基于UPLC-Q-TOF-MS/MS及網絡藥理學探討麻杏止哮顆粒治療哮喘的有效成分和作用機制

王 玉，于桂芳，胡軍華，周 茆，肖 偉, ，王振中, *

基于UPLC-Q-TOF-MS/MS及網絡藥理學探討麻杏止哮顆粒治療哮喘的有效成分和作用機制

王 玉1，于桂芳2, 3，胡軍華2, 3，周 茆2, 3，肖 偉1, 2, 3，王振中1, 2, 3*

1. 南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023 2. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001 3. 中藥制藥過程新技術國家重點實驗室，江蘇 連云港 222001

基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術和網絡藥理學探討麻杏止哮顆粒治療哮喘的有效成分和作用機制。通過UPLC-Q-TOF-MS/MS技術及中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫篩選麻杏止哮顆粒的活性成分和相關靶點；利用Disgenet、Genecards數據庫檢索哮喘疾病靶點，利用韋恩圖繪制平臺獲取共有靶點，并將信息導入Cytoscope3.9.1軟件和STRING在線分析平臺，進行網絡拓撲學分析，構建藥物關鍵活性成分-關鍵靶點網絡和藥物-有效成分-核心靶點網絡；基于核心靶點通過DAVID數據庫進行基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。結合質譜分析與數據庫篩選得到藥物活性成分24個，藥物靶點147個，疾病靶點1483個，共同靶點106個，關鍵活性成分23個；經蛋白質相互作用分析及網絡拓撲分析后，獲取核心靶點10個，分別是腫瘤壞死因子、白細胞介素-6、細胞腫瘤抗原p53、白細胞介素-1β、血管內皮生長因子A、表皮生長因子受體、分裂原活化蛋白激酶3、半胱氨酸蛋白酶3、基質金屬蛋白酶9、纖連蛋白1，藥物有效成分5個，包括槲皮素、異鼠李素、漢黃芩素、柚皮素、兒茶素；GO富集到基因功能69個，KEGG富集到基因通路70條，分析結果表明，麻杏止哮顆粒治療哮喘的作用機制是通過調節(jié)晚期糖基化終末化產物-晚期糖基化終末產物受體信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、分裂原活化蛋白激酶信號通路、白細胞介素-17信號通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信號通路、人類巨細胞病毒感染通路等來發(fā)揮治療哮喘的作用。初步揭示了麻杏止哮顆粒治療哮喘的有效成分和作用機制，為麻杏止哮顆粒藥效物質基礎研究奠定基礎，為質量控制提供參考依據。

麻杏止哮顆粒；哮喘；UPLC-Q-TOF-MS/MS；網絡藥理學；槲皮素；異鼠李素；漢黃芩素；柚皮素；兒茶素

支氣管哮喘，簡稱哮喘，是由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性呼吸系統(tǒng)疾病。我國乃至全球的支氣管哮喘發(fā)病率正在逐年上升，據全球哮喘防治創(chuàng)議預計，2025年全球哮喘患者將增加至4億[1]。哮喘造成的疾病負擔嚴重影響了患者生活質量，造成了巨大的個人和社會經濟負擔。目前，如何防治哮喘已成為我國醫(yī)學界所面臨的重要課題之一。中醫(yī)在治療支氣管哮喘方面有著獨特的優(yōu)勢，遵循整體觀念和辨證論治的原則，通常采用多種治療手段、給藥途徑相結合，不僅可以改善患者的癥狀，同時可以改善肺功能、炎癥反應等，而且可以消除病理產物，縮短療程，增強體質，提高抗病能力，預防復發(fā)[2]。

麻杏止哮顆粒是江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司研制的治療哮喘的現代中藥，處方由蜜麻黃、苦杏仁、桑白皮、黃芩、前胡、甘草等13味藥組成。其功能主治為宣肺平喘、清熱化痰、息風解痙，用于支氣管哮喘慢性持續(xù)期，癥見喘息、氣急、胸悶、咳嗽、咽喉不利等屬熱哮證者。麻杏止哮顆粒對于哮喘表現出良好的臨床治療效果，但是該處方潛在的有效成分及作用機制尚不明確。因此，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術對麻杏止哮顆粒的化學成分進行分析和鑒定，以網絡藥理學為主要研究方法，對麻杏止哮顆粒治療哮喘的有效成分和作用靶點進行篩選，揭示麻杏止哮顆粒治療哮喘的作用機制，為麻杏止哮顆粒的臨床應用及后續(xù)研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290 infinity超高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），Agilent 6538 Q-TOF質譜儀（美國安捷倫公司）；Musshunter 色譜工作站和Qualitative Analysis質譜分析軟件；Mettler Toledo AL204型萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；Mettler Toledo XP6型百萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KB-500DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TG16MW型臺式高速離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；Milli-Q型超純水儀（美國密理博公司）。

1.2 試藥

麻杏止哮顆粒（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號200801）；甲醇（分析純，批號20211105，國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈（質譜純，批號21125087，MTEDIA）；甲酸（質譜純，批號202674，賽默飛世爾科技（中國）有限公司），超純水（自制）。對照品精氨酸（批號140685-201707，質量分數99.9%）、蔗糖（批號111507-201704，質量分數100.0%）、纈氨酸（批號140681-201703，質量分數99.5%）、酪氨酸（批號140609-201914，質量分數99.9%）、沒食子酸（批號110831-201906，質量分數91.5%）、苯丙氨酸（批號111615-200301，質量分數100.0%）、鹽酸偽麻黃堿（批號171237-201510，質量分數99.8%）、綠原酸（批號110753-2021119，質量分數98.0%）、異綠原酸A（批號111782-201807，質量分數94.3%）、異綠原酸C（批號111894-202103，質量分數89.6%）、原兒茶酸（批號110809-201205，質量分數99.9%）、甘草苷（批號111610-201908，質量分數95.0%）、迷迭香酸（批號111871-202007，質量分數98.1%）、黃芩苷（批號110715-202122，質量分數94.2%）、漢黃芩苷（批號112002-201702，質量分數98.5%）、漢黃芩素（批號111514-201706，質量分數95.0%）、蘆丁（批號100080-201409，質量分數92.6%）、次野鳶尾黃素（批號111557- 201703，質量分數99.9%）、白花前胡甲素（批號111711-201904，質量分數99.4%）、白花前胡乙素（批號111904-201804，質量分數98.9%）、黃芩素（批號111595-201808，質量分數97.9%）、琥珀酸（批號110896-200001，質量分數95.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院；異綠原酸B（批號MUST-22010705，質量分數98.27%）購自成都曼思特生物科技有限公司；芹糖甘草苷（批號wkq918020107，質量分數98.0%）購自四川省維克奇生物科技有限公司；毛蕊異黃酮（批號ST08810120-10103，質量分數98.0%）、甘草酸（批號RS00661020-5559，質量分數96.3%）均購自上海詩丹德標準技術服務有限公司；千層紙素苷（批號M20H182557，質量分數98.0%）購自上海源葉生物科技有限公司；白花前胡丙素（批號180927，質量分數98.0%）購自南京森貝伽生物科技有限公司；新綠原酸（批號BCBL3529V，質量分數98.0%）購自Sigma公司；天冬氨酸（批號A1330000-0077Q5，質量分數99.9%）購自European Pharmacopoeia Reference Standard公司。

1.3 數據庫與軟件

中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）；DisGeNET數據庫（https://www.disgenet.org/）；Genecards數據庫（http:// www.genecards.org/）；Unitprot數據庫（http://www. Unitprot.org/）；STRING平臺（https://string-db.org/）；Cytoscape 3.9.1軟件（https://cytoscape.org/）；DAVID數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）；韋恩圖繪制平臺（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）；微生信在線平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 麻杏止哮顆粒研成細粉后，取粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，超聲處理（500 W、40 kHz）30 min，放冷，搖勻，離心，取上清液過0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取對照品酪氨酸、芹糖甘草苷、白花前胡丙素、天冬氨酸和毛蕊異黃酮各1 mg及其余25個對照品各5 mg，置于50 mL棕色量瓶中，加入甲醇并定容至刻度，制備成酪氨酸、芹糖甘草苷、白花前胡丙素、天冬氨酸和毛蕊異黃酮質量濃度均為20 μg/mL，及其余25個對照品質量濃度均為100 μg/mL的混合對照品溶液，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱：Waters Atlantis T3C18（150 mm×4.6 mm，3 μm）色譜柱；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～5 min，0～5% B；5～12 min，5%～11% B；12～20 min，11%～19% B；20～22 min，19%～20% B；22～27 min，20% B；27～34 min，20%～30% B；34～44 min，30%～40% B；44～56 min，40%～90% B；56～58 min，90%～100% B；58～60 min，100% B；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；檢測波長300 nm。

2.3 質譜條件

離子化模式為電噴霧正、負離子模式，正負離子源電壓均為4000 V，離子掃描范圍為/100～3000，干燥氣體積流量10 L/min，干燥氣溫度350 ℃，霧化壓力344.75 kPa，錐孔電壓65 V，裂解電壓135 V，二級碰撞能量分別采用10、20、30、40 eV。

2.4 化學成分分析

結合查閱中英文相關文獻與搜索TCMSP在線數據庫，收集麻杏止哮顆粒組方13味藥材的化學成分信息，建立化合物數據庫。通過對麻杏止哮顆粒樣品進行一級質譜分析，利用Musshunter色譜工作站和Qualitative Analysis質譜分析軟件生成化合物分子式，選擇誤差在5×10?6以內的分子式進行數據庫自動匹配，快速指認可能的化合物；進而選擇目標化合物進行二級質譜掃描，得到化合物的碎片離子信息，結合對照品裂解規(guī)律以及文獻資料對目標化合物進行鑒定和分析，并對藥材來源進行歸屬。

2.5 藥物活性成分及對應靶點篩選、哮喘疾病靶點預測

基于“2.4”項藥物質譜分析得到的結果，通過TCMSP篩選口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18的活性成分，同時查找活性成分對應的靶點蛋白，通過Unitprot數據庫確定靶點蛋白的基因簡稱。以“asthma”為關鍵詞對DisGeNET數據庫和Genecards數據庫進行檢索，對哮喘的相關基因進行檢索，將搜索結果整合去重后，建立哮喘的預測靶點庫。

2.6 藥物關鍵活性成分-關鍵靶點的網絡構建

利用韋恩圖在線繪制工具將藥物活性成分的作用靶點與疾病靶點進行匹配映射，獲得兩者共同的基因即麻杏止哮顆粒治療哮喘的關鍵作用靶點，將關鍵作用靶點對應的活性成分預測作為麻杏止哮顆粒治療哮喘疾病的關鍵活性成分，以Cytoscape3.9.1軟件構建麻杏止哮顆粒“關鍵活性成分-關鍵靶點”網絡。

2.7 藥物有效成分-核心靶點的網絡構建

將關鍵作用靶點上傳至STRING平臺，物種設為“Homo sapiens”，設定高級篩選條件“high confidence（0.700）”，構建關鍵靶點蛋白相互作用關系網絡圖；將得到的結果以TSV格式下載并保存，導入Cytoscope3.9.1軟件，利用其中的“Network Analyzer”功能進行網絡拓撲學分析。利用連接度（degree）、介度（betweeness）、緊密度（closeness）3個拓撲參數進行篩選，首次篩選以degree值中位數的2倍作為篩選條件，第二次篩選取degree、betweeness、closeness這3個參數的中位數作為篩選條件，篩選后獲得核心靶點，構建核心靶點篩選過程網絡圖。將核心靶點對應的活性成分預測作為麻杏止哮顆粒治療哮喘疾病的有效成分，將兩者導入Cytoscope 3.9.1軟件構建“麻杏止哮顆粒有效成分-核心靶點”網絡圖。

2.8 基因本體（gene ontology，GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

利用DAVID數據庫對核心靶點基因進行GO功能分析和KEGG通路富集分析，物種設為“Homo sapiens”，設定＜0.01，分析麻杏止哮顆粒的潛在生物學過程和通路，根據富集基因數目由多到少進行降序排列，利用微生信平臺對位居前列的生物學過程和通路繪制GO功能富集分析柱狀圖和KEGG通路富集分析氣泡圖。

3 結果

3.1 化學成分分析

麻杏止哮顆粒樣品和混合對照品的正、負離子模式的總離子流圖見圖1。共鑒定和推測出121個化合物，其中30個化合物經對照品比對得到驗證，見表1。

A-麻杏止哮顆粒正離子 B-麻杏止哮顆粒負離子 C-混合對照品正離子 D-混合對照品負離子

3.2 藥物活性成分及對應靶點篩選、哮喘疾病靶點預測

基于質譜分析結果，通過TCMSP篩選得到24個藥物活性成分，具體信息見表2，檢索活性成分對應的作用靶點共147個。通過DisGeNET數據庫和Genecards數據庫，檢索哮喘的作用靶點，分別以Score≥0.1及Score≥1為參數對作用靶點結果進一步篩選，獲得哮喘疾病的作用靶點1483個。

表1 麻杏止哮顆粒中化學成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS鑒定

Table 1 Identification of chemical components in Maxing Zhixiao Granules by UPLC-Q-TOF-MS/MS

峰號tR/min離子模式檢測值(m/z)理論值(m/z)誤差(×10?6)分子式化合物離子碎片 (m/z)歸屬 10.626[M－H]?271.171 2271.170 4 2.93C18H24O2雌二醇[3]119.975 0、183.921 5B 21.663[M＋H]+175.118 3175.119 0 3.76C7H10O5精氨酸[4]*112.086 7、158.090 8B、E～G 31.750[M＋H]+133.096 9133.097 2?2.25C5H12N2O2鳥氨酸[4]116.033 6E 41.769[M＋H]+134.044 9134.044 8 0.46C4H7NO4天冬氨酸[4]*88.039 2、90.900 4、116.034 6B、E、G、K 51.968[M－H]?181.071 7181.071 8?0.38C6H14O6甘露醇[4]89.023 7、101.024 6、163.060 2F、H 62.233[M＋H]+116.070 3116.070 6?2.28C5H9NO2脯氨酸[4]70.065 1、72.936 2、98.057 6B、E、G、J 72.338[M－H]?341.107 9341.108 9?2.88C12H22O11蔗糖[4]*119.034 6J 82.393[M＋H]+187.039 8187.039 0 4.52C11H6O3異補骨酯素[5]103.056 7、131.087 0H 92.635[M－H]?359.149 0359.150 0?2.67C20H24O6異落葉松脂素[6]313.119 7F 102.651[M＋H]+118.086 7118.086 3 3.09C5H11NO2纈氨酸[4]*55.054 4、72.081 2B、E、G、J、K 112.931[M－H]?133.014 3133.013 4 0.47C4H6O5蘋果酸[7]71.014 6、115.003 3J 124.004[M＋H]+136.062 2136.061 8 3.00C5H5N5腺嘌呤[4]119.033 0、136.060 7G 134.269[M＋H]+243.232 1243.231 9 0.79C15H30O2十五烷酸[8]131.048 2A、C、G、J、K 144.288[M＋H]+124.039 5124.039 3 1.49C6H5NO2煙酸[8]78.034 1、80.049 1、106.028 5G 154.887[M＋H]+148.060 8148.060 4 2.91C5H9NO4谷氨酸[4]85.034 6、102.994 5、130.118 6B、E～G、 K 165.553[M－H]?117.019 2117.019 3?1.18C4H6O4琥珀酸[8]*73.030 7、99.025 7C、G、J、K 175.843[M－H]?180.066 2180.066 1 0.78C9H11NO3酪氨酸[4]*119.050 0、163.039 3E～G、K 185.981[M＋H]+276.144 7276.144 2 1.93C12H21NO6glutarylcarnitine[8]161.073 4、212.129 5、230.138 0、258.130 9G 196.624[M＋H]+137.046 2137.045 8 2.75C5H4N4O次黃嘌呤[8]110.030 7、119.033 9、120.970 0F、G、J、K 206.729[M＋H]+268.104 2268.104 0 0.61C10H13N5O4腺苷[8]136.061 2、119.034 6G、I、J 216.754[M＋H]+100.075 8100.075 7 0.66C5H9NO2-哌啶酮[8]55.934 5、58.029 2、59.450 2、72.937 7G 227.024[M＋H]+166.123 4166.122 6 4.78C10H15NO麻黃堿[9]117.026 5、133.082 6、148.114 3A、K 237.270[M＋H]+284.100 0284.098 9 4.02C10H13N5O5鳥苷[8]152.056 6E、G 247.307[M＋H]+269.089 0269.088 0 3.58C10H12N4O5肌苷[8]137.045 8E、G、K 257.932[M－H]?169.013 9169.014 2?1.69C7H6O5沒食子酸[10]*169.010 2、289.660 1H～K 268.516[M＋H]+166.086 2166.086 3?0.35C9H11NO2苯丙氨酸[4]*103.054 1、120.080 3E～G、J 279.112[M＋H]+310.129 1310.128 5 2.06C15H19NO6(S)-2-{[ (benzyloxy)carbonyl]amino}-5-ethoxy- 5-oxopentanoic acid[8]120.081 2、178.085 8、264.118 7、292.126 4G 289.143[M＋H]+152.107 5152.107 0 3.48C9H13NO去甲麻黃堿[9]117.069 3、134.095 4A 299.250[M＋H]+152.107 0152.107 0 0.11C9H13NO去甲偽麻黃堿[9]117.069 6、134.098 3A 309.285[M＋H]+328.139 7328.139 1 1.70C15H21NO7果糖苯丙氨酸[8]132.081 1、166.088 9、264.118 7、310.125 1G 3110.761[M＋H]+243.086 8243.087 7?3.49C12H10N4O27,8-二甲基苯并蝶啶-2,4-二酮7[8]157.007 0G 3211.440[M＋H]+166.122 5166.122 6?0.71C10H15NO偽麻黃堿[9]*117.056 8、133.087 7、148.111 6A、K 3311.829[M－H]?153.019 9153.019 3 3.70C7H6O4原兒茶酸[11]*91.018 4、109.028 6A、C、E、 K、M

續(xù)表1

峰號tR/min離子模式檢測值(m/z)理論值(m/z)誤差(×10?6)分子式化合物離子碎片 (m/z)歸屬 3412.947[M－H]?315.052 0315.051 0 3.02C16H12O7異鼠李素[12]107.385 3、300.012 2I、M 3516.368[M＋H]+181.050 1181.049 5 3.19C9H8O4咖啡酸[11]117.030 6、145.027 8、163.038 1J、K 3616.522[M－H]?353.086 2353.087 8?4.58C16H18O9新綠原酸[13]*135.044 2、179.074 7、191.056 9C 3716.535[M＋H]+163.039 5163.038 9 3.33C9H6O37-羥基香豆素[7]107.048 2、117.031 7、135.042 5、145.027 4C、H、J 3816.683[M－H]?353.086 2353.087 8?4.58C16H18O9綠原酸[13]*191.057 9、179.046 7J 3916.801[M＋H]+458.166 3458.165 7 1.32C20H27NO11苦杏仁苷[9]296.110 3B 4018.764[M＋H]+295.128 5295.128 8?1.10C14H18N2O5谷氨酰苯丙氨酸[8]103.053 8、120.079 9G 4121.324[M－H]?303.050 1303.051 0?3.12C15H12O72, 3-二氫槲皮素[14]125.025 2C 4221.373[M＋H]+565.155 7565.155 2 0.82C26H28O14異夏佛塔苷[15]481.108 0、511.118 2M 4321.342[M＋H]+325.144 6325.143 4 3.84C20H20O4光甘草定[16]189.017 2B、M 4421.694[M＋H]+366.190 8366.191 1?0.90C19H27NO6氧化苦參堿[7]150.091 5、168.101 5J 4521.750[M＋H]+366.190 8366.191 1?0.90C19H27NO6腎形千里光堿/新克式千里光寧堿及其他同分異構體[13]122.060 4、150.091 1、168.101 2J 4622.206[M＋H]+579.171 2579.170 8 0.63C27H30O14牡荊素-2-O-鼠李糖苷[17]284.839 0、433.118 1A 4723.342[M＋H]+549.160 7549.160 8 0.68C26H28O13白楊素-6-C-阿拉伯糖- 8-C-葡萄糖苷[18]375.082 0、393.092 3、411.113 7、513.143 3D 4823.714[M－H]?547.143 9547.145 7?3.28C26H28O13chrysin-6-C-β-L-arabino-pyranosyl-8-C-β-D-glucopyranoside[19]427.100 7、457.111 2、487.119 9、547.146 2D 4923.967[M－H]?549.161 0549.161 4?0.76C26H30O13芹糖甘草苷[20]*135.008 6、255.059 4、417.119 5M 5024.028[M－H]?417.119 3417.119 1 0.56C21H22O9新甘草苷/異甘草苷/新異甘草苷[9]135.040 4、255.065 9M 5124.084[M＋H]+611.160 6611.160 6?0.13C27H30O16蘆丁[7]*303.049 0、465.065 2C、J 5224.319[M＋H]+257.081 4257.080 8 2.52C15H12O4甘草素/異甘草素[9]119.083 5、137.005 6、147.045 7B、M 5324.473[M－H]?417.118 9417.119 1?0.56C21H22O9甘草苷[9]*135.093 0、255.062 4B、M 5424.591[M＋H]+419.133 9419.133 7 0.56C21H22O9新異甘草苷[20]255.062 4、419.209 0M 5525.018[M－H]?301.034 8301.035 4?2.15C15H10O7槲皮素[12]107.014 6、121.027 1、151.004 3、179.096 4A、C、F、 H～J、M 5625.099[M－H]?301.034 8301.035 4?2.15C15H10O7粘毛黃芩素Ⅰ[10]283.023 5D 5725.641[M＋H]+387.156 4387.155 1 3.23C20H22N2O6N-acetyldopamine dimer A[21]150.056 3、192.062 8、269.078 5、328.116 2E 5827.188[M＋H]+301.071 2301.070 7 1.82C16H12O65,7,2'-三羥基-6-甲氧基黃酮[18]117.072 5、286.037 3D 5927.425[M－H]?515.117 9515.119 5?3.16C25H24O12異綠原酸B[13]*135.041 5、179.032 4、191.061 2J 6029.166[M－H]?515.117 9515.119 5?3.16C25H24O12異綠原酸A[13]*135.041 4、173.042 6、179.032 8、353.083 2J 6131.146[M＋H]+523.144 2523.144 6?0.71C24H26O13野鳶尾苷[22]346.062 5、361.091 5I 6231.546[M－H]?515.118 0515.119 5?3.16C25H24O12異綠原酸C[13]*135.042 4、161.022 6、173.046 8、179.033 3、 191.056 4、353.085 9J 6332.244[M－H]?359.077 2359.077 2?0.13C18H16O8迷迭香酸[11]*123.043 6、135.042 0、179.033 2、197.044 4A、L 6432.788[M＋H]+477.103 4477.103 3 1.36C22H20O125,7,2'-三羥基-6-甲氧基黃酮-7-O-葡萄糖醛酸苷[18]301.068 6D 6533.437[M－H]?549.160 1549.161 4?2.32C26H30O13芹糖異甘草苷[23]255.066 0M 6633.497[M－H]?415.101 6415.103 5?4.52C21H20O9芹菜素-5-鼠李糖苷[17]285.653 4A 6733.775[M＋H]+431.135 1431.133 7 3.31C22H22O9芒柄花苷[9]269.079 8M

續(xù)表1

峰號tR/min離子模式檢測值(m/z)理論值(m/z)誤差(×10?6)分子式化合物離子碎片 (m/z)歸屬 6834.449[M＋H]+447.091 3447.094 7?2.00C21H18O11黃芩苷[24]*271.059 3D 6934.498[M＋H]+271.060 2271.058 9 0.29C15H10O5芹菜素[24]242.050 1、269.004 2A、D、I、L、M 7035.034[M－H]?431.096 5431.098 4?4.49C21H20O10芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷[25-26]65.005 7、83.597 4、182.946 8、269.045 7D 7135.514[M－H]?287.055 4287.056 1?2.43C15H12O6二氫山柰酚[25]125.023 8、201.055 2I 7235.938[M＋H]+273.077 6273.075 7 3.26C15H12O5柚皮素[20]255.063 2A、M 7335.988[M＋H]+291.087 1291.086 3 2.83C15H14O6兒茶素[26]206.959 6、273.068 9A、B 7436.189[M－H]?445.075 6445.077 6?4.41C21H18O11芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷[27]269.045 1D 7536.613[M＋H]+301.070 5301.070 7?0.72C16H12O6韌黃芩素Ⅱ[18]286.046 3D 7636.787[M＋H]+477.102 7477.103 3?0.27C22H20O125,7,8-三羥基-6-甲氧基黃酮-7-O-葡萄糖醛酸苷[18]301.068 6D 7737.131[M＋H]+431.097 4431.097 8 0.18C21H18O10白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷[18]255.059 9D 7837.212[M＋H]+461.106 9461.108 4?1.91C22H20O11千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷[18]*270.049 4、285.074 4D 7937.570[M＋H]+477.102 8477.103 3 0.01C22H20O125,6,7-三羥基-8-甲氧基黃酮-7-O-葡萄糖醛酸苷[18]301.069 4D 8038.351[M－H]?283.060 2283.061 2?3.63C16H12O5千層紙素A[10]268.038 0D 8138.426[M－H]?283.060 3283.061 2?3.63C16H12O5漢黃芩素[10]*239.034 6、268.037 8D 8238.426[M－H]?283.060 2283.061 2?3.63C16H12O5櫻黃素[12]167.995 2、257.315 1I、M 8338.545[M＋H]+461.107 9461.109 0 0.28C22H20O11漢黃芩苷[24]*285.075 8D 8438.879[M＋H]+491.119 7491.119 0 2.67C23H22O125,7-二羥基-6,8-二甲氧基黃酮-7-O-葡萄糖醛酸苷[18]300.063 4、315.087 3D 8539.177[M＋H]+487.143 5487.145 2?2.34C21H26O137-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyra-nosyl-scopoletin[9]80.950 7、253.017 0、279.196 5H 8641.621[M＋H]+475.124 4475.124 0 1.83C23H22O11黃芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷乙酯[18]271.056 5D 8741.774[M＋H]+217.050 0217.049 5 2.38C12H8O4佛手苷內酯/花椒毒素[9]161.118 2、174.031 9、202.023 7H 8842.233[M－H]?299.055 6299.056 1?1.52C16H12O6粗毛豚草素[27]255.030 2、284.030 5I 8942.659[M＋H]+301.071 4301.070 7 2.37C16H12O6柯伊利素[28]153.020 4J 9042.677[M＋H]+331.081 9331.081 2 2.06C17H14O7苜蓿素[29]331.083 6I 9142.778[M－H]?329.066 8329.066 7 0.04C17H14O7槲皮素-3,3'-二甲醚[12]243.028 4、271.024 0、299.017 8、314.047 1M 9243.023[M＋H]+271.061 0271.060 6 1.99C15H10O5去甲漢黃芩素[18]241.047 2、253.038 6D 9343.097[M＋H]+271.060 7271.060 6 0.74C15H10O5黃芩素[24]*242.053 7D 9444.598[M＋H]+219.102 2219.101 6 2.63C13H14O32,2-二甲基-6-乙酰基苯駢二氫吡喃酮[13]77.034 0、107.049 5、121.027 0J 9544.730[M－H]?837.390 8837.391 4?0.77C42H62O17甘草皂苷G2[23]193.034 1、351.055 7M 9645.110[M＋H]+257.247 0257.247 5?1.87C16H32O2棕櫚酸[8]199.066 4A～D、G、 H、J～L 9746.753[M＋H]+471.347 1471.346 9 0.41C30H46O4甘草次酸[24]189.168 1、453.338 6M 9846.965[M－H]?821.395 9821.396 5?0.77C42H62O16甘草酸[23]*193.032 8、351.053 9、645.337 8、803.368 8B、M

續(xù)表1

峰號tR/min離子模式檢測值(m/z)理論值(m/z)誤差(×10?6)分子式化合物離子碎片 (m/z)歸屬 9947.798[M－H]?225.184 9225.186 0?4.99C14H26O29-十四碳烯酸[8]139.000 7、165.052 3、167.040 3G 10048.371[M＋H]+387.106 7387.107 4?1.81C20H18O8次野鳶尾黃素[30]*326.077 6、341.066 1、357.060 4、372.083 2I 10148.828[M＋H]+285.076 6285.075 7 3.13C16H12O5毛蕊異黃酮[12]*225.049 9、270.051 2M 10249.076[M＋H]+359.077 2359.076 1 3.17C18H14O8白射干素[31]181.013 2I 10349.205[M＋H]+375.107 2375.107 4?0.48C19H18O8黃芩黃酮Ⅱ[18]327.048 1、345.059 7、360.080 7D 10449.423[M＋H]+375.107 2375.108 0?0.48C19H18O85,6-二羥基-6,8,2',3'-四甲氧基黃酮[18]345.056 9、360.083 7D 10549.446[M＋H]+347.221 8347.112 5 0.91C18H18O73′,4′-二乙酰氧基凱爾消旋內酯[9]245.075 8H 10651.051[M＋H]+279.232 2279.231 9 1.22C18H30O2亞麻酸[8]149.133 9A、B、F、G、K、L 10752.570[M＋H]+343.117 9343.117 6 0.81C19H18O6(+)-3'-當歸酰氧基-4'-氧代-3',4'-二氫葉黃素[9]227.026 0H 10852.583[M＋H]+343.117 9343.117 6 0.81C19H18O6前胡香豆素E[9]261.563 1H 10952.912[M＋H]+345.133 7345.133 3 1.20C19H20O63'-isovaleryl-4'-ketokhellactone[9]243.064 3、261.074 9H 11053.543[M＋H]+329.138 8329.138 4 1.27C19H20O5絲立尼亭[32]227.067 9、245.081 5H 11153.580[M＋H]+387.145 3387.143 8 3.78C21H22O7北美芹素[9]287.551 4、227.067 8、245.075 4H 11253.673[M＋H]+287.092 3287.091 4 3.22C16H14O5甘草查耳酮B[33]245.080 2B、M 11353.846[M＋H]+345.132 8345.133 3?1.59C19H20O6(+)-(3'S,4'R)-3'-當歸酰凱林內酯[9]227.067 4、327.199 4、245.080 1H 11453.956[M＋Na]+409.125 8409.125 8?0.51C21H22O7白花前胡甲素[9]*227.071 2、327.123 3H 11556.126[M＋H]+279.159 6279.159 1 1.75C16H22O4鄰苯二甲酸二丁酯[34]93.033 5、121.027 1、149.023 0A、B、L、M 11656.150[M＋H]+427.175 0427.175 1?0.03C24H26O7白花前胡丁素[9]227.068 7H 11756.441[M＋H]+391.248 9391.247 9 2.56C23H34O5款冬酮[13]147.079 3、175.147 4J 11856.484[M＋H]+427.175 1427.175 1?0.03C24H26O7白花前胡乙素[9]*227.066 5H 11956.997[M＋H]+429.191 0429.190 8 0.55C24H28O7白花前胡丙素[9]*327.116 3H 12057.238[M＋H]+327.121 7327.122 7?3.10C19H18O5桑辛素O[35]133.080 0C 12157.893[M＋H]+329.138 4329.138 4?0.06C19H20O5紫花前胡素[36]229.084 1H

*與對照品比對確認的成分 A-蜜麻黃 B-苦杏仁 C-桑白皮 D-黃芩 E-蟬蛻 F-僵蠶 G-地龍 H-前胡 I-射干 J-款冬花 K-法半夏 L-紫蘇子 M-甘草

*Compared with the reference substance A-honey-processedB-C-D-E-F-G-Pheretima H-I-J-K-L-M-

3.3 藥物關鍵活性成分-關鍵靶點的網絡構建

利用在線韋恩圖繪制平臺對藥物靶點和疾病靶點交集進行計算并繪制，見圖2，兩者交集為關鍵靶點共106個，將關鍵靶點與其對應的23個關鍵活性成分導入Cytoscape3.9.1軟件構建麻杏止哮顆粒“關鍵活性成分-關鍵靶點”網絡，見圖3。

3.4 藥物有效成分-核心靶點網絡構建

將106個關鍵靶點基因上傳至STRING平臺，構建關鍵靶點蛋白相互作用關系網絡圖，該網絡一共含有靶蛋白節(jié)點106個，靶點蛋白間的相互作用關系連線698條，平均度值13.2，平均介數0.504，見圖4。利用Cytoscope 3.9.1軟件對構建的蛋白間相互作用（protein-protein interactions，PPI）網絡進行拓撲學分析，首先以degree值中位數的2倍作為篩選條件，然后同時選取degree、betweeness、closeness這3個參數的中位數作為篩選條件（分別為26、0.028 8、0.505 0），篩選得到核心靶點10個，包括腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL6）、細胞腫瘤抗原p53（cellular tumor antigen p53，TP53）、白細胞介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、分裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3，CASP3）、基質金屬蛋白酶 9（matrix metalloproteinase-9，MMP9）、纖連蛋白1（fibronectin，FN1），核心靶點篩選過程網絡圖見圖5，核心靶點信息見表3。核心靶點對應的有效成分有5個，分別是槲皮素、異鼠李素、漢黃芩素、柚皮素、兒茶素。將核心靶點與其對應的有效成分進行可視化分析，構建“麻杏止哮顆粒-有效成分-核心靶點”網絡，見圖6。

表2 麻杏止哮顆?；钚猿煞值幕拘畔?/p>

Table 2 Basic information on active ingredients of Maxing Zhixiao Granules

序號Mol ID成分名稱OB/%DL/% 1MOL000098槲皮素46.430.28 2MOL000417毛蕊異黃酮47.750.24 3MOL002927黃芩黃酮Ⅱ69.510.44 4MOL013077紫花前胡素39.270.38 5MOL013078白花前胡丙素51.220.66 6MOL004908光甘草定53.250.47 7MOL004961槲皮素-3,3'-二甲醚46.450.33 8MOL004841甘草查耳酮B76.760.19 9MOL000354異鼠李素49.600.31 10MOL004576二氫槲皮素57.840.27 11MOL001735粗毛豚草素30.970.27 12MOL012719桑辛素O62.330.44 13MOL003044柯伊利素35.850.27 14MOL001792甘草素32.760.18 15MOL0005255,7,8-三羥基黃酮39.400.21 16MOL004903甘草苷65.690.74 17MOL013079白花前胡甲素46.460.53 18MOL000492兒茶素54.830.24 19MOL002714黃芩素33.520.21 20MOL010023氧化苦參堿56.160.41 21MOL002776黃芩苷40.120.75 22MOL004328柚皮素59.290.21 23MOL000173漢黃芩素30.680.23 24MOL002928千層紙素A41.370.23

圖2 藥物與哮喘交集靶點

3.5 GO功能分析及KEGG通路富集分析

對10個核心靶點基因進行GO功能分析和KEGG通路富集分析，篩選出69條GO分析結果，包括生物過程（biological process，BP）60個，細胞組分（cellular component，CC）5個，分子功能（molecular function，MF）4個，分別根據靶點富集數目的多少進行排序，將排名靠前的結果繪制柱狀圖（圖7）。BP分析所示，麻杏止哮顆粒治療哮喘的作用靶點主要涉及的生物過程有基因表達的正向調控、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、蛋白質磷酸化的正調節(jié)、凋亡過程的負調控等。如CC分析可以看出，靶點主要涉及細胞外間隙、細胞外區(qū)、大分子復合物、膜筏、內質網腔。如MF分析所示，靶點主要涉及的分子功能有相同的蛋白質結合、蛋白酶結合、細胞因子活性、整合素結合。

菱形代表關鍵活性成分，圓形代表關鍵靶點

圖4 關鍵靶點蛋白相互作用關系網絡圖

中圈以內為首次篩選結果，內圈為二次篩選結果

表3 10個核心靶點信息

Table 3 10 core targets information

序號靶點簡稱Uniprot ID中文名稱英文名稱 1TNFP01375腫瘤壞死因子tumor necrosis factor 2IL6P05231白細胞介素-6interleukin-6 3TP53P04637細胞腫瘤抗原p53cellular tumor antigen p53 4IL1BP01584白細胞介素-1βinterleukin-1 beta 5VEGFAP15692血管內皮生長因子Avascular endothelial growth factor A 6EGFRP00533表皮生長因子受體epidermal growth factor receptor 7MAPK3P27361分裂原活化蛋白激酶3mitogen-activated protein kinase 3 8CASP3P42574半胱氨酸蛋白酶3caspase-3 9MMP9P14780基質金屬蛋白酶9matrix metalloproteinase 9 10FN1P02751纖連蛋白 1fibronectin

圖6 “麻杏止哮顆粒-有效成分-核心靶點”網絡

此外，富集得到70條KEGG通路，將靶點富集數目排名前20的結果繪制氣泡圖，見圖8，通路信息見表4。分析結果表明，麻杏止哮顆粒治療哮喘的靶點主要涉及的通路有癌癥中的蛋白聚糖、人類巨細胞病毒感染、癌癥通路、脂質和動脈粥樣硬化、MAPK信號通路、TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、乙型肝炎等。

圖7 核心靶點的GO富集分析

圖8 核心靶點的KEGG通路富集分析

表4 核心靶點KEGG通路富集分析部分信息

Table 4 Partial information of core targets KEGG pathway enrichment analysis

編號信號通路P值基因數/個 hsa05205proteoglycans in cancer1.98×10?108 hsa05163human cytomegalovirus infection3.81×10?108 hsa05200pathways in cancer1.53×10?78 hsa04933AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications2.38×10?107 hsa05417lipid and atherosclerosis2.46×10?87 hsa04010MAPK signaling pathway1.60×10?77 hsa05165human papillomavirus infection3.24×10?77 hsa04657IL-17 signaling pathway2.22×10?86 hsa04668TNF signaling pathway5.39×10?86 hsa05161hepatitis B3.44×10?76 hsa05206microRNAs in cancer8.54×10?66 hsa04151PI3K-Akt signaling pathway1.63×10?56 hsa05219bladder cancer6.80×10?85 hsa05133pertussis8.47×10?75 hsa05146amoebiasis2.77×10?65 hsa05135yersinia infection8.99×10?65 hsa05418fluid shear stress and atherosclerosis9.53×10?65 hsa05160hepatitis C1.54×10?55 hsa05164influenza A2.17×10?55 hsa05152tuberculosis2.65×10?55

4 討論

本研究基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術結合多種網絡藥理學在線分析平臺和數據庫，從麻杏止哮顆粒中推測出121個化合物，進而篩選出治療哮喘的23個關鍵活性成分和106個關鍵靶點，通過藥物關鍵活性成分-關鍵靶點網絡的構建，分析得出麻杏止哮顆粒并非通過單一成分、單一靶點治療哮喘，而是多成分、多靶點的作用方式。進一步分析篩選，搭建藥物-有效成分-核心靶點網絡，最終得到麻杏止哮顆粒治療哮喘的5個有效成分和10個核心靶點。

研究證實，槲皮素能夠明顯抑制炎癥細胞因子分泌TNF-α、IL-1β及IL-6達到抗炎效果，還能夠預防過敏原與血小板活化因子所誘導的支氣管阻塞和支氣管高反應[37]。異鼠李素通過顯著降低哮喘小鼠IL-4、IL-5、IL-13、半胱氨酰白三烯受體1（cysteinyl leukotriene receptor 1，Cys LTR1）的表達，有效抑制哮喘中輔助性T細胞2（T helper cell 2，Th2）介導的免疫應答，改變輔助性T細胞1/輔助性T細胞2（Th1/Th2）細胞平衡發(fā)揮抑制炎癥反應的作用[38]。柚皮素具有良好的止咳化痰平喘作用，能夠顯著抑制哮喘大鼠肺部和支氣管的炎癥反應，在體內外模型實驗中證實柚皮素發(fā)揮抗炎的潛在作用機制與抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路有關[39]。漢黃芩素可通過多種機制改善氣道炎癥及肺功能，拮抗哮喘發(fā)病相關的多種因素，如誘導嗜酸性粒細胞凋亡和減弱Th2優(yōu)勢免疫介導過敏性氣道炎癥[40]。

研究發(fā)現，TNF受體中最主要的為TNF-α，TNF-α可以調控細胞因子、黏附分子和黏液素等的表達和釋放，如誘導產生炎癥因子IL-6等。IL-6、TNF-α兩者在氣道炎癥中發(fā)揮著重要作用，參與調節(jié)免疫反應，促進炎癥細胞的合成、釋放炎癥介質，都是支氣管哮喘的主要炎癥因子[41]。VEGFA通過加快愈合低氧而產生的組織損傷，從而參與哮喘氣道的重塑環(huán)節(jié)[42]。Amishima等[43]經研究發(fā)現哮喘患者氣道的支氣管上皮、腺體、平滑肌等均可明顯觀察到EGF及EGFR的免疫反應。CASP3是細胞凋亡的關鍵一環(huán)，可通過內質網通路發(fā)揮調控細胞凋亡的作用，參與支氣管哮喘氣道重塑的過程[44]。

KEGG通路富集分析結果表明，麻杏止哮顆粒治療哮喘的靶點主要涉及的通路有PI3K-Akt信號通路、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、MAPK信號通路、人類巨細胞病毒感染等。其中，PI3K-Akt信號通路與支氣管哮喘氣道重塑密切相關，例如間充質干細胞可以作用于PI3K-Akt 信號通路，通過抑制大鼠哮喘模型的肺部炎癥和氣道重塑從而改善大鼠的哮喘癥狀[45]。MAPK信號通路是介導細胞氧化應激、增殖與凋亡等生命活動的重要信號傳導系統(tǒng)，激活后能夠促使炎性細胞因子生成，對哮喘發(fā)病過程中氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應性均具有重要的調控作用[46]。AGE-RAGE信號通路與炎癥反應密切相關，該通路可以激活 MAPK及NF-κB，影響免疫及產生氧化應激反應[47]。人巨細胞病毒感染與支氣管哮喘也有著密切聯系，它可以使嬰兒細小支氣管的黏膜壁出現充血及水腫，使細支氣管發(fā)生梗阻，嚴重情況可導致患兒死亡[48]?？傊?，通路富集分析結果提示了麻杏止哮顆粒治療哮喘的復雜作用機制。

綜上分析，本研究利用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術結合網絡藥理學方法，對麻杏止哮顆粒治療哮喘的有效成分和作用機制進行了初步預測，為麻杏止哮顆粒藥效物質基礎研究提供理論依據。但是本文的結果是基于生物信息學分析，仍屬于理論水平的探討，麻杏止哮顆粒的組成藥味比如蜜麻黃中有著發(fā)汗、平喘功效的生物堿類等成分尚需做進一步的動物實驗、細胞實驗以及臨床研究，對該方中的藥效物質進行確認，并建立高效的活性評價方法，確定關鍵藥效物質，以期全面的闡述其治療哮喘的作用機制，為其質量標準研究提供更完善的參考依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Exploring effective components and mechanism of action of Maxing Zhixiao Granules in treatment of asthma based on UPLC-Q-TOF-MS/MS and network pharmacology

WANG Yu1, YU Gui-fang2, 3, HU Jun-hua2, 3, ZHOU Mao2, 3, XIAO Wei1,2, 3, WANG Zhen-zhong1,2, 3

1. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China 3. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China

To explore the effective components and mechanism of acion of Maxing Zhixiao Granules in the treatment of asthma based on UPLC-Q-TOF-MS/MS technology and network pharmacology.The active components and related targets of Maxing Zhixiao Granules were screened by UPLC-Q-TOF-MS/MS technology and the database of Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP); The targets of asthma diseases were searched using Disgenet and Genecards databases, and the Venn diagram drawing platform was used to obtain common targets. The information was imported into Cytoscope 3.9.1 software and STRING online analysis platform for network topology analysis to construct drug key active ingredient-key target network diagram and drug-active ingredient-core target network; Gene ontology (GO) and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) were enriched and analyzed by DAVID database based on core targets.Combined with mass spectrometry analysis and database screening, 24 active pharmaceutical ingredients, 147 drug targets, 1483 disease targets, and 106 common targets and 23 key active ingredients were obtained. After protein interaction analysis and network topology analysis, 10 core targets were obtained, including tumor necrosis factor, interleukin-6, cellular tumor antigen p53, interleukin-1 beta, vascular endothelial growth factor A, epidermal growth factor receptor, mitogen-activated protein kinase 3, caspase-3, matrix metalloproteinase-9, fibronectin, five active ingredients, including quercetin, isorhamnetin, wogonin, naringenin, catechin; GO was enriched to 69 gene functions, and KEGG was enriched to 70 gene pathways. The analysis results showed that the mechanism of action of Maxing Zhixiao Granules in the treatment of asthma is to regulate the role of advanced glycation end products-advanced glycation end products receptor signaling pathway in diabetic complications, mitogen-activated protein kinase signaling pathway, interleukin-17 signaling pathway, phosphatidylinositol 3 kinase-protein kinase B signaling pathway, and human cytomegalovirus infection pathway, etc.This study preliminarily revealed the effective components and mechanism of action of Maxing Zhixiao Granules in the treatment of asthma, laying a foundation for the basic research on the pharmacodynamic substances of Maxing Zhixiao Granules and providing a reference for quality control.

Maxing Zhixiao Granules; asthma; UPLC-Q-TOF-MS/MS; network pharmacology; quercetin; isorhamnetin; wogonin; naringenin; catechin

R284.1

A

0253 - 2670(2023)17 - 5508 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.17.005

2023-01-21

科技部國家新藥創(chuàng)制重大專項-中藥經典名方開發(fā)（2015ZX09101043-003）

王 玉（1998—），女，碩士研究生，研究方向為中藥制藥技術與產品開發(fā)。E-mail: 3097076846@qq.com

王振中（1968—），男，博士，高級工程師，主要從事中藥新劑型研發(fā)。E-mail: wzhzh-nj@163.com

[責任編輯 王文倩]