化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法檢測黃瓜、青菜和水中的噻蟲嗪殘留

郭志慧, 宋天瑋, 錢 磊, 鄭 康,操海群,3, 廖 敏,3, 方慶奎*,,3

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院，合肥 230036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物有害生物綜合治理安徽省重點實驗室，合肥 230036；3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全省級重點實驗室，合肥 230036)

噻蟲嗪是一種系統(tǒng)性、接觸性的第二代新煙堿類殺蟲劑[1-2]。噻蟲嗪作為突觸后尼古丁乙酰膽堿受體的激動劑，可以改變昆蟲的行為，導(dǎo)致害蟲死亡[3]。通過葉面噴霧及土壤灌根處理，對刺吸式害蟲如蚜蟲、飛虱、葉蟬、粉虱等有良好的防效[4]，但與此同時在農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境樣品中可能會存在噻蟲嗪殘留[5-7]，對人體健康和環(huán)境安全帶來潛在的威脅[8-9]。因此，亟需研發(fā)一種靈敏、快速的噻蟲嗪檢測方法，以保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和環(huán)境安全。

目前，已有較多的噻蟲嗪殘留分析方法，如高效液相色譜法[10]、氣相色譜法[11-12]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-14]以及超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-16]。然而，這些方法需要昂貴的設(shè)備、大量的時間、復(fù)雜的樣品前處理和專業(yè)操作人員[17-18]。已有部分研究者建立了一些以抗體為基礎(chǔ)的檢測噻蟲嗪殘留的酶聯(lián)免疫吸附測定法 (ELISA)[19-21]，但是該方法不能滿足人們?nèi)找嫣岣叩膶Ψ治鲮`敏度的要求。為了應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，化學(xué)發(fā)光酶免疫(chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA)方法應(yīng)運而生。作為一種免疫分析技術(shù)，CLEIA方法除具有酶聯(lián)免疫分析方法簡單、快速的優(yōu)勢外，還可以檢測更低的農(nóng)藥殘留，靈敏度顯著提高，在農(nóng)藥殘留分析領(lǐng)域已引起較多的關(guān)注[22-23]。

本文的目的是研發(fā)一種靈敏、快速、可用于檢測部分農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境樣品中噻蟲嗪殘留的CLEIA 分析方法?；诨瘜W(xué)發(fā)光體系和酶聯(lián)免疫分析，通過優(yōu)化抗原和抗體工作濃度，封閉物種類、工作緩沖液中甲醇含量、鈉離子濃度及pH值，建立噻蟲嗪CLEIA 分析方法，并將該方法應(yīng)用于黃瓜、青菜和水中的噻蟲嗪的殘留分析。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及主要溶液配制

1.1.1 主要試劑和材料 農(nóng)藥標準品：噻蟲嗪(thiamethoxam，純度 ≥ 98%)，上海源葉公司；啶蟲脒(acetamiprid，純度 ≥ 99%)、噻蟲啉(thiacloprid，純度 ≥ 99%)、吡蟲啉(imidacloprid，純度 ≥ 98%)、噻蟲胺(clothianidin，純度 ≥ 95%)、烯啶蟲胺(nitenpyram，純度 ≥ 97%)、氯噻啉(imidaclothiz，純度 ≥ 98%)和呋蟲胺(dinotefuran，純度 ≥ 97%)，德國Dr.Ehrenstorfer 公司。辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記的羊抗小鼠IgG 抗體，美國Bosterbio 公司；30% H2O2，中國醫(yī)藥集團有限公司；魯米諾(luminol)，美國Sigma-Aldrich 公司；4-碘苯酚，美國Acros 公司；明膠(gelatin)、脫脂奶粉，北京索萊寶科技有限公司；雞卵清蛋白、胰蛋白胨，上海生工生物公司；酵母提取物，美國OXOID 公司；磷酸二氫鉀、十二水合磷酸氫二鈉和氯化鉀 (均為分析純)，西隴科學(xué)公司；乙腈和甲醇(均為HPLC 級)，美國TEDIA 公司；噻蟲嗪包被原和抗噻蟲嗪單克隆抗體，本實驗室制備[24]；黃瓜和青菜Brassica chinensis樣品，分別購于合肥市肥西路徽商紅府超市和合肥市蜀山區(qū)銅鑼灣廣場菜市場；池塘水樣品，取自合肥市蜀山區(qū)杏花公園。

1.1.2 主要溶液配制 包被緩沖液(CBS)：碳酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH 9.6)；常規(guī)液(PBS)：磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.4)；洗滌液(PBST)：含體積分數(shù)0.05%Tween-20 的磷酸鹽緩沖液；化學(xué)發(fā)光增強溶液 (現(xiàn)配現(xiàn)用)：將魯米諾溶液(0.01 mol/L 1.20 mL)、H2O2溶液(含體積分數(shù)0.255%H2O2的水溶液 267 μL)、4-碘苯酚溶液(0.05 mol/L 12 μL)和Tris-HCl 緩沖液(0.10 mol/L, pH 8.5)定容至12 mL。

1.2 主要儀器

Elx405TM型全自動洗板機，美國BioTek 公司；DH4000BII 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器公司；Nanodrop-1000 紫外分光光度儀，美國Thermo 公司；SpectraMaxM5 多功能酶標儀，美國Molecular Devices 公司；各規(guī)格單通道移液器、八通道移液器(100 μL)及高速離心機，德國Dr.Ehrenstorfer 公司；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(ACQUITY UPLC, Xevo TQD MS, UPLC-MS/MS)，美國Waters 公司；96 孔白色酶標板3922，美國Corning 公司；精密pH 試紙，英國Whatman公司；FA2004N 型萬分之一天平，上海菁海儀器公司；HOKEE-A1-10 型純水系統(tǒng)，合肥宏科科技公司。

1.3 化學(xué)發(fā)光讀數(shù)波長和時間的選擇

將化學(xué)發(fā)光增強液加入96 孔酶標板中，用多功能酶標儀掃描250～700 nm 波段，讀取化學(xué)發(fā)光值，確定最適掃描波長；將化學(xué)發(fā)光增強液加入96 孔酶標板，每隔2 min 讀取一次發(fā)光信號，記錄發(fā)光信號值，確定最適讀數(shù)時間。

1.4 間接競爭CLEIA 操作步驟

間接競爭CLEIA (Indirect competitive CLEIA,IC-CLEIA) 的操作步驟如下：

(1) 包被：用包被緩沖液將合適稀釋梯度的包被原加入發(fā)光板，每孔50 μL，37 ℃孵育2 h；(2) 洗板：用洗滌液PBST 洗滌5 次，吸水紙拍干；(3) 封閉：每孔加入100 μL 封閉物，37 ℃孵育30 min；(4) 洗板：同 (2)；(5) 加入噻蟲嗪和抗噻蟲嗪單克隆抗體混合物：每孔加入用工作緩沖液稀釋的農(nóng)藥和單克隆抗體各25 μL，37 ℃孵育1 h；(6) 洗板：同 (2)；(7) 加入酶標二抗：每孔加入50 μL 經(jīng)1 : 5000 倍PBST 稀釋的羊抗鼠HRP-IgG，37 ℃孵育1 h；(8) 洗板：同 (2)；(9)加入發(fā)光底物：每孔加入100 μL 新配制的發(fā)光底物液，避光放置5 min；(10) 測定：終點法讀取425 nm 波長下的發(fā)光值。

1.5 包被原濃度和抗體濃度的優(yōu)化

用碳酸鹽緩沖液稀釋包被抗原，稀釋倍數(shù)分別為1 : 8000、1 : 16 000、1 : 32 000、1 : 64 000、1 : 128 000 和1 : 256 000，固定抗體濃度不變，利用梯度濃度的噻蟲嗪標準品溶液進行IC-CLEIA 法分析，篩選合適的包被原濃度。

用磷酸鹽緩沖液稀釋抗噻蟲嗪單克隆抗體，稀釋倍數(shù)分別為1 : 24 000、1 : 32 000、1 : 48 000、1 : 64 000、1 : 96 000 和1 : 128 000，固定抗原濃度不變，利用梯度濃度的噻蟲嗪標準品溶液進行IC-CLEIA 法分析，篩選合適的抗體濃度。

1.6 工作體系的優(yōu)化

1.6.1 封閉物質(zhì)優(yōu)化 選取質(zhì)量濃度 (下同) 為5%的脫脂奶粉、2%酵母提取物、1%胰蛋白胨、1%明膠和1%雞卵清蛋白5 種物質(zhì)作為候選封閉物。首先將封閉物用磷酸鹽緩沖液溶解，然后利用梯度濃度的噻蟲嗪標準品溶液進行IC-CLEIA 法分析，研究5 種封閉物對減少非特異性吸附的影響。

1.6.2 pH 值優(yōu)化 分別用pH 值為6.5、7.0、7.5、8.0 和8.5 的PBST 緩沖液稀釋抗噻蟲嗪單克隆抗體，利用梯度濃度的噻蟲嗪標準品溶液進行IC-CLEIA 法分析，建立不同pH 值下的CLEIA 分析標準曲線，考察pH 值對免疫分析體系的影響。

1.6.3 甲醇含量優(yōu)化 分別用甲醇體積分數(shù)為0%、5%、10%、15%、20%和25%的PBST 溶液稀釋噻蟲嗪標準品，并進行IC-CLEIA 法分析，建立不同甲醇含量下的CLEIA 分析標準曲線，考察甲醇含量對免疫分析體系的影響。

1.6.4 鈉離子濃度優(yōu)化 分別用含量為0、0.05、0.1、0.2、0.4 和0.8 mol/L 鈉離子的PBST 緩沖液稀釋抗噻蟲嗪單克隆抗體，利用梯度濃度的噻蟲嗪標準品溶液進行IC-CLEIA 法分析，建立不同鈉離子濃度下的CLEIA 分析標準曲線，考察鈉離子濃度對免疫分析體系的影響。

分析結(jié)果判定均以RLUmax(最大發(fā)光值)/IC50(半數(shù)抑制濃度)和IC50值作為評價標準，RLUmax/IC50越高，IC50值越低，靈敏度越高。

1.7 噻蟲嗪化學(xué)發(fā)光酶免疫分析標準曲線的建立

用最優(yōu)甲醇含量的PBST 溶液配制質(zhì)量濃度分別為0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100、250、500 和1000 ng/mL 的噻蟲嗪系列梯度標準溶液。在最優(yōu)免疫分析條件下，建立基于抗噻蟲嗪單克隆抗體CLEIA 法四參數(shù)Logistic 擬合標準曲線，計算IC50值、定量限(LOQ)[25]及檢測范圍。

1.8 交叉反應(yīng)率測定

配制噻蟲嗪結(jié)構(gòu)類似化合物啶蟲脒、噻蟲啉、吡蟲啉、噻蟲胺、烯啶蟲胺、氯噻啉和呋蟲胺的濃度梯度標準溶液。在最優(yōu)免疫分析條件下，采用CLEIA 法建立結(jié)構(gòu)類似化合物的標準曲線，計算IC50值，并按公式 (1) 計算噻蟲嗪結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)率 (CR，%)。

式中：IC50T為噻蟲嗪半數(shù)抑制濃度；IC50A為結(jié)構(gòu)類似物半數(shù)抑制濃度。

1.9 添加回收試驗

分別以黃瓜、青菜和池塘水為對象研究樣品基質(zhì)對CLEIA 法檢測噻蟲嗪殘留的影響，供試樣品均已利用UPLC-MS/MS 驗證不含有噻蟲嗪。將噻蟲嗪分別添加到黃瓜、青菜和池塘水樣品中進行添加回收試驗，以評價建立的噻蟲嗪殘留CLEIA方法的可靠性。

1.9.1 樣品制備 將黃瓜、青菜切成小塊并勻漿。稱取1 g 樣品于15 mL 離心管中，加入5 mL含體積分數(shù)為5%甲醇的PBST 作為提取溶劑，用渦旋儀充分振蕩提取2 min。將提取液經(jīng)濾紙過濾后，4000 r/min 下離心5 min，取上清液待測；池塘水經(jīng)濾紙過濾，待測。

1.9.2 基質(zhì)效應(yīng)評價 利用最優(yōu)緩沖液直接稀釋基質(zhì)提取液是免疫分析中降低分析樣品基質(zhì)效應(yīng)的常用方法。以5%甲醇的PBST 為稀釋液稀釋基質(zhì)提取液，將黃瓜提取液分別進行10、20、30、40 倍稀釋，將青菜提取液進行2、5、10、20 倍稀釋，將池塘水樣進行1、2、5、10 倍稀釋。以不同稀釋倍數(shù)的基質(zhì)提取物為溶劑配制不同濃度的噻蟲嗪標準溶液，并進行CLEIA 法測定。以最優(yōu)緩沖液配制的噻蟲嗪標準溶液測定的CLEIA 結(jié)果作為空白對照。

1.9.3 添加回收率測定和UPLC-MS/MS 方法驗證

利用添加標準溶液的方式進行添加回收試驗，以噻蟲嗪的添加回收率和相對標準偏差 (RSD) 來評價CLEIA 法的可靠性?；诨|(zhì)效應(yīng)影響，黃瓜勻漿樣品中分別添加100、250、500 和1000 ng/g，青菜勻漿樣品中分別添加125、250、500、1250 ng/g，池塘水分別添加10、25、50 和100 ng/g 的噻蟲嗪標準品，混勻后靜置1 h，進行樣品前處理。將提取液按一定倍數(shù)稀釋后，用CLEIA 法測定回收率。為了驗證CLEIA 法檢測結(jié)果的準確性，黃瓜、青菜和池塘水樣品添加標準品后用UPLCMS/MS 進行驗證。UPLC-MS/MS 檢測條件如下。

色譜條件：ACQUITY BEH C18色譜柱 (50 mm ×2.1 mm，1.7 μm)，柱溫為40 ℃；流動相A 為體積分數(shù)為0.1%的甲酸水溶液，流動相B 為乙腈，流速為0.2 mL/min；梯度程序：0.00～0.25 min，10% B；＞ 0.25～1.00 min，95% B；＞ 1.00～2.00 min，10% B；＞ 2.00～4.50 min，10% B?？傔\行時間為4.50 min。樣品進樣體積為5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離方式，正離子模式(ESI+)；離子源溫度為150 ℃，霧化氣和輔助氣的氮氣流速分別為50 和1000 L/h。脫溶溫度為500 ℃。質(zhì)譜分析的離子躍遷、錐孔電壓和碰撞電壓如附表S1 所示。

1.10 真實樣品采集與檢測

分析樣品從學(xué)校周邊的超市和公園采集，按照1.9.1 節(jié)所述樣品前處理方法將采集的青菜、黃瓜、池塘水樣品進行前處理，處理好的樣品根據(jù)基質(zhì)效應(yīng)評價中消除基質(zhì)效應(yīng)的稀釋倍數(shù)進行稀釋，將稀釋后的樣品進行CLEIA 法測定，同時用UPLC-MS/MS 進行驗證。

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)發(fā)光信號特征

經(jīng)過多功能酶標儀掃描，得到魯米諾的化學(xué)發(fā)光發(fā)射波譜如圖1 所示。在波長425 nm 處，魯米諾發(fā)光的信號響應(yīng)最高 (圖1A)，故以其為最大發(fā)射波長。在該波長下掃描30 min，得到化學(xué)發(fā)光動力曲線 (圖1B)。由圖1B 可知，化學(xué)發(fā)光值隨著時間的增加先升高后降低，在4～6 min 之間化學(xué)發(fā)光值達到峰值并趨于平衡，因此，本文選取5 min 進行讀數(shù)。

圖1 化學(xué)發(fā)光信號特征圖譜Fig.1 Characteristic atlas of chemiluminescence signal

2.2 包被原濃度和單克隆抗體濃度的選擇

為了獲得較低的定量限和較好的重現(xiàn)性，需要對抗原抗體工作濃度進行優(yōu)化?？乖瓭舛群Y選采取固定抗體濃度，對抗原濃度進行梯度稀釋，再進行IC-CLEIA 分析，結(jié)果如圖2A 所示。依據(jù)結(jié)果判定標準，隨著包被抗原稀釋倍數(shù)的提高，IC50值呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，而RLUmax/IC50則呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。在稀釋64 000 倍時IC50值較低，RLUmax/IC50較高，靈敏度達到最高。因此，選擇抗原稀釋64 000 倍作為最優(yōu)包被原工作濃度，即0.075 mg/L。

圖2 包被抗原和抗體的濃度優(yōu)化 (n = 3)Fig.2 Concentration optimization of coating antigen and anti-thiamethoxam monoclonal antibodies (n = 3)

抗噻蟲嗪單克隆抗體工作濃度的篩選采取固定抗原濃度，對抗體濃度進行系列稀釋，再進行IC-CLEIA 分析，結(jié)果如圖2B 所示。依據(jù)結(jié)果判定標準，隨著抗噻蟲嗪單克隆抗體稀釋倍數(shù)的提高，IC50值呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，而RLUmax/IC50還是呈現(xiàn)先增加再降低的趨勢。在稀釋32 000 倍時IC50值較低，RLUmax/IC50較高，靈敏度達到最高。因此，選擇抗體稀釋32 000 倍作為最優(yōu)抗體工作濃度，即0.0304 mg/L。

2.3 工作體系的優(yōu)化

封閉物可以減少免疫分析中的非特異性吸附，一般是明膠或其他惰性蛋白。封閉物通過結(jié)合固相載體的空余位點，進而減少或避免發(fā)生非特異性吸附。依據(jù)質(zhì)量濃度為5% 的脫脂奶粉、2%酵母提取物、1%胰蛋白胨、1%明膠和1%雞卵清蛋白5 種封閉物的IC-CLEIA 分析結(jié)果，由圖3A 可知，以1% 明膠封閉時具有較好的靈敏度。因此，選擇1% 明膠作為CLEIA 分析的封閉物。

圖3 工作體系的優(yōu)化 (n = 3)Fig.3 Optimization of working system (n = 3)

pH 值對分析方法的影響如圖3B 所示，隨著工作緩沖液的pH 值升高，IC50值呈現(xiàn)先降低后增加再降低的趨勢，RLUmax/IC50也受到影響而波動。依據(jù)結(jié)果判定標準，當pH = 7.0 時，方法的靈敏度達到最高。因此，選擇pH7.0 的PBST 緩沖液作為最優(yōu)pH 值工作緩沖液。

有機溶劑可以提升噻蟲嗪標準品在工作緩沖液中的溶解效果，但可能會影響免疫反應(yīng)的靈敏度。在甲醇含量分別為0%、5%、10%、15%、20%和25%的PBST 緩沖液體系中 (圖3C)，隨著甲醇含量升高，IC50值先降低再增加，后又平緩降低，依據(jù)結(jié)果判定標準，當甲醇含量為5%時，方法的靈敏度達到最高。因此，選擇含5%甲醇的PBST緩沖液作為最優(yōu)甲醇濃度工作緩沖液。

鈉離子濃度對分析方法的影響如圖3D 所示，隨著工作緩沖液中鈉離子濃度的升高，IC50值不斷降低，RLUmax/IC50先升高后降低。依據(jù)結(jié)果判定標準，當鈉離子工作濃度為0.4 mol/L 時，方法的靈敏度達到最高。因此，選擇含0.4 mol/L 鈉離子的PBST 緩沖液作為最優(yōu)鈉離子濃度工作緩沖液。

2.4 CLEIA 方法的建立

在上述最優(yōu)的分析條件下，進行噻蟲嗪ICCLEIA 分析。用Origin Pro 軟件分析數(shù)據(jù)并繪制標準曲線。以噻蟲嗪濃度的對數(shù)為橫坐標，以結(jié)合率為縱坐標，建立CLEIA 檢測噻蟲嗪標準抑制曲線 (圖4)。標準曲線線性方程為y= -0.4418x+0.5014 (R2= 0.9842)，線性范圍為0.125～12.5 ng/mL，IC50值為1.007 ng/mL，方法的定量限 (LOQ) 為0.125 ng/mL。結(jié)果表明該方法線性范圍較寬，具有較好的分析靈敏度。

圖4 CLEIA 檢測噻蟲嗪的標準曲線 (n = 3)Fig.4 Standard curve for CLEIA detection of thiamethoxam (n = 3)

2.5 交叉反應(yīng)率測定

利用IC-CLEIA 方法對7 種噻蟲嗪結(jié)構(gòu)類似物進行檢測，類似物的IC50值和交叉反應(yīng)率 (表1)顯示，噻蟲嗪結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率均不高于0.3%，表明本文建立的IC-CLEIA 方法具有較高的特異性。

表1 基于CLEIA 測定噻蟲嗪結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)性 (n = 3)Table 1 Cross-reactivity of analogues structurally related to thiamethoxam determined by CLEIA (n = 3)

2.6 基質(zhì)效應(yīng)評價

為減少樣品基質(zhì)中的色素、酚類、脂類和重金屬等干擾成分影響，提高免疫分析結(jié)果的可靠性，本研究利用最優(yōu)工作緩沖液稀釋樣品基質(zhì)提取液，進而實現(xiàn)減小樣品基質(zhì)影響，結(jié)果如附圖1所示。通過與空白對照 (最優(yōu)緩沖液，不含有樣品基質(zhì)提取物) 結(jié)果比較可知，黃瓜提取物稀釋20 倍、青菜提取物稀釋20 倍時與空白對照接近且稀釋倍數(shù)最低，池塘水稀釋10 倍時與空白對照最接近。根據(jù)分析結(jié)果，選擇黃瓜樣品20 倍稀釋、青菜樣品20 倍稀釋和池塘水樣品10 倍稀釋處理進行下一步試驗。

2.7 添加回收試驗結(jié)果

黃瓜、青菜和池塘水樣品添加回收結(jié)果如表2所示。噻蟲嗪的添加濃度以最終工作濃度落在檢測線性范圍內(nèi)為依據(jù)。噻蟲嗪在黃瓜、青菜和池塘水樣品的添加回收率為86%～108%，RSD 為2.6%～9.1%。UPLC-MS/MS 法是具有法律效力的定性定量確證工具，通過UPLC-MS/MS 檢測結(jié)果與CLEIA 檢測結(jié)果相比較，可以確證檢測結(jié)果的可靠性。結(jié)果表明，UPLC-MS/MS 方法的回收率為82%～120%，RSD 為2.0%～10.4%，兩種方法分析結(jié)果具有良好的一致性。根據(jù)GB 2763—2021《食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》的規(guī)定[26]，噻蟲嗪在黃瓜上的最大殘留限量 (MRL) 值為0.5 mg/kg，因此，該方法能夠滿足我國農(nóng)藥殘留限量標準的要求，適用于噻蟲嗪農(nóng)藥在黃瓜、青菜和池塘水等樣品中的殘留檢測。

表2 CLEIA 和UPLC-MS/MS 檢測添加噻蟲嗪樣品的回收率和相對標準偏差 (n = 3)Table 2 Recovery studies and relative standard deviation of sample spiked with thiamethoxam by CLEIA and UPLC-MS/MS (n = 3)

2.8 真實樣品分析

黃瓜、青菜、池塘水樣品的CLEIA 和UPLCMS/MS 檢測結(jié)果如附表2 所示。結(jié)果顯示，實驗采集的3 份黃瓜樣品、3 份青菜樣品、1 份池塘水樣品中噻蟲嗪殘留均低于兩種方法的檢出限，表明市場銷售的黃瓜和青菜樣品以及環(huán)境中的池塘水樣品中噻蟲嗪殘留風險較低。

3 結(jié)論與討論

噻蟲嗪作為第2 代新煙堿類殺蟲劑的代表，具有持效期長、施藥方式靈活、殺蟲譜廣和相對低毒等特點，但相關(guān)研究表明其慢性毒性仍需引起關(guān)注。免疫分析方法是重要的快速篩查手段之一，為保障農(nóng)產(chǎn)品安全和環(huán)境安全提供了重要的技術(shù)支撐。本研究以酶免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)，引入化學(xué)發(fā)光體系放大反應(yīng)信號響應(yīng)，通過分析方法的優(yōu)化，首次建立了噻蟲嗪CLEIA 分析方法。通過與已經(jīng)報道的噻蟲嗪ELISA 分析方法 (如表3 所示) 相比較，該方法具有較高的分析靈敏度和較寬的線性范圍。同時，由于使用含5%甲醇的PBST 最優(yōu)緩沖液提取樣品即可實現(xiàn)準確分析檢測樣品中的噻蟲嗪殘留，因此，該方法簡化了樣品前處理環(huán)節(jié)，顯著減少了有機溶劑的使用。因此，本文建立了一種前處理簡單、環(huán)境友好、靈敏度高的CLEIA 分析方法，符合我國現(xiàn)行的噻蟲嗪最大殘留限量要求，為噻蟲嗪殘留檢測提供了新的技術(shù)支持。然而，由于本文建立的方法能夠特異性識別噻蟲嗪的六元雜環(huán)，所以對噻蟲嗪的主要代謝產(chǎn)物噻蟲胺幾乎不識別 (交叉反應(yīng)率小于0.01%)，造成該方法在分析環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中的噻蟲嗪及其代謝物殘留時具有一定的局限性。

表3 CLEIA 方法和ELISA 方法檢測噻蟲嗪的性能比較Table 3 Comparison of performance between CLEIA method and ELISA method in the detection of thiamethoxam