錦鯉皰疹病毒胸苷激酶基因的生物信息學(xué)分析

陳 莉,周廣彪,鄭耿東,溫爾英,陳文婉,吳松浩,利光輝*

(1.汕頭海關(guān)技術(shù)中心,廣東汕頭 515041;2.汕頭海關(guān)技術(shù)中心/汕頭大學(xué)理學(xué)院水產(chǎn)品聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,廣東汕頭 515041;3.汕頭海關(guān)動(dòng)植處,廣東汕頭 515057)

錦鯉皰疹病毒(Koi Herpesvirus,KHV)又稱鯉魚間質(zhì)性腎炎及鰓壞死性病毒(carp interstitial nephritis and necrosis virus,CNGV),被歸類為皰疹病毒目(Herpesvirales)皰疹病毒科(Herpesviridae)鯉皰疹病毒屬(CyprinidHerpesviridae),該病原被我國(guó)列入動(dòng)物疫病病種名錄中的二類疾病,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(WOAH)也將其列為必須申報(bào)的動(dòng)物疫病之一[1-4]。錦鯉皰疹病毒是一種dsDNA皰疹病毒的病原體,它是由31種病毒粒子多肽和8種糖基化蛋白組成,成熟的病毒粒子包含一個(gè)松散的包膜,病毒粒子總直徑為170～230 nm,具有一個(gè)線性雙鏈DNA基因組[5-8]。Aoki等[9]描述了錦鯉皰疹病毒的全基因組序列,并鑒定了156個(gè)獨(dú)特的蛋白質(zhì)編碼基因,為后續(xù)科學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。魚類感染錦鯉皰疹病毒,最明顯的特征之一是鰓弓內(nèi)血管充血,鰓耙變細(xì),其次該病易發(fā)生在腎,腎小管周圍出現(xiàn)炎性浸潤(rùn),并伴隨血管充血;發(fā)病中后期,病魚行動(dòng)緩慢,魚眼嚴(yán)重凹陷,一般情況下,錦鯉患病死亡率高達(dá)90%～100%,因此應(yīng)引起各國(guó)高度重視[10-14]。有研究表明,皰疹病毒增殖的主要毒力基因是胸苷激酶基因[15],胸苷激酶基因編碼胸苷激酶,該酶可將核苷類似物無(wú)毒性抗病毒物丙氧鳥苷磷酸化為一磷酸化形式,繼而在細(xì)胞的一磷酸鳥苷激酶或細(xì)胞內(nèi)其他激酶的作用下形成二磷酸化產(chǎn)物和三磷酸化產(chǎn)物,三磷酸化產(chǎn)物能整合到細(xì)胞DNA上,抑制DNA聚合酶的活性,從而抑制蛋白的合成,阻斷DNA的合成,使分裂細(xì)胞被殺傷。錦鯉皰疹病毒中ORF140基因編碼胸苷激酶,是致病基因中的一種,在病毒吸附、穿入、復(fù)制合成及細(xì)胞中發(fā)揮重要作用[16]。

生物信息學(xué)(Bioinformatics)是隨著人類基因組計(jì)劃發(fā)展而不斷發(fā)展的一門聯(lián)合計(jì)算機(jī)和信息科學(xué)中的技術(shù)、方法[17-18]。生物信息學(xué)在分子生物學(xué)領(lǐng)域取得重大進(jìn)步,加上基因組技術(shù)的進(jìn)步,突顯生物信息學(xué)的重要性。隨著一代測(cè)序、二代測(cè)序及三代測(cè)序的快速發(fā)展,測(cè)序成本不斷降低,促使更全面、更深入地對(duì)基因組進(jìn)行分析。目前基于生物信息學(xué)的方法多種多樣,筆者通過(guò)相關(guān)軟件對(duì)錦鯉皰疹病毒胸苷激酶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,以期為錦鯉皰疹病毒的分子生物學(xué)研究提供方向,為下一步研究的開展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 序列信息錦鯉皰疹病毒(KHV)登錄號(hào):DQ177346.1,可由登錄號(hào)在NCBI中查閱完整基因序列。胸苷激酶基因(登錄號(hào):AB375391)是編碼其中一段以ATG為起始密碼子,在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB375391)中可以查看TK基因的完整基因序列。

1.2 方法

1.2.1BioXM基因序列的組成分析。BioXM是進(jìn)行DNA序列的常規(guī)分析,包括ORF查找、序列格式化、翻譯、限制酶切位點(diǎn)分析等功能,通過(guò)對(duì)基因組分析,確定序列的基本信息。利用NCBI數(shù)據(jù)網(wǎng)站獲得TK基因的序列,以FASTA格式保存至相關(guān)文件夾。將TK基因序列運(yùn)行至BioXM軟件中,獲得核酸序列的組成分析。

1.2.2TK蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析、親/疏水性、信號(hào)肽及跨膜區(qū)預(yù)測(cè)。根據(jù)TK基因登錄號(hào),從NCBI中獲得的TK基因序列,利用NCBI ORF Finder軟件尋找序列中潛在開放閱讀框(open reading fraction,ORF),并獲得TK基因的氨基酸序列。通過(guò)獲取的氨基酸序列和在線軟件Expasy進(jìn)行蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析,將獲得蛋白質(zhì)的一般信息;使用在線分析軟件ProtScale(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam)預(yù)測(cè)TK蛋白的親水性和疏水性;利用在線分析軟件TMHMM server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)和SignalP sever(http://www.cbs.dtu.dk/services/signalP)預(yù)測(cè)TK蛋白的信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu),獲得相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.2.3TK蛋白結(jié)構(gòu)域分析。利用在線軟件NCBI-CDD分析TK蛋白的結(jié)構(gòu)域,并結(jié)合HMMER和SMART對(duì)TK蛋白同時(shí)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.4TK蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。利用SOPMA軟件對(duì)已獲得的氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的綜合分析。根據(jù)SWISS-MODEL軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),為豐富TK基因的蛋白數(shù)據(jù)提供支持。

1.2.5利用MEGA構(gòu)建蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹。從數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得不同病毒中TK蛋白的氨基酸系列,利用MEGA6軟件的NJ法構(gòu)建蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹,分析親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 TK基因序列的組成根據(jù)TK基因登錄號(hào),從NCBI數(shù)據(jù)網(wǎng)站獲得TK基因序列,將序列輸入BioXM軟件,可知TK基因序列長(zhǎng)度224 bp,其中腺嘌呤核苷酸(A)共24個(gè),占10.71%;鳥嘌呤核苷酸(G)共15個(gè),占總核苷酸序列6.70%;胞嘧啶核苷酸(C)共8個(gè),占總核苷酸序列3.57%;胸腺嘧啶核苷酸(T)共9個(gè),占總核苷酸序列4.02%;其中腺嘌呤核苷酸和胸腺嘧啶占14.73%,較鳥嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸(10.27%)少4.46%,TK基因分子量為17 378 Da。

2.2 TK蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析TK基因共編碼224個(gè)氨基酸,編碼蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為24 623.70 Da,蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)值為6.31,其中氨基酸的組成見表1。該蛋白中含量前4的為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和脯氨酸,占比分別為10.7%、9.4%、8.0%和8.0%。酸性氨基酸總數(shù)為(Asp+Glu)23,堿性氨基酸總數(shù)為(Arg+Lys)22,分子式為C1096H1733N289O316S19,原子總數(shù)為3 453。由TK基因編碼的蛋白質(zhì)不含任何色氨酸殘基,表明這可能導(dǎo)致計(jì)算的消光系數(shù)約有10%以上的誤差。不穩(wěn)定系數(shù)為44.11,其中不穩(wěn)定系數(shù)大于40,則表示該蛋白不穩(wěn)定;脂肪指數(shù)為84.91,總平均親水性為0.030。通過(guò)ProtScale軟件分析結(jié)果可知,縱坐標(biāo)越大,蛋白疏水性就越強(qiáng)。如圖1所示,在氨基酸序列第45個(gè)位點(diǎn),親水性最高;在第5個(gè)位點(diǎn),TK蛋白的疏水性得分最高,綜合理化性質(zhì)分析,說(shuō)明該蛋白為親水蛋白。SignaIP是一個(gè)信號(hào)肽預(yù)測(cè)服務(wù)器,它的功能是預(yù)測(cè)給定的氨基酸序列中是否存在潛在的信號(hào)肽剪切位點(diǎn)及其所在位置。如圖2所示,每個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)1個(gè)S值,信號(hào)肽區(qū)域的S值較高;同時(shí)每個(gè)氨基酸有1個(gè)C值,在剪切位點(diǎn)的C值是最高的。綜合考慮S值、C值、Y值,該蛋白不含有信號(hào)肽。蛋白結(jié)構(gòu)決定蛋白功能,利用生物學(xué)軟件工具TMHMM Server來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜螺旋(圖3)。由TMHMM分析結(jié)果可知,TK蛋白長(zhǎng)度為224,該蛋白不存在跨膜螺旋,同時(shí)跨膜螺旋氨基酸殘基數(shù)量的期望值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于18,該蛋白不存在跨膜螺旋和信號(hào)肽,且位于膜外。

表1 TK基因編碼蛋白質(zhì)數(shù)量及百分比

圖1 TK蛋白親水性、疏水性預(yù)測(cè)Fig.1 Predictive analysis of hydrophilicity and hydrophobicity of TK protein

圖2 TK蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.2 Predictive analysis of TK protein signal peptide

注:橫坐標(biāo)表示提交蛋白序列對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基序號(hào),縱坐標(biāo)表示為橫軸上每個(gè)氨基酸位于膜內(nèi)側(cè)、膜外側(cè)和跨膜螺旋的概率值。圖中藍(lán)色線段是位于膜內(nèi)的結(jié)構(gòu),紅色線段是位于膜外的結(jié)構(gòu)。Notes:The horizontal coordinates indicate the amino acid residue numbers corresponding to the submitted protein sequences,and the vertical coordinates are the probability values of each amino acid located in the inner membrane,outer membrane and transmembrane helix on the horizontal axis.The blue line segment in the figure is the structure located inside the membrane,and the red line segment is the structure located outside the membrane.

2.3 TK蛋白結(jié)構(gòu)域分析根據(jù)NCBI-CDD進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析,結(jié)果可知,該蛋白有一個(gè)TK超家族結(jié)構(gòu)域,在序列中的位置是4-185(圖4a)氨基酸殘基區(qū)域,圖4b則為該蛋白結(jié)構(gòu)域區(qū)間;其中E值越小隨機(jī)性越低,結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)中越顯著。HMMER(圖4c和4d)和SMART(圖4e)結(jié)果表明,TK蛋白結(jié)構(gòu)域位于2-175氨基酸殘基區(qū)域。綜合分析可知,TK蛋白結(jié)構(gòu)域位于2-175氨基酸殘基區(qū)域的可能性較大。

注:a、b.NCBI-CDD蛋白結(jié)構(gòu)域分析及蛋白結(jié)構(gòu)域區(qū)間;c、d.HMMER蛋白結(jié)構(gòu)域分析;e.SMART蛋白結(jié)構(gòu)域分析。Note:a,b.NCBI-CDD protein structural domain analysis and protein structural domain interval;c,d.HMMER protein structural domain analysis;e.SMART protein structural domain analysis.

2.4 TK蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)通常被認(rèn)為是蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的第1步,二級(jí)結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)分析、酶活性殘基分析、蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等方面都是不可缺少的。SOPMA在線軟件對(duì)TK蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果如圖5所示,在TK蛋白編碼的224個(gè)氨基酸中α-螺旋共72個(gè),占32.14%;β-轉(zhuǎn)角17個(gè),占7.59%;無(wú)規(guī)則卷曲86個(gè),占38.39%;延伸鏈49個(gè),占比21.88%。

注:藍(lán)色.α-螺旋;綠色.β-折疊;黃色.無(wú)規(guī)則卷曲;紅色.延伸鏈。Note: Blue.α-helix;green.β-fold;yellow.Irregularly curled;red.Extended chain.

2.5 TK蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析采用同源建模的方法,根據(jù)SWISS-MODEL對(duì)TK蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),結(jié)果如圖6所示。TK蛋白的序列相似度與布氏錐蟲胸苷激酶(SMTL ID:5fuv.1.A)模板序列較為相似。

圖6 TK蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析Fig.6 Prediction analysis of tertiary structure of TK protein

2.6 TK蛋白MEGA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析利用TK蛋白的氨基酸序列在NCBI進(jìn)行blast,得到駱駝痘病毒、沙鼠痘病毒、馬痘病毒、鯉科皰疹病毒1、鯉科皰疹病毒2、鯉科皰疹病毒3、牛痘病毒、火雞痘病毒和斑馬魚病毒等的TK蛋白序列,與錦鯉皰疹病毒氨基酸進(jìn)行同源序列比對(duì)分析,表明錦鯉皰疹病毒TK氨基酸序列與鯉科皰疹病毒親緣關(guān)系較近(圖7)。

圖7 TK蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果Fig.7 Results of TK protein phylogenetic tree analysis

3 結(jié)論

隨著生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展提高,生物信息學(xué)的應(yīng)用也逐漸豐富[19]。胸苷激酶基因是大多數(shù)皰疹病毒的主要毒力基因之一,也是病毒復(fù)制的非必需基因,胸苷激酶蛋白是皰疹病毒中一種高度保守性蛋白,且具有較高的抗原性[20]。前人研究表明,胸苷激酶是DNA合成的關(guān)鍵酶之一,痘病毒在復(fù)制過(guò)程中需要借助胸苷激酶作用形成高濃度核酸以完成子代的順利復(fù)制[21]。胸苷激酶基因是豬偽狂犬病病毒的主要毒力基因和非必需基因,也是病毒化學(xué)治療和缺失致弱疫苗的主要靶基因[22],因此對(duì)TK基因的生物信息學(xué)分析,在一定程度上為各種病毒的研究提供了科學(xué)基礎(chǔ)。

錦鯉皰疹病毒病是我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的二類傳染病,目前針對(duì)該病毒的研究主要集中在檢測(cè)方面。該研究進(jìn)行了相關(guān)基因的生物信息學(xué)預(yù)測(cè),為今后的研究方向提供基礎(chǔ)。綜合表明,錦鯉皰疹病毒中胸苷激酶基因編碼的蛋白是不穩(wěn)定蛋白,理化性質(zhì)分析該蛋白為親水蛋白、不含有信號(hào)肽;其蛋白結(jié)構(gòu)域位于2-175氨基酸殘基區(qū)域內(nèi);該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋。綜上,錦鯉皰疹病毒胸苷激酶基因的生物信息學(xué)分析為進(jìn)一步挖掘該基因的功能提供了理論基礎(chǔ)。