基于紅外光譜研究重離子輻射對(duì)牡丹幼苗生長(zhǎng)的誘變效應(yīng)

李秀麗 陳法志 陽(yáng)永學(xué) 陳志偉 陳 鎮(zhèn) 翟敬華 劉 忠 戢小梅

（武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林業(yè)果樹(shù)研究所，湖北 武漢 430075）

牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.）原產(chǎn)于中國(guó)，為芍藥科芍藥屬多年生落葉灌木，極具觀賞、藥用和油用價(jià)值［1］。目前我國(guó)用于種植推廣的油用牡丹是在產(chǎn)籽量和含油率上具有顯著優(yōu)勢(shì)的鳳丹牡丹（Paeonia ostiiFengdan）和紫斑牡丹（Paeonia rockii）2 個(gè)品種群［1］，主要在我國(guó)安徽、河南、山東、湖北等地區(qū)種植，表現(xiàn)出極廣泛的生態(tài)適應(yīng)性［2］。但油用牡丹存在低產(chǎn)和花色花型單調(diào)等產(chǎn)業(yè)問(wèn)題，限制了其應(yīng)用推廣。因此，培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的品種是油用牡丹產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。

當(dāng)前牡丹育種方式主要為自然雜交實(shí)生選種［3］、人工雜交育種［4］和誘變育種［5］。通過(guò)以上育種方式獲得牡丹新品種周期較長(zhǎng)且變異類(lèi)型有限，需要進(jìn)一步探索深化。重離子是一種新興輻射誘變?cè)矗哂袀髂芫€(xiàn)密度高、輻射穿透力強(qiáng)等特點(diǎn)，其單位劑量誘變效率較X 射線(xiàn)和γ 射線(xiàn)的誘變效率高出10 倍，是一種有效的植物種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良途徑［6-7］。目前，我國(guó)重離子輻射誘變育種主要集中在糧油作物及經(jīng)濟(jì)作物上［8-9］，但在牡丹育種領(lǐng)域還鮮有研究，本研究將利用中能重離子對(duì)鳳丹牡丹種子進(jìn)行輻射，以期獲得性狀改良的突變體，為牡丹育種開(kāi)辟新的途徑。

研究表明，不同的重離子種類(lèi)及其輻射劑量產(chǎn)生的誘變效應(yīng)也不同［10］，重離子可誘導(dǎo)基因位點(diǎn)變異［11］、關(guān)鍵靶分子DNA 鏈發(fā)生斷裂及交聯(lián)［12-13］。傅里葉變換紅外光譜（fourier transformation infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物材料，如種子、花粉、葉片等［14-15］。多數(shù)有機(jī)物和無(wú)機(jī)物的基頻吸收帶都出現(xiàn)在中紅外區(qū)（4 000～400 cm-1），F(xiàn)TIR 技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于利用中紅外區(qū)不同基團(tuán)的特征振動(dòng)峰鑒定物質(zhì)歸屬，包括碳水化合物、脂肪酸、氨基酸等生化物質(zhì)。同時(shí)，可進(jìn)一步進(jìn)行分子構(gòu)象分析，如蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而詳細(xì)分析不同條件下植物的生化組分變化規(guī)律［14-15］。此外，結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA），將FTIR 復(fù)雜的數(shù)據(jù)集進(jìn)行轉(zhuǎn)換和可視化，得到相應(yīng)的載荷圖，同時(shí)借助聚類(lèi)分析獲得更多更直接的相關(guān)信息［16］。鑒于此，本試驗(yàn)以鳳丹牡丹為研究對(duì)象，借助FTIR 技術(shù)分析重離子輻射對(duì)種子幼苗葉片生化組分的調(diào)控規(guī)律，并通過(guò)PCA 探索重離子輻射劑量效應(yīng)，以期從光譜學(xué)角度解析重離子輻射對(duì)鳳丹牡丹種子的誘變機(jī)制，為進(jìn)一步探索油用牡丹的資源創(chuàng)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗(yàn)所用的鳳丹牡丹種子為當(dāng)年采收于武漢市農(nóng)科院林業(yè)果樹(shù)研究所種質(zhì)資源圃，自然陰干后，存放于室內(nèi)陰涼干燥處，種子含水量8.92%，含油率22.73%，千粒重223.50 g，試驗(yàn)中所用葉片源自種子輻射后形成的一年生輻射苗。溴化鉀（分析純），購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PGJ-10/20-AS 品冠（超）純水機(jī)，武漢品冠儀器設(shè)備有限公司；DW-86L626（2013 款）超低溫保存箱，青島海爾集團(tuán)；DHG-9148A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SCIENTZ-10N 冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；VERTEX 70 紅外光譜儀，德國(guó)布魯克公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 輻射處理 借助中科院近代物理研究所的蘭州重離子加速器裝置（heavy ion research facility in Lanzhou，HIRFL），利用中能重離子束12C 對(duì)鳳丹牡丹（Paeonia ostiiFengdan）種子進(jìn)行輻射誘變處理，輻射劑量率20 Gy·min-1，根據(jù)處理的時(shí)間長(zhǎng)短來(lái)固定累積劑量：10、20、40、60、80、100、120、150、200 和300 Gy，共計(jì)10個(gè)劑量組和1個(gè)對(duì)照組（0 Gy）。

1.3.2 出苗率 取不同輻照劑量牡丹種子各100 粒，10月中旬沙藏后，每組選取30粒種子，每處理3組重復(fù)，播種于穴盤(pán)中，置于避雨棚，日溫14～16 ℃，夜溫5～7 ℃，濕度60%～70%，光照強(qiáng)度8 000～12 000 Lux，光照時(shí)間12 h·d-1，每4～5 d 用噴壺淋水，保證基質(zhì)濕潤(rùn)，培養(yǎng)至2 月下旬，統(tǒng)計(jì)出苗率。將芽苗移栽至圓筒狀生物降解性無(wú)紡布袋中，袋高16 cm，直徑12 cm，培養(yǎng)基質(zhì)泥炭、珍珠巖、蛭石、雞糞體積比為6∶1∶1∶2，日溫23～25 ℃，夜溫12～14 ℃，濕度60%～70%，光照強(qiáng)度8 000～12 000 Lux，光照時(shí)間12 h·d-1，并根據(jù)幼苗生長(zhǎng)情況統(tǒng)一進(jìn)行澆水、施肥、除草以及病蟲(chóng)害防治管理。

1.3.3 形態(tài)指標(biāo)測(cè)量 在5 月份牡丹生長(zhǎng)期，利用直尺測(cè)定不同12C重離子輻射劑量的一年生實(shí)生苗株高、葉片長(zhǎng)度、寬度，每處理測(cè)定3 株，每株測(cè)定3 次，取其平均值，并計(jì)算葉片長(zhǎng)寬比。

1.3.4 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）表征 分別取不同12C重離子輻射劑量的鳳丹牡丹葉片，每處理3 個(gè)重復(fù)，將葉片先后用清水和去離子水（＞18 MΩ）清洗，用液氮研磨成粉末后，真空冷凍干燥12 h。取1～2 mg干燥的樣品與200 mg干燥的溴化鉀置于瑪瑙研缽中，研成均一細(xì)粉，并取少量壓片，利用紅外光譜儀，以空氣為參比，選用4 cm-1的分辨率，掃描128次；波數(shù)范圍為400～4 000 cm-1［15，17］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)FTIR 原始數(shù)據(jù)作圖，計(jì)算峰值強(qiáng)度比值：RⅠ（A 2 951 cm-1/A 2 858 cm-1），RⅡ（A 1 547 cm-1/A 1 656 cm-1），RⅢ（A 1 547 cm-1/A 3 296 cm-1），RⅣ（A 1 083 cm-1/A 1 547 cm-1），RⅤ（A 1 741 cm-1/A 1 458 cm-1），RⅥ（A 1 741 cm-1/A 1 547 cm-1），R Ⅶ（A 1 458 cm-1/A 1 547 cm-1）。并對(duì)氨基I 區(qū)域（1 700～1 600 cm-1）的曲線(xiàn)進(jìn)行高斯單峰正態(tài)分布的曲線(xiàn)擬合，再依據(jù)不同蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的特征峰位，對(duì)擬合曲線(xiàn)進(jìn)行高斯多峰擬合，從分峰擬合結(jié)果中得到每種蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)所對(duì)應(yīng)的峰面積，依據(jù)各峰峰面積借助Excel 2010 計(jì)算蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)所占的比例，利用Origin 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件作圖。借助SPSS 22對(duì)FTIR 圖譜進(jìn)行主成分和載荷圖分析，并進(jìn)一步使用SPSS 22 對(duì)不同12C 重離子輻射劑量下的牡丹葉片F(xiàn)TIR 圖譜進(jìn)行聚類(lèi)分析，聚類(lèi)方法選擇組間連接法，區(qū)間選擇歐式距離（euclidean distance）。此外，研究中所需要的其他數(shù)據(jù)借助Excel 2010 和Origin 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重離子輻射對(duì)鳳丹牡丹出苗率及一年生苗主要農(nóng)藝性狀的影響

與對(duì)照相比，經(jīng)12C6+重離子輻射后，鳳丹牡丹的出苗率顯著降低，當(dāng)輻射劑量為10 Gy 時(shí)，出苗率從90.00%下降至57.78%，當(dāng)輻射劑量增大至20 Gy 時(shí)，出苗率下降至34.44%，當(dāng)輻射劑量大于20 Gy 時(shí)，出苗率僅為10.00%左右，但40～300 Gy 劑量下的出苗率并無(wú)顯著性差異（表1）。進(jìn)一步借助SPSS 22 對(duì)12C6+重離子輻射劑量和種子出苗率進(jìn)行Probit回歸分析，發(fā)現(xiàn)牡丹種子的半致死劑量為14.47 Gy，介于10～20 Gy之間。不同12C6+重離子輻射劑量對(duì)株高的影響也不同（表1），與對(duì)照相比，重離子輻射抑制了牡丹生長(zhǎng)，尤其當(dāng)輻射劑量為80 和100 Gy 時(shí)，株高顯著下降，分別從11.10 cm 下降至6.68 和5.20 cm。此外，重離子輻射誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生畸形（圖1），如葉裂數(shù)增多、葉裂深度增加、葉片顏色變淺、厚度變薄、發(fā)生皺縮等現(xiàn)象，尤其是當(dāng)輻射劑量在80 和120 Gy 時(shí)，葉片皺縮現(xiàn)象明顯。對(duì)于與葉片形狀相關(guān)的葉長(zhǎng)、葉寬而言，輻射抑制了葉片長(zhǎng)和寬的正常生長(zhǎng)，對(duì)葉片長(zhǎng)寬比的誘導(dǎo)效果不顯著（表1）。當(dāng)輻射劑量為80 Gy 時(shí)，重離子輻射顯著抑制了葉寬的形成；當(dāng)輻射劑量為100 Gy 時(shí)，葉片的長(zhǎng)度和寬度均受到顯著抑制。

表1 不同12C6+重離子輻射劑量對(duì)鳳丹牡丹表型的影響Table 1 Effects of different doses of 12C6+ heavy ion radiation on the phenotype of Fengdan peony

圖1 不同12C6+重離子輻射劑量對(duì)葉片畸形程度的影響Fig.1 The degree of leaf deformity induced by different doses of 12C6+ heavy ion radiation

2.2 FTIR光譜特征

圖2為不同12C6+重離子輻射劑量處理后鳳丹牡丹葉片的FTIR 圖譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同輻射劑量的葉片存在12 個(gè)典型的共有峰，具體如下：在3 428 cm-1處存在強(qiáng)且寬的振動(dòng)峰，該峰峰形不對(duì)稱(chēng)，表明該區(qū)域存在O—H或N—H伸縮振動(dòng)的重疊，說(shuō)明葉片中含有類(lèi)胡蘿卜素、酰胺和碳水化合物等物質(zhì)［18］。2 921和2 846 cm-1分別為CH2反對(duì)稱(chēng)和對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，主要來(lái)源于脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、碳水化合物等生化物質(zhì)的CH2基團(tuán)［18］。1 720 cm-1處為酯類(lèi)物質(zhì)的C=O 伸縮振動(dòng)，與對(duì)照相比，當(dāng)輻射劑量在40～80 Gy之間時(shí)，峰強(qiáng)明顯減弱，其他輻射劑量時(shí)，峰強(qiáng)變化不明顯，甚至在10 Gy時(shí)，峰強(qiáng)出現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)。與輻射對(duì)1 720 cm-1處振動(dòng)峰峰強(qiáng)影響規(guī)律相似的是位于1 212 cm-1處的振動(dòng)峰，該峰主要源于木質(zhì)素中芳香C—H面內(nèi)變形振動(dòng)［19］。1 629 cm-1處的強(qiáng)振動(dòng)峰來(lái)源于氨基Ⅰ中C=O和C—N 伸縮振動(dòng)［20］，該峰峰位和峰強(qiáng)在重離子輻射下發(fā)生了較大變化，當(dāng)輻射劑量為10和60 Gy時(shí)，峰位向低波數(shù)移動(dòng)至1 617 cm-1，當(dāng)輻射劑量為80 Gy時(shí)，峰位向高波數(shù)移動(dòng)至1 645 cm-1，輻射劑量為10和200 Gy時(shí)，峰強(qiáng)明顯變?nèi)?。? 636 cm-1附近的1 545 cm-1處存在一個(gè)振動(dòng)強(qiáng)度較弱的肩峰，主要是由氨基Ⅱ中C—N伸縮振動(dòng)引起的［21］，在10、200和300 Gy時(shí)峰強(qiáng)增強(qiáng)，在40～60 Gy時(shí)峰強(qiáng)減弱，幾近消失。1 453 cm-1為CH3和CH2反對(duì)稱(chēng)變形彎曲振動(dòng)，主要來(lái)源于蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、木質(zhì)素等物質(zhì)［22］。1 395 cm-1為脂肪和氨基酸中COO-對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)［23］，1 320 cm-1為氨基Ⅲ中C—N伸縮振動(dòng)和C—N—H面內(nèi)彎曲振動(dòng)［24］，當(dāng)輻射劑量為10、200 Gy時(shí)，1 395 cm-1處的尖峰變成了1 320 cm-1處的肩峰。1 052 cm-1處振動(dòng)峰分別由C—O伸縮振動(dòng)，C—O—C對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，C—H變形振動(dòng)引起，主要來(lái)源于纖維素、無(wú)定形纖維素、半纖維素［19］，當(dāng)輻射劑量為20～60 Gy 時(shí)，該峰峰強(qiáng)減弱。這些特征峰的波數(shù)、振動(dòng)模式和歸屬詳見(jiàn)表2。

圖2 不同12C重離子輻射劑量下葉片F(xiàn)TIR圖譜的比較Fig.2 Comparative FTIR spectra of leaves induced by different 12C heavy ion radiation doses

表2 FTIR圖譜的主要峰位及其歸屬Table 2 Wavenumber and assignment of the main peaks in the FTIR spectrum

2.3 FTIR的峰值強(qiáng)度比值變化規(guī)律

為了深入分析不同12C6+重離子輻射劑量處理后葉片生化組分的變化趨勢(shì)，進(jìn)一步對(duì)FTIR 圖譜中7 種峰值強(qiáng)度的比值進(jìn)行了分析（圖3）。RⅠ表示蛋白質(zhì)甲基與亞甲基吸收強(qiáng)度之比，與對(duì)照相比，12C6+重離子輻射使鳳丹牡丹葉片RⅠ比值升高，表明重離子輻射促進(jìn)了葉片蛋白質(zhì)甲基的形成。RⅡ值的變化由總蛋白含量的變化引起，RⅢ通常用來(lái)指示葉片中氨基Ⅱ和氨基A蛋白的含量。12C6+重離子輻射后，鳳丹牡丹葉片中RⅡ和RⅢ呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)：與對(duì)照相比，輻射降低了RⅡ和RⅢ值，當(dāng)輻射劑量介于0～40 Gy 之間時(shí)，RⅡ和RⅢ隨輻射劑量的增加迅速降低，輻射劑量持續(xù)增加至300 Gy時(shí)，RⅡ和RⅢ出現(xiàn)短暫升高后緩慢下降并逐漸平穩(wěn)的趨勢(shì)。結(jié)果表明：重離子輻射抑制了葉片中氨基Ⅱ和氨基A 蛋白的形成，并抑制了總蛋白的合成。RⅣ表示糖蛋白的變異性，從結(jié)果可以看出重離子輻射使葉片中糖蛋白的變異度增加，即當(dāng)輻射劑量為10 Gy時(shí)，RⅣ顯著增加，隨后出現(xiàn)急劇下降和緩慢下降趨勢(shì)，當(dāng)輻射劑量為80～200 Gy時(shí)，RⅣ呈現(xiàn)逐漸增加趨勢(shì)，并在200 Gy 時(shí)達(dá)到最高值，300 Gy 時(shí)，RⅣ有所下降，但也顯著高于其他的輻射劑量。RⅤ的變化歸因于脂類(lèi)的氧化程度，當(dāng)輻射劑量為0～40 Gy 時(shí)，RⅤ值隨輻射劑量的增加而增加，之后逐漸下降并趨于平緩，總體而言，重離子輻射促進(jìn)了脂類(lèi)氧化程度的增加。RⅥ和RⅦ的變化趨勢(shì)相同，呈現(xiàn)出先增加后減少再緩慢增加直至平穩(wěn)的趨勢(shì)，表明鳳丹牡丹受重離子輻射后，尤其在10 和200 Gy 時(shí)，葉片出現(xiàn)脂類(lèi)降解現(xiàn)象，該現(xiàn)象由羰基形成所致。

圖3 不同波數(shù)峰值強(qiáng)度的比值Fig.3 Ratio of peak intensities of the bands at different wavenumbers

2.4 FTIR的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要影響FTIR 中氨基Ⅰ區(qū)域（1 700～1 600 cm-1）圖譜的形貌，每種二級(jí)結(jié)構(gòu)分別對(duì)應(yīng)不同的FTIR 峰位：β-折疊（β-sheet，β）+側(cè)鏈（side chain，S）+果膠（pectin，P）為1 615 cm-1，β 為1 635 cm-1，無(wú)規(guī)卷曲（random coil，R）為1 648 cm-1，α-螺旋（α-helix，α）為1 654 cm-1，環(huán)（loop，L）+轉(zhuǎn)角（T，turn）為1 670 cm-1［14-15］。根據(jù)上述蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的峰位對(duì)1 600～1 700 cm-1范圍的FTIR 圖譜進(jìn)行高斯多峰擬合，結(jié)果如圖4 所示。重離子輻射后的β+S+P 含量小于對(duì)照組，呈現(xiàn)先下降后上升再逐漸平穩(wěn)的變化規(guī)律。其他4 種蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量均表現(xiàn)為劑量組高于對(duì)照組。與對(duì)照相比，當(dāng)輻射劑量為100 和200 Gy 時(shí)，顯著促進(jìn)了蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)β 的形成（圖4-A）；當(dāng)輻射劑量為10 Gy時(shí)，R含量顯著增加（圖4-A）；當(dāng)輻射劑量為10、20、120 和200 Gy 時(shí)，α 結(jié)構(gòu)均顯著增加（圖4-B）；重離子輻射顯著提高了L+T 的形成，但不同重離子輻射劑量下L+T 含量無(wú)顯著性差異（圖4-B）。

圖4 基于高斯多峰擬合分析不同12C6+重離子輻射劑量下葉片蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的百分比Fig.4 The percentage of protein secondary structure of leaves induced by different doses of 12C6+ heavy ion radiation based on multi-peaks Guassian fitting

2.5 FTIR的PCA分析

進(jìn)一步將FTIR 譜圖分為4 個(gè)波束范圍，分別以降維方式對(duì)其進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖5所示。在4個(gè)波數(shù)范圍內(nèi)，提取的兩個(gè)主成分均包含了總方差99%以上的光譜信息，且第1主成分占總方差的99%左右，同一處理的3 個(gè)重復(fù)在第一組成分中能夠較好地歸類(lèi)在一起，不同處理間存在分離和聚集現(xiàn)象。因此，本研究重點(diǎn)關(guān)注處理組和對(duì)照組在第1 主成分中的信息。主成分載荷圖能夠顯示不同變量對(duì)主成分的貢獻(xiàn)大小，從而獲取更多樣品的差異信息（圖6）。結(jié)合圖5和圖6可以看出，在3 050～2 800 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)，200 Gy輻射劑量處理的葉片得分較高；20、40 和60 Gy 處理的葉片得分較低，其他輻射劑量與對(duì)照組的得分相似，均得分居中（圖5-A）。第1 主成分主要捕獲了2 923 cm-1處峰值信息，表明該波數(shù)范圍內(nèi)樣品間的差異主要來(lái)自于脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和碳水化合物等含量的差異（圖6-A）。在其他3 個(gè)波數(shù)范圍1 700～1 600 cm-1（氨基Ⅰ區(qū)域）、1 600～1 300 cm-1和1 250～750 cm-1，對(duì)照組與劑量組之間也存在樣品的聚集與分離現(xiàn)象，20、40 和60 Gy 輻射后的樣品得分較高，200 Gy輻射后的樣品得分較低；其他輻射劑量與對(duì)照組的樣品得分居中（圖6-B～D）。氨基Ⅰ區(qū)域中，1 649 cm-1附近的吸收峰對(duì)第1 主成分的貢獻(xiàn)較大，氨基Ⅰ區(qū)域的差異主要來(lái)源于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲。1 600～1 300 cm-1波束范圍內(nèi)，1 488、1 362 和1 315 cm-1附近的吸收峰對(duì)第1 主成分的貢獻(xiàn)較大，主要是來(lái)自蛋白質(zhì)、脂肪酸和氨基Ⅲ等化合物。1 250～750 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)，第1 主成分主要包含了1 203、1 019和777 cm-1附近的吸收峰，其化學(xué)成分主要為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等碳水化合物。綜上所述，樣品間第1主成分的差異性主要源于碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪等物質(zhì)成分的含量和結(jié)構(gòu)，能反映鳳丹牡丹紅外光譜的主要信息。

圖5 不同12C6+ 重離子輻射劑量下葉片F(xiàn)TIR圖譜的主成分分析Fig.5 PCA analysis of FTIR spectra of leaves induced by different doses of 12C6+ heavy ion radiation

圖6 PC1（實(shí)線(xiàn)）和PC2（虛線(xiàn)）載荷圖Fig.6 Plot of loadings corresponding to PC1 （solid line） and PC2 （dotted line）

2.6 FTIR的聚類(lèi)分析

對(duì)鳳丹牡丹葉片4 個(gè)波數(shù)范圍的光譜進(jìn)行聚類(lèi)分析，將樣品進(jìn)行有效分離，并用樹(shù)形圖直觀顯示樣品間的聚類(lèi)情況（圖7）。當(dāng)距離為5 時(shí)，在3 050～2 800 cm-1（脂質(zhì)區(qū)域）、1 600～1 300 cm-1和1 250～750 cm-1（多糖區(qū)域）波數(shù)范圍內(nèi)，不同12C6+重離子輻射劑量的葉片可以分為3個(gè)表征群：0、10、80、100、120、150、300 Gy聚為一類(lèi)，20、40、60 Gy 聚為一類(lèi)，200 Gy 單獨(dú)聚為一類(lèi)（圖7-A、C、D）；在1 700～1 600 cm-1（氨基Ⅰ區(qū)域）波數(shù)范圍，不同輻射劑量的葉片可聚為3 類(lèi)：0、80、100、120、150、300 Gy聚為一類(lèi)，10、20、40、60 Gy聚為一類(lèi)，200 Gy 單獨(dú)聚為一類(lèi)（圖7-B），聚類(lèi)結(jié)果與主成分分析結(jié)果相符?？梢?jiàn)，與對(duì)照相比，80、100、120、150、300 Gy輻射下鳳丹牡丹葉片的化學(xué)成分變化不大，10、20、40、60 Gy 輻射劑量下葉片的化學(xué)成分相似但明顯不同于對(duì)照組，而200 Gy 輻射劑量下葉片的化學(xué)物質(zhì)的變化較大，出現(xiàn)單獨(dú)聚類(lèi)現(xiàn)象。

圖7 不同12C6+重離子輻射劑量下葉片F(xiàn)TIR圖譜的聚類(lèi)分析Fig.7 Cluster analysis of FTIR spectra of leaves induced by different doses of 12C6+ heavy ion radiation

3 討論

3.1 重離子輻射對(duì)鳳丹牡丹表型的誘變效應(yīng)

前人研究表明，誘變效應(yīng)存在物種特異性［9，27］，重離子輻射可抑制黃花蒿和玉米的出苗率［6，10］，有助于培育矮化、耐密型品種［6］。而本研究發(fā)現(xiàn)12C6+重離子對(duì)鳳丹牡丹的輻射效應(yīng)較為復(fù)雜，主要表現(xiàn)為損傷和抑制效應(yīng)：重離子輻射能顯著抑制出苗率，抑制株高和葉片的正常生長(zhǎng)，造成葉片皺縮畸形。當(dāng)輻射劑量介于10～20 Gy之間時(shí)，對(duì)牡丹幼苗的抑制效應(yīng)較小。

3.2 重離子輻射對(duì)葉片生化組分及其形成機(jī)制的影響

重離子輻射也影響著植物體內(nèi)主要生化成分的組成與含量［28-29］。FTIR 技術(shù)能克服傳統(tǒng)化學(xué)測(cè)試的復(fù)雜性，檢測(cè)不同環(huán)境下植物葉片生化組分的結(jié)構(gòu)和組成，明確樣品間生物大分子的差異［15-16］。本研究首次借助FTIR 技術(shù)，分析了重離子輻射對(duì)鳳丹牡丹葉片主要化學(xué)成分的影響規(guī)律。

首先，重離子輻射對(duì)葉片細(xì)胞壁多糖和木質(zhì)素存在正、負(fù)雙重誘導(dǎo)效應(yīng)。1 052 cm-1代表纖維素、無(wú)定形纖維素和半纖維素的振動(dòng)［19］，1 212 cm-1為木質(zhì)素的振動(dòng)峰［19］。當(dāng)輻射劑量為10 Gy 時(shí)，這兩處峰峰強(qiáng)均增強(qiáng)，40～150 Gy 時(shí)，峰強(qiáng)均減弱。研究表明重離子輻射會(huì)破壞纖維素Ⅰ的非結(jié)晶區(qū)及結(jié)晶區(qū)Ⅰα到Ⅰβ晶相轉(zhuǎn)變時(shí)的超微結(jié)構(gòu)，從而抑制纖維素的有序組裝［30］。重離子輻射促進(jìn)了糖蛋白變異（RⅣ），糖蛋白能夠調(diào)控細(xì)胞壁多糖的有序沉積，從而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化，影響葉片形態(tài)［31］。當(dāng)輻射劑量為40～200 Gy 時(shí)，葉片出現(xiàn)不同程度的畸形，極有可能由于重離子輻射誘導(dǎo)糖蛋白發(fā)生變異，抑制了細(xì)胞壁多糖的有序沉積，從而調(diào)控牡丹幼苗葉片的形態(tài)特征。

其次，重離子輻射調(diào)控了葉片上蛋白質(zhì)及其二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。1 395 cm-1處為氨基酸的振動(dòng)峰［23］，該峰對(duì)低高劑量輻射較為敏感。氨基Ⅰ的振動(dòng)峰在1 629 cm-1附近［20］，常用來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)［17］。該峰在10、80 和100 Gy 時(shí)，峰位移動(dòng)，峰型發(fā)生變化，且在10 和200 Gy 時(shí)，峰強(qiáng)減弱。1 545 cm-1處為氨基Ⅱ的振動(dòng)峰［21-22］，該峰在40、60和200 Gy時(shí)峰強(qiáng)減弱，在低劑量10 Gy 和高劑量200 Gy 時(shí)峰強(qiáng)增強(qiáng)，表明重離子輻射對(duì)氨基Ⅱ存在正、負(fù)雙重誘導(dǎo)效應(yīng)。氨基Ⅱ與氨基Ⅰ類(lèi)似，其振動(dòng)峰的峰型和強(qiáng)度取決于蛋白質(zhì)的骨架結(jié)構(gòu)。1 320 cm-1為氨基Ⅲ的振動(dòng)峰［32］，可用于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析［24］。當(dāng)輻射劑量為10、200 Gy 時(shí)，該峰峰強(qiáng)變?nèi)?。由此推測(cè)，重離子輻射能改變鳳丹牡丹幼苗葉片上蛋白質(zhì)主鏈分子構(gòu)象，從而調(diào)控蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。有研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋與蛋白質(zhì)-水之間氫鍵的多少有關(guān)，β-折疊與植物體內(nèi)ATP 的存在形式有關(guān)，當(dāng)ATP 為游離狀態(tài)時(shí)，β-折疊含量較高，當(dāng)ATP被修飾后，使β-折疊含量降低［14］。本研究發(fā)現(xiàn)重離子輻射促進(jìn)了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-折疊的形成，可見(jiàn)重離子輻射能增加蛋白質(zhì)與水的結(jié)合力，促進(jìn)ATP以游離態(tài)存在，可為植物生長(zhǎng)發(fā)育提供動(dòng)力。有研究表明蛋白質(zhì)的生物活性往往由氨基酸側(cè)鏈所決定［33］，氨基Ⅲ振動(dòng)峰除與蛋白質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)存在相關(guān)性外，與側(cè)鏈結(jié)構(gòu)也存在相關(guān)性［34］。本研究發(fā)現(xiàn)重離子輻射促進(jìn)了蛋白質(zhì)側(cè)鏈上甲基的形成（RⅠ）。蛋白質(zhì)側(cè)鏈的甲基化與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA 或蛋白質(zhì)-RNA的相互作用相關(guān)，影響著蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及亞細(xì)胞定位［35］。由此可見(jiàn)，重離子輻射對(duì)牡丹幼苗葉片上蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能具有重要調(diào)控作用。

此外，1 395 cm-1處也代表脂肪酸中COO-對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)［23］，結(jié)合吸光度比值分析發(fā)現(xiàn)，重離子輻射促進(jìn)了代表脂質(zhì)氧化程度的RⅤ、RⅥ和RⅦ值的增加。由此推測(cè)，重離子輻射通過(guò)促進(jìn)牡丹幼苗葉片脂肪的氧化降解，從而抑制葉片上脂肪的積累，調(diào)控脂肪酸代謝。本研究主要探討了重離子輻射對(duì)牡丹M1 代幼苗的誘變效應(yīng)，下一步將繼續(xù)研究重離子輻射對(duì)M1 代植株開(kāi)花結(jié)果特性的影響，同時(shí)對(duì)M2 代植株的相關(guān)性狀進(jìn)行測(cè)定，從可遺傳變異角度深入分析重離子輻射對(duì)牡丹的誘變效應(yīng)及其作用機(jī)制。

4 結(jié)論

12C6+重離子輻射對(duì)鳳丹牡丹幼苗生長(zhǎng)和生化組分特性有重要影響，主要表現(xiàn)為損傷和抑制效應(yīng)。半致死劑量介于10～20 Gy，該劑量范圍對(duì)葉片形態(tài)的影響相對(duì)較?。荒艽龠M(jìn)細(xì)胞壁多糖的有序組裝，調(diào)控蛋白質(zhì)的骨架結(jié)構(gòu)及側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，有助于維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能；并且樣品能與對(duì)照組進(jìn)行有效分離。因此，推薦10～20 Gy作為牡丹12C6+重離子輻射育種的適宜誘變劑量區(qū)間。