連翹酯苷A對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷的影響

詹和道，姚江凌，崔紅旺

〔摘要〕 目的 探討連翹酯苷A對(duì)白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷的影響及其可能的作用機(jī)制。方法 采用50 mg/L IL-1β誘導(dǎo)人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型，記為模型組；另取未處理細(xì)胞為對(duì)照組。采用1.25、2.5、5.0 μmol/L不同濃度的連翹酯苷A處理軟骨細(xì)胞，依次記為連翹酯苷A低、中、高劑量組。ELISA法檢測(cè)炎癥因子[IL-1β、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）]水平；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，qRT-PCR檢測(cè)circSERPINE2表達(dá)量。pcDNA、pcDNA-circSERPINE2轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞后用IL-1β處理，si-NC、si-circSERPINE2分別轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞后用連翹酯苷A與IL-1β共同處理24 h，采用ELISA法檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α的水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；Western blot法檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)量。結(jié)果 連翹酯苷A作用于IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞后，炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平、細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白水平降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白、circSERPINE2表達(dá)水平升高（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染pcDNA-circSERPINE2后炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白水平降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平升高（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染si-circSERPINE2后，炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平、細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白水平升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P＜0.05）。結(jié)論 連翹酯苷A可通過(guò)上調(diào)circSERPINE2表達(dá)而抑制細(xì)胞炎癥因子表達(dá)及細(xì)胞凋亡，從而減輕IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷。

〔關(guān)鍵詞〕 連翹酯苷A；circSERPINE2；白細(xì)胞介素-1β；人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞；炎癥；細(xì)胞凋亡；Bax蛋白；Bcl-2蛋白

〔中圖分類號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.08.009

Effects of forsythoside A on IL-1β-induced chondrocyte injury

ZHAN Hedao， YAO Jiangling， CUI Hongwang*

The First Hospital of Hainan Medical College， Haikou， Hainan 570102， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects of forsythoside A on IL-1β-induced chondrocyte injury and its possible mechanism of action. Methods Cell injury models of Human articular chondrocytes were established using 50 mg/L interleukin-1β （IL-1β）， which were denoted as model group. The untreated chondrocytes were taken as control group. Chondrocytes treated with 1.25， 2.5 and 5.0 μmol/L forsythoside A were recorded as low-， medium- and high-dose forsythoside A groups， respectively. The levels of inflammatory factors [IL-1β， interleukin-6 （IL-6）， and tumor necrosis factor-α （TNF-α）] were measured by ELISA; the apoptosis rate was determined by flow cytometry; the expression of circSERPINE2 was measured by qRT-PCR. The pcDNA and pcDNA-circSERPINE2 were separately transfected into chondrocytes which were treated with IL-1β for 24 h afterwards; the si-NC and si-circSERPINE2 were separately transfected into chondrocytes which were co-treated with forsythoside A and IL-1β for 24 h afterwards. Then， the levels of IL-1β， IL-6， and TNF-α were determined by ELISA; the apoptosis rate was measured by flow cytometry; the protein expression levels of Bax and Bcl-2 were determined by Western blot. Results After forsythoside A acting on IL-1β-induced chondrocytes， the levels of inflammatory factors （IL-1β， IL-6， and TNF-α）， apoptosis rate， and Bax protein level decreased （P<0.05）， while the expression levels of Bcl-2 protein and circSERPINE2 increased （P<0.05）. After transfection of pcDNA-circSERPINE2， the levels of inflammatory factors （IL-1β， IL-6， and TNF-α）， apoptosis rate and Bax protein level decreased （P<0.05）， while Bcl-2 protein level increased （P<0.05）. After transfection of si-circSERPINE2， the levels of inflammatory factors （IL-1β， IL-6， and TNF-α）， apoptosis rate and Bax protein level increased （P<0.05）， while Bcl-2 protein level decreased （P<0.05）. Conclusion Forsythoside A could reduce IL-1β-induced chondrocyte injury by up-regulating circSERPINE2 expression and thus inhibiting the expressions of cellular inflammatory factors and apoptosis.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 forsythoside A; circSERPINE2; interleukin-1β; human articular chondrocytes; inflammation; apoptosis; Bax protein; Bcl-2 protein

骨關(guān)節(jié)炎是常見(jiàn)的一種骨關(guān)節(jié)疾病，常發(fā)生于中老年人群中，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡是造成細(xì)胞損傷的重要原因[1-2]。目前，尚缺乏有效治療骨關(guān)節(jié)炎的方法。研究表明，中醫(yī)藥及其活性成分可通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞凋亡從而達(dá)到治療骨關(guān)節(jié)炎的目的[3-4]。連翹屬于我國(guó)傳統(tǒng)中藥，被廣泛用于治療炎癥、發(fā)熱等疾病。連翹酯苷A是從連翹中分離出的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化等作用，可抑制由巨噬細(xì)胞活化引起的炎癥及氧化性疾病[5]。然而，連翹酯苷A對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療效果及其可能的作用機(jī)制尚未可知。失調(diào)的環(huán)狀RNA（circRNA）與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展有關(guān)[6]。據(jù)報(bào)道，circRNA絲氨酸蛋白酶抑制劑家族E成員2（circSERPINE2）在骨關(guān)節(jié)炎中表達(dá)下調(diào)，其過(guò)表達(dá)可減弱白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）引起的軟骨細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)降解，是骨關(guān)節(jié)炎治療的新靶點(diǎn)[7-8]。本研究通過(guò)IL-1β誘導(dǎo)建立人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷模型，探討連翹酯苷A是否可通過(guò)調(diào)控circSERPINE2表達(dá)影響IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷。

1 材料與方法

1.1? 主要藥物、試劑及儀器

連翹酯苷A（上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)：20191201，純度≥98%）；人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞（上海中喬新舟生物科技有限公司，批號(hào)：20191006）；IL-1β（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：20190819）；DMEM培養(yǎng)液（上海碧云天公司，批號(hào)：20200225）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：20200114）；Trizol試劑、LipofectamineTM 3000轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：20190907、20190903）；反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher公司，批號(hào)：20191106）；pcDNA、pcDNA-circSERPINE2、si-NC、si-circSERPINE2（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，批號(hào)：20190828、20190817、20200108、20200112）；IL-1β、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Abcam公司，批號(hào)：20190206、20200324、20190907）；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶公司，批號(hào)：20190706）。流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司，型號(hào)：FACS-Calibur）；高速離心機(jī)（賽默飛世爾科技公司，型號(hào)：Micro17R）；PCR儀（美國(guó)ABI公司，型號(hào)：HT9700）。

1.2? 方法

1.2.1? 分組及處理? 于6孔板（1×104個(gè)/孔）接種軟骨細(xì)胞，用含50 mg/L IL-1β的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h[9]，記為模型組，未處理細(xì)胞作為對(duì)照組。用含1.25、2.5、5.0 μmol/L連翹酯苷A[10]與50 mg/L IL-1β的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，依次記為連翹酯苷A低劑量組、連翹酯苷A中劑量組、連翹酯苷A高劑量組。

1.2.2? 細(xì)胞轉(zhuǎn)染? 于6孔板（1×104個(gè)/孔）接種軟骨細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合至80%時(shí)，參照轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明書(shū)分別將pcDNA、pcDNA-circSERPINE2、si-NC、si-circSERPINE2轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為IL-1β+pcDNA組（轉(zhuǎn)染pcDNA后，用含50 mg/L IL-1β的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h）、IL-1β+pcDNA-circSERPINE2組（轉(zhuǎn)染pcDNA-circSERPINE2后，用含50 mg/L IL-1β的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h）、IL-1β+連翹酯苷A+si-NC組（轉(zhuǎn)染si-NC后，用含5.0 μmol/L連翹酯苷A與50 mg/L IL-1β的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h）、IL-1β+連翹酯苷A+si-circSERPINE2組（轉(zhuǎn)染si-circSERPINE2后，用含5.0 μmol/L連翹酯苷A與50 mg/L IL-1β的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h）。轉(zhuǎn)染后收集各組細(xì)胞行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3? 觀察指標(biāo)

1.3.1? ELISA法檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α的水平? 將各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液離心（350×g、10 min），取上清液，利用IL-1、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α水平。嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，各組細(xì)胞離心后取上清液行后續(xù)檢測(cè)，按照倍比稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)品。將各組細(xì)胞上清液加入96孔板，分別加入樣品及標(biāo)準(zhǔn)品后洗板，加入生物素化抗體100 μL/孔，室溫下孵育60 min，洗板5次后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素100 μL/孔，孵育20 min后洗板5次，加入顯色劑TMB溶液100 μL/孔孵育20 min，加入終止液50 μL/孔后檢測(cè)450 nm處的吸光度（A）值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品曲線計(jì)算濃度。

1.3.2? 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡? 收集各組細(xì)胞并懸浮在1×結(jié)合緩沖液中，然后加入5 μL的AnnexinV-FITC溶液和10 μL PI（1 g/mL），在室溫和黑暗條件下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行15 min染色。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的比例，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率（%）=早期細(xì)胞的凋亡比例+晚期細(xì)胞的凋亡比例。

1.3.3? Western blot法檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)量

提取各組細(xì)胞中總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，將總蛋白（30 μg）通過(guò)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h后，將膜分別與Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、GAPDH一抗（1∶2 000）在4 ℃下孵育12 h，洗膜，再與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗（1∶3 000）在室溫下孵育1 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑顯影，曝光，Tanon600圖像分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4? qRT-PCR法檢測(cè)circSERPINE2的表達(dá)水平

取Trizol試劑提取各組細(xì)胞中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后，將該cDNA與SYBR Green和特異性引物一起在qRT-PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)系統(tǒng)（20 μL）：10 μL SYBR■ Premix Ex TaqTM（2×）、0.8 μL PCR正向引物（10 μmol/L）、0.8 μL PCR反向引物（10 μmol/L）、2 μL cDNA（200 ng/μL）和6.4 μL無(wú)菌水。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃，30 s（預(yù)變性）；95 ℃，5 s（變性），55 ℃，10 s（退火），72 ℃，15 s（延伸），共計(jì)40個(gè)循環(huán)。GAPDH為circSERPINE2的內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法分析circSERPINE2相對(duì)GAPDH的表達(dá)水平。引物序列如下：circSERPINE2，正向5'-CGGGAAATCCTATCAAGTGC-3'，反向5'-ATTGAAGTGGGAGCAGATGG-3'；GAPDH，正向5'-GAAAGCCTGCCGGTGACTAA-3'，反向5'-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3'。

1.4? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各檢測(cè)指標(biāo)均為計(jì)量資料，以“ｘ±s”表示。多組間比較采用單因素方差分析；組間比較采用SNK檢驗(yàn)；兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 連翹酯苷A抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)

與對(duì)照組比較，模型組IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，連翹酯苷A低、中、高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平隨劑量升高而降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

2.2? 連翹酯苷A抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白水平升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，連翹酯苷A低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白水平隨劑量升高而降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平隨劑量升高而升高（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖1、表2。

2.3? 連翹酯苷A對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中circSERPINE2表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組circSERPINE2表達(dá)量降低（P＜0.05）；與模型組比較，連翹酯苷A低、中、高劑量組circSERPINE2的表達(dá)量升高（P＜0.05）。詳見(jiàn)表3。

2.4? 轉(zhuǎn)染后circSERPINE2表達(dá)比較

與pcDNA組比較，pcDNA-circSERPINE2組circSERPINE2表達(dá)量升高（P＜0.05）；與si-NC組比較，si-circSERPINE2組circSERPINE2表達(dá)量降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)表4。

2.5? circSERPINE2對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響

與IL-1β+pcDNA組比較，IL-1β+pcDNA-circSERPINE2組炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平、細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白水平降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平升高（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖2、表5。

2.6? 抑制circSERPINE2對(duì)軟骨細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響

與IL-1β+連翹酯苷A+si-NC組比較，IL-1β+連翹酯苷A+si-circSERPINE2組炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平、細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白水平升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)表6、圖3。

3 討論

IL-1β屬于促炎細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)度炎癥反應(yīng)，甚至凋亡，促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展，被廣泛應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎的病理生理學(xué)研究[11-12]。骨關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)學(xué)“痹病”范疇，與“痹病”中“鶴膝風(fēng)”“骨痹”“筋痹”相類似。膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病與肝、脾、腎虧虛，風(fēng)、寒、濕及瘀血客于局部有關(guān)，最終都導(dǎo)致局部血瘀氣滯、經(jīng)絡(luò)痹阻不通而發(fā)病。研究表明，中醫(yī)藥及其活性成分具有抗骨關(guān)節(jié)炎作用[13]。circRNA可充當(dāng)miRNA的海綿分子調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖及凋亡，進(jìn)而參與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[14]。但circRNA是否可作為中醫(yī)藥治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)尚未闡明。

連翹是一種傳統(tǒng)中藥材，由于其抗氧化、抗菌和抗病毒活性，在治療發(fā)熱、炎癥和潰瘍等疾病方面發(fā)揮著重要作用[15]。連翹酯苷A是從連翹中提取的主要生物活性成分，具有多種生物學(xué)特性，尤其是抗炎特性[16]。據(jù)報(bào)道，連翹酯苷A可抑制高葡萄糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥損傷[17]。在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷中，連翹酯苷A可通過(guò)上調(diào)miR-124表達(dá)，抑制TNF-α和IL-6的產(chǎn)生，在體外和體內(nèi)減輕脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減輕肺損傷[18]。本研究結(jié)果顯示，IL-1β處理可促進(jìn)軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生和軟骨細(xì)胞凋亡的增加，與既往研究報(bào)道結(jié)果相似[19-20]。給予連翹酯苷A干預(yù)后，隨著濃度的升高，IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平降低，同時(shí)細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白水平降低，Bcl-2表達(dá)水平升高，提示連翹酯苷A可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。

circSERPINE2源自SERPINE2基因，已被證實(shí)是骨關(guān)節(jié)炎中的保護(hù)性circRNA[6-7]。本研究檢測(cè)了IL-1β處理的軟骨細(xì)胞中circSERPINE2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)circSERPINE2表達(dá)水平降低，circSERPINE2過(guò)表達(dá)可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，表明circSERPINE2的減少可能與IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷有關(guān)。給予連翹酯苷A處理后，IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中circSERPINE2的表達(dá)量升高，提示連翹酯苷A可能通過(guò)上調(diào)circSERPINE2表達(dá)而減輕IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷。為進(jìn)一步驗(yàn)證circSERPINE2是否介導(dǎo)連翹酯苷A的抗骨關(guān)節(jié)炎作用，本研究在IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中敲低circSERPINE2，進(jìn)行功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，抑制circSERPINE2表達(dá)可拮抗連翹酯苷A對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷的作用。

綜上所述，連翹酯苷A對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥因子表達(dá)及細(xì)胞凋亡具有抑制作用，這可能與其上調(diào)circSERPINE2表達(dá)有關(guān)。本研究表明，連翹酯苷A具有治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在價(jià)值，但連翹酯苷A作用的circSERPINE2下游調(diào)控通路尚需進(jìn)一步探究。

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（本文編輯? 周? 旦）