通過圖5可看出，堿液pH對向日葵花盤蛋白提取率有一定影響，堿液pH9～pH11，向日葵花盤蛋白提取率差距不大；堿液pH11～pH13，向日葵花盤蛋白提取率差異顯著，在堿液pH12時達(dá)到峰值，故選擇pH12為最適提取pH值。

圖5 不同堿液pH對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響圖

2.1.6 葵花盤蛋白提取正交實(shí)驗(yàn)分析

正交實(shí)驗(yàn)后，本研究找到向日葵花盤粗蛋白最佳提取條件為A3B3C2D2，即料液比1∶35、溫度35 ℃、時間20 min、堿液pH12。由表3可知，提取液的pH和料液比對蛋白的提取率有顯著性影響。

表3 葵花盤蛋白提取正交實(shí)驗(yàn)表

由此可見，向日葵花盤中粗蛋白提取率的影響因素順序?yàn)椋禾崛∫簆H＞料液比＞浸提時間＞浸提溫度。從正交實(shí)驗(yàn)中得出的堿提酸沉法最佳條件下提取向日葵花盤中蛋白，其得率為20.23%。

2.2 不同酶解處理后所得向日葵花盤多肽抗氧化能力結(jié)果

2.2.1 不同酶解處理后所得向日葵花盤多肽對DPPH·的清除能力

由圖6可知，向日葵盤蛋白經(jīng)不同酶解后，其酶解多肽對DPPH·清除能力存在較明顯差異。其中，葵花盤蛋白中性蛋白酶酶解液對DPPH·的清除能力最強(qiáng)，達(dá)到23.1%；葵花盤蛋白木瓜蛋白酶酶解液的DPPH·清除能力為10.3%；而堿性蛋白酶處理后的樣品的清除能力僅為5.1%。由此可見，在相同條件下，堿性蛋白酶處理后得到的多肽清除DPPH·自由基的能力最弱；中性蛋白酶處理后的多肽對清除DPPH·自由基的能力最強(qiáng)。

圖6 不同酶解處理后所得向日葵花盤多肽對DPPH·的清除能力圖

2.2.2 超氧陰離子清除能力

由圖7中的清除率數(shù)值可知，用中性蛋白酶和堿性蛋白酶分別單獨(dú)處理葵花盤蛋白后，得到的葵花盤多肽溶液對超氧陰離子清除能力均約為40%，添加木瓜蛋白酶處理后得到的葵花盤多肽溶液，其超氧陰離子自由基清除能力約為前兩者的一半，依次為40.03%、39.64%和19.70%[12]。

圖7 不同蛋白酶處理后的葵花盤多肽對超氧陰離子自由基的清除能力圖

3 結(jié)論

本研究以蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，通過正交實(shí)驗(yàn)對向日葵花盤粗蛋白進(jìn)行堿提酸沉法提取工藝優(yōu)化，并采用考馬斯亮藍(lán)法對提取液中蛋白含量進(jìn)行測定，得到向日葵花盤粗蛋白堿提酸沉最優(yōu)工藝。隨后，分別使用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶，對向日葵花盤蛋白進(jìn)行酶解，并通過抗氧化實(shí)驗(yàn)對酶解液抗氧化能力進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果顯示，上述3種酶解產(chǎn)物均表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，其中，中性蛋白酶酶解后得到的葵花盤多肽的抗氧化能力相對突出。因此，本研究可為向日葵花盤抗氧化肽的制備提供理論依據(jù)，提高向日葵花盤的利用價(jià)值。