三色堇酪氨酸脫羧酶基因表達(dá)的位置效應(yīng)

饒 英 林 穎 王 健 劉國(guó)鋒 張文娥 彭 婷，*

（1貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2海南省熱帶特色花木資源生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南大學(xué)林學(xué)院，海南 ?？?570228；3廣州市林業(yè)和園林科學(xué)研究院，廣東 廣州 510405）

三色堇（Viola×wittrockiana）為堇菜科（Violaceae）堇菜屬（Viola）植物，是世界范圍內(nèi)重要的冬春季花壇花卉，具有典型的花瓣色斑性狀，是觀賞植物花色、花斑研究的理想材料。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)三色堇花色、花斑的研究主要集中在花色素成分鑒定［1-2］及花青素合成相關(guān)基因的分離與表達(dá)分析等方面［3-4］。

酪氨酸脫羧酶（tyrosine decarboxylase， TyDC）是連接植物初生代謝與次生代謝的初始酶［5］，可將底物酪氨酸脫羧形成酪胺［6-8］。在天然藥源植物紅景天（Rhodiola rosea）和地黃（Rehmannia glutinosa）中，TyDC對(duì)紅景天苷和麥角甾苷的合成分別起促進(jìn)作用［9-11］。近期的一些研究認(rèn)為T(mén)yDC 可能與花色形成有關(guān)。如Zhou 等［12］研究發(fā)現(xiàn)擬南芥TyDC 的作用底物酪氨酸可以誘導(dǎo)花青素的合成，對(duì)酪氨酸降解缺陷突變體fah進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在突變體中，酪氨酸對(duì)花青素的誘導(dǎo)效果顯著低于野生型，且突變體中花青素合成的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因表達(dá)量的提升幅度顯著低于野生型，說(shuō)明酪氨酸的降解產(chǎn)物誘導(dǎo)了花青素的積累。本課題組前期在三色堇品種黃色帶花斑中的研究發(fā)現(xiàn)，VwTyDC基因在花瓣中的表達(dá)量顯著高于根、莖和葉，并且在色斑區(qū)的表達(dá)量高于非色斑區(qū)［13］。Cui等［2］用酪氨酸對(duì)三色堇非色斑區(qū)進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)非色斑區(qū)出現(xiàn)了條紋狀的色斑，通過(guò)病毒介導(dǎo)的基因沉默（virusinduced gene silencing， VIGS）技術(shù)沉默VwTyDC基因后，三色堇色斑區(qū)的顏色明顯變淺，說(shuō)明VwTyDC基因可能與花青素的合成有關(guān)。

本課題組在轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新基因并命名VwTyDC-like，該基因在三色堇花瓣不同區(qū)域存在差異表達(dá)。為進(jìn)一步探究VwTyDC-like基因在三色堇中的精細(xì)表達(dá)模式，本研究克隆獲得VwTyDC-like基因的cDNA 及gDNA 序列，并與VwTyDC進(jìn)行對(duì)比分析。同時(shí)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技術(shù)分析VwTyDC和VwTyDC-like基因在三色堇不同組織器官、花瓣發(fā)育不同時(shí)期、不同花色品種及其唇瓣不同區(qū)域的表達(dá)模式，以期為探究VwTyDC與VwTyDC-like基因在三色堇中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，為三色堇新品種培育及植物花色形成機(jī)理研究提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以三色堇超級(jí)賓哥（Matrix）系列的不同花色品種，包括黃色（Yellow）、黃色帶花斑（Yellow Blotch）、純藍(lán)色（True Blue）、藍(lán)色帶花斑（Blue Blotch）、白色（White）和白色帶花斑（White Blotch），帝國(guó)巨人Ⅱ（Majestica GiantsⅡ）系列的淡紫色漸變（Lavender Shades）和得大（Delta）系列的紫羅蘭白雙色（Violet & White）（圖1）為供試材料，所有種子均購(gòu)于美國(guó)泛美種子公司。于2021年8月上旬將不同品種的三色堇種子播種在廣州市觀賞植物種質(zhì)資源圃，采用常規(guī)栽培管理措施，待2021 年10 月上旬三色堇進(jìn)入始花期，分區(qū)域和發(fā)育時(shí)期采集不同品種的花瓣進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 不同花色的三色堇品種Fig.1 Pansy cultivars with different flower colors

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 樣品采集分為四組，第一組：采集黃色帶花斑品種的根、莖、葉、花芽、花、幼果和種子用于不同組織器官的表達(dá)分析；第二組：參照Li等［1］的方法將三色堇的花發(fā)育過(guò)程劃分為7個(gè)時(shí)期（S1～S7），采集黃色帶花斑品種7 個(gè)時(shí)期花瓣中心色斑區(qū)（a）與非色斑區(qū)（b）的樣品，用于不同花發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析；第三組：將白色帶花斑和白色2個(gè)品種的唇瓣由內(nèi)向外劃分為5個(gè)區(qū)域（區(qū)域1～5）進(jìn)行采樣（圖1），用于唇瓣不同區(qū)域的表達(dá)分析；第四組：收集5 個(gè)不同花色品種（黃色、純藍(lán)色、藍(lán)色帶花斑、粉紫色漸變和紫羅蘭白雙色）花發(fā)育S7 期中心色斑區(qū)（無(wú)斑品種為中心色斑對(duì)應(yīng)區(qū)，a）、非色斑區(qū)（無(wú)斑品種為非色斑對(duì)應(yīng)區(qū)，b）及邊緣色斑區(qū)（僅紫羅蘭白雙色品種有此區(qū)域，c）的樣品，用于不同花色三色堇品種在S7期的表達(dá)分析（圖1）。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，于液氮中速凍后，-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 植物核酸提取和cDNA合成 以三色堇的嫩葉或花瓣為材料，采用改良溴化十六烷基三甲胺（cetyl trimethylammonium bromide， CTAB）法提取總DNA，利用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（艾德萊，北京）提取不同品種、時(shí)期及組織品種樣本總RNA，將檢測(cè)合格的RNA 樣品按照Prime ScriptTMRTreagent kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa，大連）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 樣品置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3VwTyDC-like基因克隆和結(jié)構(gòu)分析 基于黃色帶花斑品種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到1 個(gè)VwTyDC-like（Unigene0055670），結(jié)合分離VwTyDC-like基因啟動(dòng)子時(shí)得到的序列，利用Prime 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異引物（表1），分別擴(kuò)增cDNA 及gDNA 序列。將PCR 產(chǎn)物用膠回收試劑盒（艾德萊，北京）進(jìn)行回收后，連接到pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑選單菌落經(jīng)PCR 檢測(cè)后，送至上海生工生物公司測(cè)序。利用在線網(wǎng)站GSDS（http：//gsds.gao-lab.org/）分析該基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，并利用Exon-Intron Graphic Maker 在線網(wǎng)站（http：//www.wormweb.org/exonintron）繪制基因構(gòu)圖。

表1 本研究所用引物Table 1 Primer sequences used in this study

1.2.4 生物信息學(xué)分析 利用ProtParam 在線分析軟件（https：//web. expasy. org/protparam/）分析VwTyDClike蛋白的理化性質(zhì)，VwTyDC-like 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分別使用在線工具SOPMA（https：//npsa-prabi. ibcp. fr/cgi-bin/secpred_sopma. pl）和SWISSMODEL（https：//swissmodel. xpasy. org/）完成。將獲得的VwTyDC-like 序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中（https：//blast.ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi）進(jìn)行比對(duì)，下載其他物種的同源序列并利用DNAMAN6.0 軟件進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)。利用MEGA 11 軟件采用最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，bootstrap值設(shè)為1 000。

1.2.5 基因表達(dá)分析 以反轉(zhuǎn)錄cDNA 為模板，按照TB Green?Premix Ex Taq? II（Tli RNaseH Plus）試劑盒（TaKaRa，大連）操作說(shuō)明，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-tive PCR， qRT-PCR）技術(shù)分析VwTyDC-like和VwTyDC在三色堇不同組織器官、花發(fā)育的不同時(shí)期、不同品種中的表達(dá)模式。利用Primer 5.0 設(shè)計(jì)引物（表1），以三色堇β-actin作為內(nèi)參基因［15］，以2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本均設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3 次技術(shù)重復(fù)。使用Excel2016 和SPSS19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用Duncan 新復(fù)極差法做顯著性分析（P＜0.05），并采用Origin 2019b軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 VwTyDC-like基因的克隆與序列分析

從前期獲得的黃色帶花斑三色堇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到1 個(gè)在花瓣不同區(qū)域存在差異表達(dá)的Unigene。以黃色帶花斑品種花瓣的cDNA 為模板，通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到1 條特異條帶（圖2-A）。測(cè)序后獲得的編碼序列（coding sequence， CDS）序列長(zhǎng)1 497 bp，編碼498個(gè)氨基酸。該基因序列與VwTyDC高度相似，命名為VwTyDC-like基因，GenBank 登錄號(hào)為ON866521。同時(shí)，以黃色、純藍(lán)色、白色3個(gè)無(wú)斑品種花瓣的cDNA 為模板通過(guò)PCR 擴(kuò)增VwTyDC-like和VwTyDC的核苷酸序列。結(jié)果顯示，3 個(gè)品種VwTyDClike基因的核苷酸序列與黃色帶花斑品種完全一致；純藍(lán)色、白色品種VwTyDC基因的核苷酸序列與黃色帶花斑也完全一致，黃色品種的核苷酸序列與黃色帶花斑品種相比，僅有1 個(gè)堿基的差異，但編碼氨基酸序列一致。以黃色帶花斑葉片總DNA為模板，擴(kuò)增得到單一條帶（圖2-B），長(zhǎng)度為2 340 bp（包含部分啟動(dòng)子序列），GenBank 登錄號(hào)為ON866520?；蚪Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，VwTyDC-like基因包含2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子（圖2-C）。

圖2 VwTyDC-like基因克隆與結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Cloning of VwTyDC-like and exon-intron structure analysis

2.2 VwTyDC-like的序列分析

利用ExPASy中的ProtParam tool分析VwTyDC-like蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明該蛋白的相對(duì)分子量為54.94 kDa，理論等電點(diǎn)為5.84，脂肪系數(shù)86.97，總平均親水性為-0.052。利用ProtScale 程序分析VwTyDC-like 蛋白親水/疏水性，結(jié)果顯示其屬于親水性蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示2 個(gè)蛋白主要由α 螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成。用DNAMAN 對(duì)來(lái)自不同物種的TyDC 蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)VwTyDC-like與VwTyDC（ASW27173.1）氨基酸序列有37 個(gè)位點(diǎn)存在差異，與狗尾草（Setaria viridis）、橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis）和毛果楊（Populus trichocarpa）等物種的同源性為66.18%（圖3）。使用MEGA 11軟件對(duì)三色堇及其他物種的TyDC蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，VwTyDC-like 蛋白與三色堇VwTyDC 蛋白進(jìn)化關(guān)系最近，與橡膠樹(shù)TyDC 蛋白親緣關(guān)系相對(duì)較近，與葡萄（Vitis riparia）TyDC 蛋白親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，與單子葉植物狗尾草和玉米（Zea mays）TyDC 蛋白親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖4）。

圖3 VwTyDC-like與其他物種TyDCs蛋白序列比對(duì)Fig.3 Protein sequence alignment of VwTyDC-like and other TyDCs from different plants

圖4 三色堇與其他物種TyDC的進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 Phylogenetic tree of VwTyDC-like and VwTyDC with other TyDCs from different plants

2.3 VwTyDC-like 與VwTyDC 在不同組織及不同花發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式

qRT-PCR 結(jié)果顯示，VwTyDC-like基因在超級(jí)賓哥系列黃色帶花斑品種中的表達(dá)具有組織特異性，在花中的表達(dá)量顯著高于其他組織（圖5-A）。在花發(fā)育的S7 期，VwTyDC-like在花瓣基部的中心色斑區(qū)（a）的表達(dá)量顯著高于非色斑區(qū)（b），并達(dá)到峰值，此前S1～S6期該基因在中心色斑區(qū)（a）與非色斑區(qū)（b）的表達(dá)量無(wú)顯著差異（圖5-C）。進(jìn)一步分析顯示，VwTyDC與VwTyDC-like基因呈現(xiàn)出相似的表達(dá)模式（圖5）。

圖5 VwTyDC-like與VwTyDC在黃色帶花斑品種不同組織（A、B）和花發(fā)育的不同時(shí)期的表達(dá)分析（C、D）Fig.5 Expression analysis of VwTyDC-like and VwTyDC in different tissues （A， B） and at different flower developmental stages in Yellow Blotch cultivar （C， D）

2.4 VwTyDC-like與VwTyDC在花瓣中的表達(dá)模式

本研究利用得大系列的紫羅蘭白雙色品種分析了2 個(gè)基因的表達(dá)模式，該品種的色斑分布比較特殊，除花瓣基部有較大塊的色斑以外，下方三枚花瓣的邊緣也有小面積的色斑（圖1-H）。qRT-PCR 分析結(jié)果表明，在花發(fā)育的S7期，2個(gè)基因在中心色斑區(qū)（a）的表達(dá)量顯著高于邊緣色斑區(qū)（c）和非色斑區(qū)（b）；此外，非色斑區(qū)（b）的表達(dá)量高于邊緣色斑區(qū)（c）（圖6-A、B），推測(cè)VwTyDC-like與VwTyDC基因在花瓣中的表達(dá)可能具有位置效應(yīng)。

為進(jìn)一步明確VwTyDC-like與VwTyDC在花瓣中的表達(dá)分布是否與位置有關(guān)，本研究將白色帶花斑和白色品種在S7 期的唇瓣劃分成5 個(gè)區(qū)域，即從花瓣基部到花瓣邊緣分為區(qū)域1～5（圖7-A），采用qRT-PCR分析VwTyDC-like與VwTyDC在唇瓣不同區(qū)域的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，2 個(gè)基因明顯呈現(xiàn)出從基部到邊緣表達(dá)量逐漸下降的趨勢(shì)，在唇瓣基部（區(qū)域1，無(wú)色斑）的表達(dá)量均顯著高于其他位置（區(qū)域2～5），且在唇瓣邊緣（區(qū)域5）幾乎檢測(cè)不到2 個(gè)基因的表達(dá)（圖7），說(shuō)明VwTyDC-like與VwTyDC在花瓣中的表達(dá)分布的確與位置有關(guān)。同時(shí)，VwTyDC-like基因的表達(dá)量遠(yuǎn)高于VwTyDC，達(dá)到了后者的7～13倍（圖6、7）。

圖6 VwTyDC-like與VwTyDC基因在紫羅蘭白雙色品種中心色斑區(qū)（a）、非色斑區(qū)（b）和邊緣色斑區(qū)（c）的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of VwTyDC-like （A） and VwTyDC （B） in the central blotch areas （a）、 non-blotch areas （b） and marginal blotch areas （c） of pansy petals in Violet & White cultivar

圖7 白色帶花斑和白色品種唇瓣不同區(qū)域（A）中VwTyDC-like （B）與VwTyDC （C）的表達(dá)分析Fig.7 Expression analysis of VwTyDC-like （B） and VwTyDC （C） in different areas of labella （A） in White Blotch and White cultivars

2.5 VwTyDC-like 與VwTyDC 在不同花色品種中的位置效應(yīng)

為了解VwTyDC-like與VwTyDC基因表達(dá)的位置效應(yīng)在其他三色堇品種中是否廣泛存在，本研究還檢測(cè)了二者在不同系列不同花色三色堇品種中的表達(dá)情況，包括超級(jí)賓哥系列黃色、純藍(lán)色、藍(lán)色帶花斑和帝國(guó)巨人II 系列的淡紫色漸變品種。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在有斑品種淡紫色漸變和藍(lán)色帶花斑中，VwTyDC-like與VwTyDC基因在花發(fā)育的S7 期，中心色斑區(qū)（a）的表達(dá)量顯著高于非色斑區(qū)（b）。而且，在無(wú)斑品種黃色和純藍(lán)色中，VwTyDC-like與VwTyDC基因的表達(dá)量在中心色斑對(duì)應(yīng)區(qū)（a）同樣顯著高于非色斑對(duì)應(yīng)區(qū)（b），無(wú)斑品種表現(xiàn)出與有斑品種相似的表達(dá)特點(diǎn)（圖8）。說(shuō)明VwTyDC-like與VwTyDC基因表達(dá)的位置效應(yīng)在其他三色堇品種中同樣存在。同時(shí)，VwTyDC-like在不同品種中的表達(dá)量明顯高于VwTyDC，在淡紫色漸變品種中，VwTyDC-like的表達(dá)量比VwTyDC高252倍（圖8）。

圖8 VwTyDC-like（A）與VwTyDC（B）基因在不同花色品種不同區(qū)域的表達(dá)分析Fig.8 Expression analysis of VwTyDC-like （A） and VwTyDC （B） in the different areas of pansy petals with or without blotches in the pansy cultivars with different flower colors

3 討論

目前有關(guān)植物TyDC基因的研究較少，主要集中在逆境脅迫應(yīng)答［14-22］和酪氨酸衍生物合成路徑中活性分子的生物合成等方面［5-11，23-24］。本研究從三色堇中分離了一個(gè)新的酪氨酸脫羧酶基因（VwTyDC-like），并將該基因與之前報(bào)道的VwTyDC進(jìn)行了精細(xì)表達(dá)模式的比較分析。

3.1 VwTyDC-like與VwTyDC的同源性

VwTyDC-like與VwTyDC基因具有相似的核苷酸序列，氨基酸序列一致性為92.37%。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示2 個(gè)蛋白主要由α 螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成。同時(shí)，qRT-PCR 分析結(jié)果顯示，2個(gè)基因在三色堇不同組織器官、花發(fā)育不同時(shí)期、唇瓣不同區(qū)域、不同花色品種中呈現(xiàn)出高度一致的表達(dá)模式，在花中表達(dá)量最高；在花發(fā)育不同時(shí)期，表達(dá)差異僅在花發(fā)育的后期（S7）出現(xiàn)；無(wú)論品種有無(wú)色斑存在，在不同花色品種及其唇瓣的不同區(qū)域，表達(dá)量均由花瓣基部向外遞減。VwTyDC-like與VwTyDC基因有著高度相似的氨基酸序列及表達(dá)模式，說(shuō)明二者為同源基因，可能具有相似的生物學(xué)功能。值得注意的是，VwTyDC-like的表達(dá)量明顯高于VwTyDC（圖5～8），暗示VwTyDClike可能在同源基因發(fā)揮功能的過(guò)程中具有更大作用。

3.2 VwTyDC-like與VwTyDC基因表達(dá)的位置效應(yīng)

本研究對(duì)超級(jí)賓哥系列黃色帶花斑品種VwTyDC-like與VwTyDC基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，在有斑品種黃色帶花斑中，VwTyDC-like與VwTyDC在花發(fā)育S7 期的中心色斑區(qū)（a）的表達(dá)量顯著高于非色斑區(qū)（b）（圖5），這與前人的研究結(jié)果一致［13］。為探究VwTyDC-like與VwTyDC基因在有斑品種中心色斑區(qū)與非色斑區(qū)的表達(dá)差異是否源于位置效應(yīng)，本研究還檢測(cè)了在花瓣基部與邊緣都有色斑分布的品種紫羅蘭白雙色VwTyDC-like與VwTyDC基因的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 個(gè)基因在非色斑區(qū)的表達(dá)量雖然低于基部的中心色斑區(qū)，但高于邊緣色斑區(qū)（圖6）。

進(jìn)一步將白色與白色帶花斑品種的唇瓣劃分為5個(gè)區(qū)域進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在有斑品種和無(wú)斑品種中，VwTyDC-like與VwTyDC基因在唇瓣中的表達(dá)水平均由內(nèi)向外依次降低（圖7），說(shuō)明它們的表達(dá)存在明顯的位置效應(yīng)。為驗(yàn)證VwTyDC-like與VwTyDC基因表達(dá)的位置效應(yīng)在其他三色堇品種中是否同樣存在，分析了2個(gè)基因在三色堇不同系列不同色系品種中的表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同花色品種中，不論三色堇花瓣是否帶有花斑，二者在中心色斑區(qū)或其對(duì)應(yīng)區(qū)的表達(dá)量均顯著高于非色斑區(qū)或其對(duì)應(yīng)區(qū)（圖8），進(jìn)一步說(shuō)明VwTyDC-like與VwTyDC基因表達(dá)的位置效應(yīng)在三色堇品種中廣泛存在。至于VwTyDC-like與VwTyDC基因在花瓣上表達(dá)具有位置效應(yīng)的原因，仍有待進(jìn)一步研究。

3.3 VwTyDC-like 和VwTyDC 基因與三色堇色斑形成的可能關(guān)系

已有研究表明，植物花斑形成的本質(zhì)是花色素合成及調(diào)控基因在花器官（特別是花瓣或花萼）的特定區(qū)域差異表達(dá)的結(jié)果［25-27］。前人對(duì)擬南芥進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，TyDC的底物酪氨酸以一種劑量依賴(lài)型的方式有效誘導(dǎo)花青素的生物合成，主要通過(guò)上調(diào)花青素合成途徑中的下游基因如DFR、LODX和UF3GT的表達(dá)量以及MYB-bHLH-WD40轉(zhuǎn)錄復(fù)合體中PAP1/MYB75、PAP2、GL3、EGL3、TTG1基因的表達(dá)促進(jìn)花青素的積累［12］。Ma等［28］對(duì)茶葉品種Huabai 1的研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸與類(lèi)黃酮化合物的積累有關(guān)。Cui等［2］用酪氨酸處理三色堇花瓣非色斑區(qū)，發(fā)現(xiàn)非色斑區(qū)出現(xiàn)了條紋狀色斑，通過(guò)VIGS技術(shù)沉默VwTyDC基因后，三色堇花瓣的色斑顏色明顯變淺，這些結(jié)果說(shuō)明酪氨酸和VwTyDC基因確實(shí)與三色堇花青素的合成有關(guān)聯(lián)。本研究通過(guò)基因表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)VwTyDC-like與VwTyDC的表達(dá)模式與三色堇花瓣中花斑的分布可能沒(méi)有直接對(duì)應(yīng)關(guān)系。由此推測(cè)在三色堇花斑形成過(guò)程中，酪氨酸脫羧酶基因還需要和其他因子聯(lián)合發(fā)揮作用，而無(wú)斑品種缺乏這些相關(guān)因子。有研究發(fā)現(xiàn)，三色堇花斑由S和K兩個(gè)基因控制［29］，酪氨酸脫羧酶基因可能是其中一個(gè)基因，需要和另一個(gè)基因共同發(fā)揮作用。但是，另一個(gè)基因尚未被克隆，二者如何聯(lián)合發(fā)揮作用還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究從三色堇花瓣中克隆到一個(gè)VwTyDC-like基因，與VwTyDC同源性最高。VwTyDC-like與VwTyDC基因在三色堇不同組織器官、花發(fā)育不同時(shí)期、不同花色品種及其唇瓣不同區(qū)域表現(xiàn)出高度一致的表達(dá)模式，但VwTyDC-like基因的表達(dá)水平普遍高于VwTyDC。VwTyDC-like與VwTyDC基因的表達(dá)均具有組織特異性，在花瓣中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織器官，且在花發(fā)育后期（S7）表達(dá)量最高。無(wú)論三色堇花瓣是否帶有花斑，VwTyDC-like與VwTyDC基因的表達(dá)量均由花瓣基部向外逐漸降低。本研究結(jié)果表明VwTyDC-like與VwTyDC基因在花瓣中的表達(dá)具有明顯的位置效應(yīng)。