鐵死亡在年齡相關性黃斑變性機制中的研究進展

雷敏 胡麗麗 陳婷 艾明

作者單位：430060湖北省武漢市,武漢大學人民醫(yī)院眼科中心(雷敏,陳婷,艾明);430064湖北省武漢市,武漢大學附屬愛爾眼科醫(yī)院(胡麗麗)

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)是一種累及黃斑部的神經(jīng)退行性視網(wǎng)膜疾病,是發(fā)達國家老年人中心視力不可逆喪失的主要原因[1]。研究數(shù)據(jù)顯示,55～64歲人群中,晚期AMD的患病率為0.2%,而85歲以上人群中可達13.1%[2]。到2040年,全球患有AMD的人數(shù)預計將達到3億左右。因此,AMD將成為一項具有重大社會經(jīng)濟影響的公共衛(wèi)生問題。臨床上將AMD分為早期AMD(中等大小的玻璃膜疣和視網(wǎng)膜色素改變)和晚期AMD(新生血管型和非新生血管型,即“濕性”和“干性”)[1]。AMD的發(fā)病機制尚不清楚,但普遍認為病理性血管發(fā)生、氧化應激、免疫反應及炎癥是其主要病因[3]。玻璃體內(nèi)注射抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)藥物在治療濕性AMD方面非常有效,顯著降低了其致盲率[4]。但是,對于干性AMD尚缺乏有效的治療策略。近年來,越來越多的研究證明,鐵死亡與AMD發(fā)病機制有關的病理性血管發(fā)生、氧化應激、免疫反應及炎癥反應等密切相關[5],本文將對此進行綜述。

1 鐵死亡及其相關機制

鐵死亡是一種由依賴鐵的脂質(zhì)過氧化驅(qū)動,并受多種細胞代謝途徑(包括氧化還原穩(wěn)態(tài)、鐵處理、線粒體活性,以及氨基酸、脂質(zhì)、糖代謝)和各種與疾病相關的信號通路的調(diào)節(jié),不同于細胞凋亡、壞死性凋亡和細胞焦亡的調(diào)節(jié)性細胞死亡程序[6]。鐵死亡與多種病理生理機制有關,如腫瘤抑制、神經(jīng)退行性變、缺血/再灌注損傷和血色素沉積癥等[7-9]。各種氧化和抗氧化途徑將自噬和膜修復機制結合起來,形成了鐵死亡過程中脂質(zhì)過氧化和質(zhì)膜損傷的過程。

1.1 谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)調(diào)節(jié)的鐵死亡途徑 在通過抑制胱氨酸谷氨酸轉(zhuǎn)運受體(Xc-系統(tǒng)-GSH-GPX4)調(diào)節(jié)的鐵死亡途徑中,Xc-系統(tǒng)介導的胱氨酸吸收在鐵死亡中有重要作用[10]。Xc-系統(tǒng)是一種異二聚體胱氨酸/谷氨酸反轉(zhuǎn)運蛋白,由2個核心成分組成:SLC7A11(溶質(zhì)載體家族7成員11:催化亞基)和SLC3A2(溶質(zhì)載體家族3成員2:錨定蛋白)。GPXs在谷胱甘肽(glutathione, GSH)的輔助下介導磷脂氫過氧化物(PL-OOH)還原產(chǎn)生相應的醇(PL-OH),從而抑制鐵死亡。由于SLC7A11的編碼的輕鏈是Xc-系統(tǒng)獨有的亞基,因此SLC7A11表達水平通常與反轉(zhuǎn)運蛋白的活性呈正相關,Xc-系統(tǒng)的抑制會導致SLC7A11的代償性轉(zhuǎn)錄上調(diào)。在鐵死亡誘導劑(erastin)和柳氮磺胺吡啶誘導的鐵死亡中,發(fā)現(xiàn)了SLC7A11上調(diào)[11]。綜上,erastin可通過抑制Xc-系統(tǒng),阻止GPXs的關鍵輔助因子GSH吸收,導致GPXs活性降低,脂質(zhì)活性氧堆積,引起細胞死亡。

1.2 脂質(zhì)過氧化與鐵死亡 致死性脂質(zhì)過氧化物(lipid peroxide, LPO)的累積是鐵死亡的主要特征。脂質(zhì)過氧化的激活最終導致PL-OH脂質(zhì)自由基、LPO的分解產(chǎn)物以及氧化和修飾蛋白質(zhì)的堆積,這種連鎖反應導致細胞器膜和細胞膜破裂[12]。在鐵存在的情況下,細胞膜脂質(zhì)的多不飽和脂肪酸 (polyunsaturated fatty acids, PUFAs)鏈能夠經(jīng)過一系列反應形成脂質(zhì)活性氧[8],這些脂質(zhì)氫過氧化物能形成有毒性的脂質(zhì)自由基損傷細胞。同時,這些自由基能轉(zhuǎn)移鄰近PUFAs的質(zhì)子,啟動新一輪的脂質(zhì)氧化反應,加劇氧化損傷。Shintoku等[13]發(fā)現(xiàn),脂加氧酶(LOX)的過表達增強了erastin和RAS-selective-lethal-3(RSL3)誘導的鐵死亡,而LOX抑制劑可減少PUFA片段的累積,阻止其鐵死亡過程。某些LOXs是PUFAs的非依賴性血紅素雙加氧酶,可以直接氧化生物膜上的PUFAs和含PUFA的脂質(zhì),誘導鐵死亡。因此,脂質(zhì)過氧化介導的細胞損傷是鐵死亡所必需的環(huán)節(jié)。

1.3 鐵死亡代謝 多種代謝途徑(如脂肪生成、自噬和線粒體三羧酸循環(huán))和信號通路(如E-cadherin-NF2-Hippo-YAP通路、AMPK信號通路以及p53和BAP1通路)在鐵死亡中起著重要作用[6]。Gao等[14]證明了自噬通過調(diào)節(jié)細胞鐵穩(wěn)態(tài)和活性氧(ROS)的產(chǎn)生在調(diào)節(jié)鐵死亡中發(fā)揮重要作用。鐵誘導使自噬激活,細胞鐵蛋白降解,不穩(wěn)定鐵積累,鐵蛋白吞噬受體介導鐵蛋白吞噬促進鐵死亡。Yu等[15]的研究發(fā)現(xiàn),抑制葡萄糖的主要營養(yǎng)傳感器O-GlcNAcylation修飾可以促進鐵自噬,使活性鐵向線粒體積聚,增強自噬能力,釋放出更多不穩(wěn)定鐵,使細胞對鐵死亡更敏感。Lee等[16]發(fā)現(xiàn),在缺乏葡萄糖的情況下,磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)被激活,可擾亂PUFAs的生物合成來對抗鐵死亡。而Song等[17]認為,AMPK在Beclin1(BECN1)的磷酸化中增加與SLC7A11的結合,從而促進鐵死亡。YAP以多種鐵死亡調(diào)控因子為靶標,與鐵死亡的易感性相關的Hippo通路的活性隨著Hippo的抑制和YAP的激活而增加[18]。Jiang等[19]用ROS干預p53基因沉默的細胞,細胞活性沒有變化,但激活p53基因后再用ROS處理,細胞死亡率高達90%,說明p53基因激活后細胞抗氧化能力顯著降低。同時發(fā)現(xiàn)p53通過與SLC7A11啟動子結合位點(p53-BS)結合來抑制SLC7A11轉(zhuǎn)錄,抑制Xc-系統(tǒng)吸收胱氨酸,使胱氨酸依賴的GSH過氧化物酶活性降低,細胞抗氧化能力降低,脂質(zhì)活性氧水平升高,引起細胞鐵死亡。

1.4 鐵死亡中的鐵 鐵是一種氧化還原活性金屬,其輸入、儲存和輸出之間的不平衡,可能會影響細胞對鐵死亡的易感性。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達增加會增強鐵的輸入,引發(fā)膠質(zhì)瘤細胞中的鐵死亡。核受體共激活因子4介導鐵蛋白自噬傳遞到溶酶體,通過增加細胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵池 (LIP)的水平來調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化和鐵死亡[20]。近來,Prominin2蛋白已被證明可通過促進鐵蛋白輸出抑制鐵死亡[21]。鐵螯合劑抑制了erastin介導的鐵死亡,而外源性鐵會增強此過程。因此,鐵的吸收和利用影響鐵死亡的誘導過程。

1.5 鐵死亡的其他調(diào)節(jié)通路 鐵死亡電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channels, VDACs)是轉(zhuǎn)運離子和代謝產(chǎn)物的跨膜通道。Yagoda等[22]發(fā)現(xiàn)erastin可與VDACs的異構體結合。用小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)干預VDAC2或VDAC3表達后,細胞對erastin介導的鐵死亡產(chǎn)生耐受,但是過表達VDAC2和VDAC3并未提高其對erastin的敏感性,所以VDAC2和VDAC3是鐵死亡的必要非充分條件。DeHart等[23]認為,erastin作用于VDACs,使線粒體功能紊亂,膜通透性增強,氧化性物質(zhì)釋放,引起細胞死亡。在氧化應激狀態(tài)下,甲硫氨酸可通過硫轉(zhuǎn)移途徑轉(zhuǎn)化為胱氨酸,合成GSH,協(xié)助GSH過氧化物酶抑制脂質(zhì)活性氧生成,避免細胞氧化損傷,因此硫轉(zhuǎn)移途徑可抑制鐵死亡的發(fā)生。Tang等[24]證實了血紅素加氧酶1可以誘導脂質(zhì)過氧化反應從而導致鐵死亡的發(fā)生。最近研究發(fā)現(xiàn),鐵死亡抑制蛋白1 (ferroptosis suppressor protein 1, FSP1)/泛醌系統(tǒng)可以防止由GPX4的藥理抑制或基因缺失引起的鐵死亡,FSP1通過減少泛醇/α-生育酚來防止脂質(zhì)過氧化相關的鐵死亡[25]。

2 鐵死亡與AMD

AMD的潛在機制包括氧化應激介導的視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigmen epithelium,RPE)細胞死亡和隨后的視網(wǎng)膜感光細胞死亡[5]。細胞內(nèi)鐵濃度在3個水平上受到調(diào)節(jié):通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達來控制鐵攝取、調(diào)節(jié)LIP和鐵輸出。鐵死亡與AMD發(fā)病機制有關的病理性血管發(fā)生、氧化應激、免疫反應及炎癥反應等密切相關。

2.1 AMD與脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV) 過量的鐵是促進血管生成的。鐵介導視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)和RPE細胞中的G蛋白偶聯(lián)受體信號傳導,并刺激VEGF的表達和分泌。Zhao等[26]發(fā)現(xiàn),激光誘導3 d的CNV小鼠模型RPE細胞中SLC7A11蛋白以及VEGFA的表達達到峰值,而腹腔注射SLC7A11抑制劑后,RPE-脈絡膜復合體中Fe2+含量和GPX4表達增加,CNV的面積擴大。Liu等[27]發(fā)現(xiàn),小鼠玻璃體腔注射檸檬酸鐵銨(ferric ammonium citrate,FAC)1個月時,光學相干斷層掃描(optical coherence tomography,OCT)提示視網(wǎng)膜出現(xiàn)新生血管病變和RPE萎縮,4個月時眼底熒光素血管造影(fluorescence fundus angiography,FFA)及吲哚青綠血管造影(indocyanine green angiography,ICGA)顯示地理萎縮區(qū)熒光素滲漏以及脈絡膜水平的血管網(wǎng),提示Ⅲ型脈絡膜新生血管病變。同時,病理切片免疫熒光顯示,注射FAC眼視網(wǎng)膜RPE細胞的緊密連接蛋白1(ZO-1)標記減少,并可觀察到二脒基苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)標記的血管內(nèi)皮細胞的細胞核,提示CNV形成。以上研究提示CNV的發(fā)展與鐵死亡密切相關。

2.2 AMD與氧化應激和脂質(zhì)過氧化 GSH是RPE細胞中最突出的抗氧化劑,在視網(wǎng)膜中濃度較高。研究發(fā)現(xiàn),由GSH耗竭、叔丁基氫過氧化物(tBH)孵育或補充亞鐵引起的鐵死亡是氧化應激介導的RPE細胞死亡的主要模式[28]。鐵誘導的GSH耗竭導致GPX4失活,Xc-系統(tǒng)活性增加,過量的鐵通過芬頓反應形成有毒的ROS,ROS與細胞器中的PUFA反應,產(chǎn)生LPO,從而導致細胞死亡。LOX的鐵中心可以催化脂質(zhì)氫過氧化物(LOOH)的形成,而LIP的Fe2+參與LOOH分解反應以產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化的親電產(chǎn)物。當鐵水平超過細胞抗氧化能力時,ROS的產(chǎn)生會損害視網(wǎng)膜內(nèi)的DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。視網(wǎng)膜細胞對脂質(zhì)過氧化高度敏感,鐵過載會增加氧化應激及其敏感性[12]。在老化的視網(wǎng)膜中,抗氧化防御系統(tǒng)活性降低,對氧化應激和鐵誘導的氧化損傷抵抗力減弱。AMD病人RPE細胞吞噬能力下降,光感受器殘留小體中含有的羧乙基吡咯、不飽和脂肪酸的氧化片段和熒光雙維甲酸衍生物等有毒物質(zhì)使RPE功能受損,最終沉積在Bruch’s膜中,成為玻璃膜疣的一部分[29]。Tang等[24]在視網(wǎng)膜色素上皮細胞中觀察到鐵死亡抑制劑ferrostatin-1和去鐵胺(Desferal)減弱了氧化應激誘導的RPE細胞的脂質(zhì)過氧化、GSH耗竭和Fe2+積累,表明鐵死亡在氧化應激誘導的RPE細胞死亡中發(fā)揮重要作用。

2.3 AMD與炎癥反應和免疫反應 玻璃膜疣的主要成分β淀粉樣蛋白1-40寡聚體是慢性炎癥的強效刺激劑,在眼內(nèi)形成促炎微環(huán)境,刺激RPE或脈絡膜血管平滑肌細胞中炎癥介質(zhì)的表達,從而促進炎癥的發(fā)生和發(fā)展[30]。小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞和其他表達IL-6的細胞在干性AMD供體的視網(wǎng)膜中顯著增加[31]。小鼠玻璃體腔鐵注射使神經(jīng)視網(wǎng)膜中IL-1β、IL-6和補體因子C3的mRNA水平增加。此外,氧化應激和芬頓反應相關的雙維甲酸降解生成羰基化合物,可以誘導RPE細胞產(chǎn)生IL-1、IL-6、TNF-α等細胞因子,這些細胞因子會募集包括小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞在內(nèi)的炎性細胞[31],表明AMD發(fā)病機制與補體及神經(jīng)炎癥的激活相關。Cao等[32]在AMD患眼病理切片中發(fā)現(xiàn)脈絡膜巨噬細胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層的色素沉著細胞、視網(wǎng)膜下的單個脫落細胞以及萎縮區(qū)的RPE細胞等的免疫標志物CD68和CD163呈強陽性,表明單個層內(nèi)細胞及其他異常細胞均表現(xiàn)出CD68和CD163免疫反應性。光誘導自由基產(chǎn)生的一種劇毒的膽固醇氧化物——7-酮膽固醇,經(jīng)自由基介導機制與AMD發(fā)生發(fā)展相關[33]。此外,鐵過載使膽固醇轉(zhuǎn)運蛋白靶向缺失,膽固醇代謝物累積,視網(wǎng)膜下間隙的巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞浸潤,導致光感受器功能障礙和神經(jīng)退行性變。此外,鐵誘導的視網(wǎng)膜中NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NLRP3)炎性體發(fā)揮重要作用,這是一種與AMD發(fā)病機制相關的免疫信號復合體[34]。因此,炎癥反應和免疫反應在AMD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

3 鐵死亡在AMD治療中的研究進展

傳統(tǒng)的濕性AMD治療包括激光光凝、維替泊芬光動力療法、手術治療等,近年來,抗VEGF已經(jīng)成為其一線治療[33]。早期干性AMD不會立即威脅病人視力,因此定期隨訪尤為重要。目前,世界上尚沒有針對干性AMD的有效治療方法。美國眼科學會(AAO)指南推薦用葉黃素和玉米黃質(zhì)替代β胡蘿卜素預防AMD的發(fā)生發(fā)展[35]。AMD的鐵死亡相關基因以及干細胞治療等仍在探索之中。

鐵螯合劑對AMD具有保護作用。最近的研究報告了鐵螯合療法在視網(wǎng)膜變性和幾種神經(jīng)退行性疾病中的作用[7-9]。目前臨床上可用的鐵螯合劑包括Desferal、去鐵酮、地拉羅司和水楊醛異煙酰肼[36-37]。去鐵胺鋅是一種Desferal的鋅復合物,小鼠腹腔注射可誘導Desferal在視網(wǎng)膜中積累,從而減輕視網(wǎng)膜變性和氧化應激誘導的神經(jīng)毒性和視網(wǎng)膜毒性[38]。α-硫辛酸可減緩小鼠視網(wǎng)膜中光誘導的光感受器退化。Zhao等[26]發(fā)現(xiàn)SLC7A11可以發(fā)揮抗氧化作用,通過激活或增加GPX4來減少AMD小鼠視網(wǎng)膜CNV面積,使細胞免于鐵死亡。以上發(fā)現(xiàn)為臨床對抗VEGF治療不敏感或易復發(fā)的濕性AMD以及干性AMD病人提供了一種新的治療思路。

隨著新型生物制劑的研發(fā),高生物相容性的強效鐵結合納米普魯士藍類似物CaPB旨在抑制RPE細胞死亡和隨后的感光細胞退化。Tang等[39]發(fā)現(xiàn)玻璃體腔注射CaPB的AMD小鼠療效顯著,初步揭示了CaPB納米顆粒可通過抑制RPE細胞的鐵死亡防止視網(wǎng)膜變性。Gupta等[40]發(fā)現(xiàn)一種脂質(zhì)運載蛋白2(LCN2)單克隆抗體可與干性AMD小鼠模型中的LCN2和其同源二聚體變體結合,抑制其自噬和鐵死亡途徑,挽救其視網(wǎng)膜功能,為AMD提供了一種可能的治療策略。

近年來用于AMD治療的干細胞臨床試驗相繼開展。Schwartz等[41-42]的Ⅰ/Ⅱ期臨床研究表明,人胚胎干細胞(human embryonic stem cells, hESCs)衍生的RPE細胞療法安全有效地提高了AMD病人的視力預后,為AMD的干細胞治療提供了更多的可能性。

4 小結及展望

綜上,AMD是多種因素引起的一種不可逆性的老年性致盲眼病,其發(fā)病機制尚未明確。目前,對于濕性AMD病人玻璃體內(nèi)抗VEGF治療取得了一定療效,但對于抗VEGF無效以及干性AMD病人尚缺乏有效的治療措施。鐵死亡作為一種獨特的細胞死亡程序,在AMD發(fā)病機制有關的病理性血管發(fā)生、氧化應激、免疫反應及炎癥反應等病理過程中發(fā)揮重要作用。隨著鐵死亡機制研究的不斷深入,基于鐵死亡治療AMD的研究也從分子水平、基因水平到干細胞水平不斷探索,有望為AMD的治療提供可行的個性化方案。