全自動間斷化學分析儀在苗木氮、磷測定方法中的優(yōu)良性研究*

陳詩，母德錦，王瑜，陳林，唐軍榮，蔡年輝，許玉蘭，李孫玲

(1.西南林業(yè)大學 西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點實驗室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學 西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650224；3.云南省林業(yè)和草原科學院，云南 昆明 650201)

氮、磷是植物中核酸、蛋白質(zhì)以及細胞結(jié)構(gòu)的主要組成營養(yǎng)元素，不僅在植物的生長發(fā)育和各種生理機制調(diào)節(jié)過程中起到重要的作用，還參與到了地球化學循環(huán)[1-2]。前人的研究表明，植物葉片中的氮、磷化學計量特性變化，可作為判別植物受養(yǎng)分限制的依據(jù)[3]。因此，準確測定植物葉片中氮、磷含量，對于植物營養(yǎng)分析與評價、水肥管理以及植物生態(tài)適應(yīng)策略有著重要意義[4-6]。植物全氮、全磷含量測定的經(jīng)典方法分別是凱氏定氮法和鉬銻抗比色法[7]。但傳統(tǒng)的測定方法操作繁瑣、受人為影響較大、檢測分析效率較低、較難滿足快速批量測定的要求。近年來儀器檢測技術(shù)得到了越來越多的應(yīng)用[8-11]，但是凱氏定氮儀、分光光度儀、元素分析儀等儀器不能同時滿足氮、磷含量的測定，使用效率降低，而流動分析儀雖可同時測定氮、磷元素含量，卻因價格高昂以及對機器維護保養(yǎng)以及模塊更換要求高而使用率低。

SmartChem 200全自動間斷化學分析儀是最近幾年來離子分析儀器領(lǐng)域中新突破，能夠同時測定氮、磷元素含量，因其操作簡便，檢測準確度高，價格適中等優(yōu)點得到了環(huán)保、農(nóng)林、水產(chǎn)行業(yè)等領(lǐng)域的青睞。前人對該儀器的測定方法研究多集中在水質(zhì)監(jiān)測[12-13]、食品營養(yǎng)[14-15]、土壤元素[16]等方面，而對植物葉片中氮、磷元素測定方法研究較少。因此，本研究以西南林業(yè)大學智能溫室大棚1 a生云南松(Pinusyunnanensis)苗的根、莖、葉器官為測試材料，應(yīng)用SmartChem 200全自動間斷化學分析儀進行測定，建立同時測定植物葉片中全氮、全磷含量的方法，并將實驗結(jié)果與傳統(tǒng)方法結(jié)果做比較，驗證該儀器的優(yōu)良性，以期為批量測定植物中全氮、全磷的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2022年9月于西南林業(yè)大學智能溫室大棚云南松苗圃采集1 a生云南松針葉樣品14份、莖樣品14份、根樣品14份，共42份樣，依次編號1～42號。采樣后將植物材料在120 ℃烘箱殺青30 min，再80 ℃烘至恒重，粉碎機研磨后將過孔徑100目篩的顆粒干燥備用。

1.2 主要儀器

SmartChem 200全自動間斷化學分析儀，萬分之一電子分析天平，烘箱，LWY84B型遠紅外消煮爐等。

1.3 藥品

酒石酸鉀鈉、過氧化氫、氯化鉀、水楊酸鈉、氫氧化鈉、硝普鈉、次氯酸鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)、半水合酒石酸銻鉀、酒石酸銻鉀、抗壞血酸、氫氧化鉀、四水鉬酸銨、二氯異氰尿酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、曲拉通、異丙醇、聚氧乙烯月桂醚。按照儀器說明書方法配置針洗液、稀釋液、酒石酸銻鉀溶液、TPA試劑、TPB試劑、TPC試劑、磷50 mg/L儲備標樣、氮60 mg/L儲備標樣、TNA試劑、TNB試劑、TNC試劑。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗原理

通過濃硫酸的消煮過程，將處于游離狀態(tài)的氨根離子、有機氮和氮元素轉(zhuǎn)化形成硫酸銨。氨與次氯酸鹽和水楊酸鹽反應(yīng)會生成與氨濃度成正比的藍色物質(zhì)，加入硝普鈉能夠增加顯色程度，酒石酸鉀鈉則能夠消除鈣離子、鎂離子等的影響，其中的紅色絡(luò)合物在660 nm波長處有最大吸收，可測定其吸光度，由此計算氮的濃度。磷在酒石酸銻鉀存在的條件下會與鉬酸銨反應(yīng)生成淡黃色的磷鉬酸銨復合物，再用還原劑抗壞血酸還原生成深藍色的鉬藍，于880 nm波長處測定吸光度，計算磷的濃度。

1.4.2 樣品的處理

基于陳劍磊等[16]的方法改良。稱取0.20 g植物樣品倒入消煮管中，加入1.5 mL去離子水潤濕后，再加入5 mL 98%濃硫酸，使用振蕩器搖勻使其充分碳化。將裝有碳化后樣品的消煮管置于遠紅外消煮爐中消解并將溫度調(diào)至80 ℃，待消煮爐溫度上升至80 ℃時向消煮管內(nèi)加入5滴30%過氧化氫。按此方法每間隔30 min將消煮爐溫度升至160、240、280、320 ℃，過氧化氫量逐次減少直至消煮管內(nèi)液體澄清，340 ℃時需加熱5～10 min。除不加樣品液外，空白試驗也照此方法進行。待消煮管自然冷卻后，用去離子水將管內(nèi)液體沖洗入50 mL容量瓶并定容。過濾后的上清液按氮500倍、磷100倍稀釋備測。

1.4.3 上機步驟

待電腦和SmartChem 200全自動間斷化學分析儀開機預熱15 min后，依次在反應(yīng)池中添加樣品、1%硫酸稀釋液、針洗液、標樣試劑、TNA試劑、TNB試劑、TNC試劑、TPA試劑、TPB試劑、TPC試劑以及測標曲需要的5個空樣杯。

在全自動間斷化學分析控制軟件上選用0～12 mg/L(以N計)測量范圍設(shè)定參數(shù)，將濾光片F(xiàn)ilter1設(shè)定為660 nm并啟用Fluidics，設(shè)置樣品量30 uL、TNA試劑290 uL并延時36 s、TNB試劑64 uL并延時36 s、TNC試劑32 uL并讀數(shù)612 s，機器可自動將標準氮稀釋為0、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6、12.0 mg/L系列標準液。全自動間斷分析儀先按照上述檢測條建立全氮的標準曲線：Y=18.059 9X+0.007 5(R2=0.999 9)。

選取以0～5 mg/L(以P計)測量范圍設(shè)定磷的標曲參數(shù)。將濾光片F(xiàn)ilter1設(shè)定為880 nm啟用Fluidics，設(shè)置樣品量48 uL、TPA試劑292 uL并延時36 s、TPB試劑56 uL、TPC試劑24 uL并讀數(shù)576 s，系統(tǒng)會自動將標準磷稀釋為0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、5.00 mg/L系列標準液。按上述檢測條件進行測定，全磷的標準曲線：Y=8.476 0X-0.1707(R2=0.999 4)。然后對樣品進行自動檢測分析，分析結(jié)束后將測定結(jié)果導出計算含量。

1.5 結(jié)果計算

全氮計算公式如下。

W=C×0.5/M

①

全磷計算公式如下。

W=C×0.1/M

②

式中：W為氮、磷元素含量，單位g/kg；C為機器測定出的吸光度值根據(jù)標準曲線計算的氮、磷濃度，單位mg/L；M為樣品質(zhì)量，單位為g。

加標回收率的計算公式如下。

R(%)=(Cs-C)/S×100

③

式中：R是回收率，Cs為加標樣品含量，C為樣品含量，S為加到樣品中的分析物量。

精確度實驗中，選定的樣品消煮液重復測定3次；測定值Xi的算術(shù)平均值為樣品元素含量的估測值，用貝塞爾公式計算標準偏差SD，即

④

RSD=SD/計算結(jié)果的算術(shù)平均值×100%

⑤

式中：xi為測定值，SD為標準偏差，RSD為相對標準偏差。

1.6 統(tǒng)計分析與數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Microsoft Excel 2013進行數(shù)據(jù)處理，并利用直線回歸方程作圖分析全自動間斷分析儀和傳統(tǒng)方法測定植物全氮、全磷含量的相關(guān)性及顯著性，采用Spss 18.0軟件對不同方法測定的數(shù)據(jù)進行配對t檢驗和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 全自動間斷分析儀與傳統(tǒng)方法所測植物全氮、全磷的比較

本實驗中所用的42個云南松苗各器官樣本全氮含量在5.935～14.960 g/kg之間，全磷含量在1.442～2.426 g/kg之間。由表1可知凱氏定氮儀與全自動間斷分析儀測定的全氮平均含量為10.108 g/kg和10.020 g/kg，雙側(cè)t檢驗，P(T≤t)=0.128，表明實驗中所用的2種方法測定的相同材料全氮含量差異不顯著。鉬銻抗比色法與全自動間斷分析儀測定的全磷平均含量為1.916 g/kg和1.908 g/kg，雙側(cè)t檢驗，P(T≤t)=0.397，表明實驗中用同2種方法測定的同種植物材料樣品全磷含量無差異。

表1 傳統(tǒng)方法與全自動間斷分析儀測定植物全氮、全磷含量t檢驗

2.2 全自動間斷分析儀與傳統(tǒng)方法所測全氮、全磷含量的相關(guān)性

由圖1可知，全自動間斷分析儀與凱氏定氮儀所測定全氮含量擬合的回歸方程為Y=0.982 8X+0.261(R2=0.979 3)，因此2種方法所測定的全氮數(shù)值相關(guān)性極顯著(P<0.01)。全自動間斷分析儀與鉬銻抗比色法測定的全磷含量所擬合的回歸方程Y=1.091 9X-0.167 7(R2=0.966 7)，進一步說明2種方法測定的全磷含量相關(guān)性極顯著(P<0.01)。2個方程的斜率分別是0.982 8和1.091 9，比較趨近于1，表明全自動間斷分析儀與傳統(tǒng)方法所測定的全氮、全磷含量結(jié)果較一致。

圖1 全自動間斷分析儀與傳統(tǒng)方法測定植物全氮、全磷含量的相關(guān)性

2.3 全自動間斷分析儀測定全氮、全磷含量回收率與精確度分析

以其中3個樣品(11號、17號、32號)為本底，加入NH4CL 100 mg/L標準氮和KH2PO450 mg/L標準磷進行回收率測定方法的驗證。在相同條件下，按照表2量進行加標回收實驗。結(jié)果表明，全自動間斷分析儀測定全氮的回收率(R)為98.900%～101.850%，全磷的R為96.100%～105.200%。說明全自動間斷分析儀同時測定全氮、全磷的準確度較高。

表2 全氮、全磷的加標回收率實驗結(jié)果

在相同測定環(huán)境下，用全自動間斷分析儀對11號、17號、32號的樣品全氮、全磷平行測定3次，結(jié)果見表3。全氮的相對標準偏差(RSD)為2.020%～2.790%，全磷的RSD為0.250%～1.280%，由此可見該方法對植物全氮、全磷測定的精密度較高，結(jié)果穩(wěn)定。

表3 全氮、全磷平行測定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

測定植物全氮、全磷含量，無論是應(yīng)用傳統(tǒng)測定方法還是自動化儀器測定方法，首先都需要將樣品材料預處理成待測液，再進行測定。而待測液的制備所需要消耗的時間和精力成本往往比含量檢測消耗得更多，樣品材料的消煮過程將直接影響到元素含量測定的準確性。本研究雖然選用硫酸-過氧化氫對干樣進行消煮，但在消煮溫度上采用階梯式增溫的方式，而非直接370 ℃消煮[17-18]。因此，避免了直接過高的溫度導致消煮管中的液體一直沸騰放熱，樣品容易噴濺到消煮管壁上，導致消煮不完全而造成材料損失影響精度的，同時給檢測人員帶來危險，污染周圍環(huán)境等情況。消煮到320 ℃時消煮管內(nèi)液體顏色透明無色，仍需在320 ℃煮10 min，此步驟可除去消煮管內(nèi)剩余的過氧化氫，減少測定時的干擾[19]。

傳統(tǒng)的凱氏定氮法測氮是將消煮液中的銨鹽經(jīng)過堿化后形成氨，并在濃堿作用下蒸餾將氨吸收到硼酸溶液中形成硼酸胺，加入甲基紅-溴甲酚綠指示劑，用標準酸滴定的消耗量來計算出樣品中的全氮含量[20]。鉬銻抗比色法測磷的原理則是樣品液中的正磷酸與偏釩酸以及鉬酸反應(yīng)得到黃色的三元雜多酸，在880 nm波長下有最大吸收，并利用其吸光度與磷酸濃度成正比關(guān)系計算磷濃度[17]?？梢?種測定氮、磷含量方法的原理與全自動間斷分析儀測定原理完全不相同。就測定結(jié)果比對而言，二者數(shù)值無顯著的差異，并存在顯著的線性關(guān)系，相對標準偏差(RSD)均小于3%，精密度均優(yōu)于行業(yè)標準(10%、15%)[21-22]，說明不管是傳統(tǒng)方法還是全自動間斷分析儀方法均能準確測定植物全氮和全磷含量。

本研究所用SmartChem 200全自動間斷化學分析儀由預設(shè)的程序控制，是將傳統(tǒng)比色分析法自動化的儀器。通過全自動機器手帶動取樣針把藥品液和待測液精準地加入比色皿中，再自動攪拌、反應(yīng)，再利用雙光束高精度數(shù)字檢測器測定吸光度，通過標曲公式可自動計算得到相應(yīng)的濃度，整理結(jié)果報告，可以有效避免人為操作誤差。按照溫云杰等[23]對傳統(tǒng)凱氏定氮法的計算表明樣品待測液吸取、蒸餾、滴定過程總共耗時約為6 min，按照每天測定工作時間7 h算，每天大約可檢測70個樣品，這其中還沒有包括硼酸反應(yīng)液與酸標準滴定溶液配制與標定耗時，測定過程中每個樣品用量約40 mL，消耗試劑約50 mL。李萍等[17]對鉬銻抗比色法測磷的計算表明從待測液加入二硝基酚指示劑后滴加氫氧化鈉溶液顯色開始，再到添加硫酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH值，最后到添加鉬銻抗試劑反應(yīng)等待變色測定，至少需要35 min，而測定過程中每個樣品用量約5 mL，消耗試劑約50 mL。全自動化學間斷分析儀一次可測定最多126個樣品，測定速度可達每小時200個樣，測定400個樣品僅需40 mL試劑，每個樣品待測液用量3 mL。因此SmartChem 200全自動間斷分析儀在測定植物全氮、全磷時，節(jié)省樣品和試劑、減小污染，同時消除了因為人員操作和條件差異而產(chǎn)生的誤差。

3.2 結(jié)論

與傳統(tǒng)的凱氏定氮法和鉬銻抗比色法測定氮、磷相比，SmartChem 200全自動間斷分析儀測定1 a生云南松苗全氮、全磷含量無明顯差異，并且與傳統(tǒng)方法測定的數(shù)據(jù)呈顯著的相關(guān)性，全氮的RSD在3%以內(nèi)、全磷的RSD在2%以內(nèi)，且該方法測定回收率在98.90%～101.85%和96.10%～105.20%之間。上述分析結(jié)果表明，應(yīng)用SmartChem 200全自動間斷化學分析儀同時測定植物樣品中全氮、全磷的方法集自動進樣、自動稀釋、分光光度計、數(shù)據(jù)處理為一體，具有操作簡單、結(jié)果準確可靠、回收率高、測量速度快、藥品和樣品用量少、高度自動化等優(yōu)點。因此，本研究中的方法可以應(yīng)用于批量檢測植物全氮、全磷含量。