嬰幼兒食品中克羅諾桿菌屬的分離鑒定及耐藥性分析

◎ 翟平平，占忠旭，范宏偉，章 潔，劉中華，朱應(yīng)飛

（1.江西省檢驗檢測認證總院食品檢驗檢測研究院，江西 南昌 330000；2.武漢輕工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430023）

克羅諾桿菌屬（Cronobacterspp.）由革蘭氏陰性食源性病原體組成，廣泛存在于嬰幼兒奶粉、米粉以及肉類、飲用水、蔬菜中，嬰幼兒是該菌感染的高危人群，致死率最高可達80%[1]。2017 年報道了某醫(yī)院檢出因克羅諾桿菌感染導(dǎo)致嬰幼兒腹瀉的病例[2]，2018 年廣東省廣州市婦女兒童醫(yī)療中心報道3 例新生兒因克羅諾桿菌感染導(dǎo)致化膿性腦膜炎的病例[3]，2022 年知名品牌雅培奶粉曝出因克羅諾桿菌污染導(dǎo)致3 名嬰幼兒感染的病例[4]。雖然大多數(shù)克羅諾桿菌分離株對常用抗菌劑敏感，但食品樣品中的一些分離株已報告有耐藥性[5]。在農(nóng)業(yè)中不適當(dāng)和不合理使用抗菌劑增加了菌株的耐藥性，特別是多重耐藥[6]，這已成為一個公共衛(wèi)生問題，耐藥菌的出現(xiàn)可能導(dǎo)致常規(guī)抗生素治療失敗，從而造成更大的死亡風(fēng)險。

為了解嬰幼兒食品中克羅諾桿菌屬的耐藥狀況，本實驗室對嬰幼兒食品樣品中克羅諾桿菌屬進行分離鑒定，并測定其耐藥性，為應(yīng)對嬰幼兒克羅諾桿菌屬感染疾病的發(fā)生提供有效的治療參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

實驗材料：嬰幼兒米粉。

實驗試劑：緩沖蛋白胨水（Buffer Peptone Water，BPW）、改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯萬古霉素（Modified Lauryl Sulfate Tryptose Vancomycin Medium，mLST-Vm）、阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂（Trypticase Soy Aga，TSA）、阪崎腸桿菌生化鑒定試劑盒（北京陸橋）。多黏菌素B、萬古霉素、環(huán)丙沙星、呋喃妥因、氨芐西林、頭孢曲松、氯霉素、頭孢噻肟，上海源葉；MH 肉湯培養(yǎng)基（Mueller-Hinton Broth）、磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS），北京國藥。

實驗儀器：電子比濁計，法國生物梅里埃公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 增菌培養(yǎng)

無菌條件下準(zhǔn)確稱取100 g待檢嬰幼兒米粉樣品，加到900 mL 緩沖蛋白胨水（BPW）中，放入36 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，進行前增菌，取1 mL 上述前增菌液，接種到mLST-Vm 管中，放入44 ℃生化培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h。

1.2.2 平板分離

無菌條件下取1 環(huán)mLST-Vm 增菌液，接種阪崎腸桿菌顯色平板，放入36 ℃生化培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，挑取可疑菌落接種TSA 瓊脂平板，25 ℃培養(yǎng)48 h[7]。

1.2.3 生化鑒定

挑取純化后的可疑單菌落，制作0.5 個麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，按照阪崎腸桿菌生化鑒定試劑盒操作說明進行鑒定，將菌懸液滴加到相應(yīng)的生化反應(yīng)孔，置于36 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.2.4 藥物敏感性試驗

藥敏試驗依據(jù)美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI2022 版）標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定進行操作，所用抗生素包括氯霉素（苯丙醇類），呋喃妥因（硝基呋喃類），氨芐西林（青霉素類），多黏菌素B（多肽類），環(huán)丙沙星（氟喹諾酮類），頭孢噻肟、頭孢曲松（頭孢類）[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板分離

阪崎腸桿菌顯色平板上長出藍綠色、邊緣光滑、形態(tài)較小的典型菌落，TSA 瓊脂平板上菌落顏色呈現(xiàn)黃色。平板結(jié)果見圖1。

圖1 平板分離菌落形態(tài)圖

2.2 生化鑒定

挑取阪崎腸桿菌顯色平板上的典型菌落，接種TSA 瓊脂平板，進行阪崎腸桿菌生化試劑盒鑒定。檢驗結(jié)果為產(chǎn)生黃色素，氧化酶實驗陰性，L-賴氨酸脫羧酶陰性，L-鳥氨酸脫羧酶陽性，L-精氨酸雙水解酶陽性，檸檬酸水解陽性，D-山梨醇陽性，L-鼠李糖陽性，D-蜜二糖陽性，苦杏仁苷陰性。根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗》（GB 4789.40 2016）標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，結(jié)果判定為陽性。結(jié)果見圖2。

圖2 克羅諾桿菌屬生化鑒定結(jié)果圖

2.3 耐藥性分析

藥敏試驗結(jié)果顯示，43 株阪崎克羅諾桿菌對氯霉素的耐藥率為51.16%，對氨芐西林和呋喃妥因的耐藥率均為4.65%，對頭孢曲松和頭孢噻肟的耐藥率均為2.33%，對環(huán)丙沙星及多黏菌素B 均敏感。結(jié)果見表1。本研究中用到的抗生素MIC 折點及ATCC25922 質(zhì)控范圍見表2。

表1 43 株克羅諾桿菌耐藥結(jié)果表

表2 抗生素判定標(biāo)準(zhǔn)表

3 結(jié)論與討論

克羅諾桿菌屬感染發(fā)病率較低，但會導(dǎo)致較高的死亡率，國內(nèi)外特別重視嬰幼兒食品中克羅諾桿菌屬的污染。FAO/WHO 把阪崎腸桿菌列為嬰兒配方奶粉中的A 類致病菌[9]。

本項目藥敏試驗結(jié)果顯示，43 株克羅諾桿菌分離菌株中有22 株耐藥，耐藥率為51.16%，早期報道克羅諾桿菌對各種抗生素敏感，但自1987 年以來，有關(guān)該菌耐藥性的報道不斷增加[10]。本研究43 株克羅諾桿菌對氯霉素的耐藥率為51.16%，對氨芐西林和呋喃妥因的耐藥率均為4.65%，對頭孢噻肟和頭孢曲松的耐藥率均為2.33%。氯霉素類抗生素抗菌譜廣，吸收快，體內(nèi)分布廣泛，因而使用廣泛，但其耐藥性也倍受重視。

嬰幼兒食用嬰幼兒食品存在克羅諾桿菌屬感染的潛在風(fēng)險，克羅諾桿菌屬的耐藥性要引起重視。相關(guān)監(jiān)管部門、生產(chǎn)企業(yè)需對嬰幼兒食品生產(chǎn)、運輸?shù)雀鱾€環(huán)節(jié)衛(wèi)生進行嚴(yán)格監(jiān)管，防止嬰幼兒食品受到致病性細菌的污染；臨床上一旦發(fā)現(xiàn)感染克羅諾桿菌屬的病例，應(yīng)分析其藥敏性，規(guī)范治療，避免抗生素的濫用，防止出現(xiàn)超級耐藥菌株。