InDel分子標(biāo)記WC656的開發(fā)及其在鑒別小麥-簇毛麥5VS純合易位中的應(yīng)用

郭江濤,呂遠(yuǎn)大,趙姝楠,周淼平,姚金保,楊學(xué)明

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210014;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院卓越創(chuàng)新中心,江蘇南京 210014;3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210095)

小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要糧食作物,其安全生產(chǎn)對(duì)我國(guó)糧食安全具有重要意義。優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)多抗高效新品種選育與配套生產(chǎn)技術(shù)推廣應(yīng)用,使小麥單產(chǎn)大幅度提高。在小麥品種遺傳改良中,培育突破性品種往往與突破性種質(zhì)的挖掘和應(yīng)用密切相關(guān)。20世紀(jì)60年代,矮稈基因的利用使小麥品種株高降低,單產(chǎn)大幅度提高[1]。小麥近緣物種蘊(yùn)含豐富的有益基因,已成為小麥品種改良的重要基因資源,如黑麥含有銹病和白粉病抗性基因[2-4];長(zhǎng)穗偃麥草不僅抗旱、抗寒能力很強(qiáng),而且抗小麥白粉病、銹病、條紋花葉病、黃矮病、赤霉病等多種病害[5-7];簇毛麥高抗銹病、白粉病,對(duì)眼斑病、全蝕病、梭條花葉病等具有較好的抗性,同時(shí)具有籽粒硬度低等優(yōu)良性狀[8-17]。通過遠(yuǎn)緣雜交,可以將來自于近緣屬種的優(yōu)異基因轉(zhuǎn)移給小麥,創(chuàng)制附加系、代換系和易位系等異染色體系[18]。與抗銹病和白粉病相關(guān)的小麥-黑麥T1RS.1BL、小麥-簇毛麥T6VS.6AL等易位系種質(zhì)的創(chuàng)制與應(yīng)用, 已培育出許多抗病高產(chǎn)的小麥品種[19-23]。

簇毛麥5V染色體短臂上含有抗白粉病基因Pm55、抗條銹病基因Yr5V和籽粒硬度基因Dina/Dinb等有益基因[17,24],南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳研究所通過染色體工程技術(shù)創(chuàng)制了普通小麥-簇毛麥5V添加系、5V代換系和5VS易位系。其中,創(chuàng)制的普通小麥-簇毛麥5VS.5AL、5VS.5DL易位系,為進(jìn)一步高效利用5VS上的有益基因進(jìn)行品種改良奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。目前,鑒定普通小麥背景中簇毛麥染色體的主要方法包括基因組原位雜交(genomicinsituhybridization,GISH)、熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)、分子標(biāo)記等[25-30]。利用原位雜交方法可以分析普通小麥背景下簇毛麥染色體的大小及變異類型,但實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)繁瑣、費(fèi)時(shí),開發(fā)應(yīng)用簇毛麥染色體或染色體臂特異分子標(biāo)記,可以顯著提高普通小麥-簇毛麥異染色體系的鑒定效率。

為了利用分子標(biāo)記鑒別簇毛麥5VS染色體臂,曹亞萍等[31]根據(jù)水稻、小麥的 EST序列,開發(fā)了可追蹤簇毛麥5VS染色體的STS引物CINAU411-745。Zhang等[32]利用普通小麥7個(gè)部分同源群上的276對(duì)SSR標(biāo)記引物對(duì)普通小麥中國(guó)春、簇毛麥和中國(guó)春-簇毛麥二體附加系的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增分析,篩選出可用來追蹤簇毛麥5VS染色體的引物wmc233。利用中國(guó)春與簇毛麥間擴(kuò)增出多態(tài)性的597對(duì)小麥EST引物,對(duì)親本及普通小麥-簇毛麥二體附加系進(jìn)行擴(kuò)增分析,獲得具有簇毛麥5VS特異條帶的標(biāo)記2個(gè),其中CINAU211-700(該標(biāo)記亦稱為5EST-237[33])標(biāo)記引物可以擴(kuò)增出5VS、5AS、5BS、5DS條帶[34]。付必勝等[35]通過簇毛麥5VS的基因組序列信息與中國(guó)春小麥染色體 5AS、5BS、5DS 上的基因進(jìn)行比對(duì),開發(fā)了具有簇毛麥5VS特異條帶的保守直系同源基因序列(COS)標(biāo)記引物59對(duì)。上述已開發(fā)的標(biāo)記中,標(biāo)記CINAU411-745、wmc233,只能檢測(cè)5VS特異條帶;付必勝等[35]開發(fā)的59對(duì)COS標(biāo)記中,19個(gè)只能檢測(cè)5VS特異條帶,40個(gè)為3種類型的共顯性標(biāo)記,可以區(qū)分5VS與5AS、5BS、5DS中1～3個(gè)條帶,條帶大小之間最大差異為20 bp,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物需經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。CINAU211-700標(biāo)記可以同時(shí)區(qū)分5VS、5AS、5BS、5DS條帶,但其擴(kuò)增產(chǎn)物也需經(jīng)聚丙烯酰胺凝經(jīng)膠電泳檢測(cè)。

本研究利用普通小麥中國(guó)春基因組序列,通過mInDel軟件開發(fā)小麥第5同源群短臂的InDel共顯性分子標(biāo)記,其擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,檢測(cè)第5同源群短臂特異條帶是否缺失,快速、簡(jiǎn)便地篩選出普通小麥-簇毛麥5VS.5AL、5VS.5DL易位系為供體親本的分離后代中5VS純合易位單株,為利用普通小麥-簇毛麥5VS易位系進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)制和品種改良提供新的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

普通小麥-簇毛麥T5VS.5AL易位系z(mì)rq5V-2、T5VS.5DL易位系NAU415-2,含有簇毛麥5VS染色體臂;普通小麥中國(guó)春,21個(gè)長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)推廣的小麥品種(寧麥9號(hào)、寧麥13、寧麥18、揚(yáng)麥13、揚(yáng)麥15、揚(yáng)麥20、寧紫麥1號(hào)、揚(yáng)麥16、揚(yáng)麥25、揚(yáng)麥29、揚(yáng)輻麥4號(hào)、鎮(zhèn)麥168、鎮(zhèn)麥9號(hào)、鎮(zhèn)麥10號(hào)、鎮(zhèn)麥12、泰麥901、華麥1092、鹽麥1號(hào)、農(nóng)麥88、瑞華麥596、寧麥資166),這些材料均不含有5VS染色體臂,用于分子標(biāo)記的開發(fā)驗(yàn)證。94個(gè)zrq5V-2/4*寧麥9號(hào) BC4F2單株及BC4F2∶3家系,180個(gè)寧麥13*4/NAU415-2 BC4F2單株及BC4F2∶3家系,這些材料用于標(biāo)記的驗(yàn)證與篩選。17個(gè)T5VS.5DL和5個(gè)T5VS.5AL高代品系,用于標(biāo)記的應(yīng)用檢測(cè)。zrq5V-2(NAU421衍生系)、NAU415-2由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳研究所創(chuàng)制[17, 24],中國(guó)春、小麥品種由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所收集保存。zrq5V-2/4*寧麥9號(hào)、寧麥13*4/NAU415-2 BC4F2群體及BC4F2∶3家系,T5VS.5AL、T5VS.5DL高代品系,由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所創(chuàng)制和保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)記引物WC656序列

通過mInDel軟件[36]分析普通小麥中國(guó)春參考基因組序列(版本:IWGSC RefSeq v2.1,https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/Assemblies),在第5同源群短臂開發(fā)出265對(duì)InDel標(biāo)記引物,其中WC656標(biāo)記用于本研究,該標(biāo)記引物對(duì)為WC656-F:5′-GAGCACCAGCAGAGCAAGATG-3′和WC656-R:5′-ACCAACAGCACCTAGACAACAC-3′。

1.2.2 分子標(biāo)記檢測(cè)

利用植物基因組DNA提取試劑盒(Karroten K2304)提取試驗(yàn)小麥材料的葉片DNA。分子標(biāo)記檢測(cè)采用Bio-Rad C1000擴(kuò)增儀,PCR反應(yīng)體系為20 μL,其中DNA模板1 μL(濃度40 ng·L-1),引物WC656-F、WC656-R各 1 μL(濃度10 μmol·L-1),2×Taq Plus Master Mix Ⅱ(Vazyme)10.0 μL,ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)循環(huán)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性3 min,94℃變性30 s,62 ℃退火45 s,72 ℃延伸70 s,34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物以1% 的瓊脂糖凝膠(含體積比1∶10 000的Tanon核酸染料)電泳,電泳電壓100 V,電泳時(shí)間1.5 h,以凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 3500)掃描成像并存入計(jì)算機(jī)。

1.2.3 細(xì)胞遺傳學(xué)分析

根尖細(xì)胞有絲分裂中期染色體制片,參照Chen等[37]的方法并作修改。在22 ℃培養(yǎng)箱中,小麥種子在墊有濾紙的培養(yǎng)皿中用水浸泡24 h,露白后轉(zhuǎn)到4 ℃冰箱中處理22～24 h,再轉(zhuǎn)到22 ℃培養(yǎng)至根長(zhǎng)1～2 cm,剪取根尖置于一氧化二氮(N2O)中處理2 h,再將處理過的根尖用90%冰醋酸固定10 min后,取出放于70%乙醇中保存。制片時(shí),將固定的根尖用45%醋酸解離10 min,然后切取少許根尖生長(zhǎng)點(diǎn)組織壓片,相差顯微鏡下預(yù)檢。取染色體分散良好的制片用液氮處理,揭片后用70%、90%和100%乙醇梯度脫水,氣干后用于原位雜交。

熒光原位雜交的寡核苷酸探針套包括12個(gè)寡核苷酸探針,其序列組成參照Chen等[37]。所用寡核苷酸探針套包括pAs1-1、pAs1-3、pAs1-4、pAs1-6、AFA-3、AFA-4、pSc119.2-1、Grass-5S-1、Grass-5S-2、(GAA)10、BSCL135-1、BSCL135-2,其中(GAA)10、BSCL135-1、BSCL135-2為FAM修飾,其余探針為TAMRA修飾。簇毛麥基因組DNA探針采用缺口平移法,利用Fluorescein-12-dUTP進(jìn)行標(biāo)記。熒光原位雜交及順序基因組原位雜交流程參照Chen等[37]和Yang等[38]的方法。利用Olympus BX60型熒光顯微鏡觀察染色體及雜交信號(hào),使用SPOT CCD(SPOT Cooled Color Digital)獲得圖像。

1.2.4 田間試驗(yàn)與成株期白粉病接種鑒定

田間試驗(yàn)在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院部基地進(jìn)行,BC4F2分離群體于2019-2020年度粒播種植,行長(zhǎng)1.75 m,行距27 cm,株距15 cm;BC4F2∶3家系和5VS易位系高代品系于2020～2021年度種植,每個(gè)家系50粒/行,行長(zhǎng)1.6 m,行距27 cm。在被鑒定材料四周種植高感白粉病小麥品種蘇麥3號(hào)作為誘發(fā)行,在每年2月初用感白粉病(用白粉病混合菌種感染)的幼苗種植于蘇麥3號(hào)誘發(fā)行中,使蘇麥3號(hào)發(fā)生白粉病,從而進(jìn)一步誘發(fā)田間白粉病。當(dāng)感病對(duì)照品種寧麥9號(hào)倒二葉上的白粉病嚴(yán)重度達(dá)到70%以上時(shí)進(jìn)行白粉病調(diào)查,7 d后進(jìn)行第二次調(diào)查,白粉病抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)按0～4級(jí)分類[39],0～2級(jí)為抗病(R),3～4級(jí)為感病(S)。田間試驗(yàn)管理與大田生產(chǎn)一致。

1.2.5 籽粒硬度測(cè)定

將收獲曬干的小麥籽粒樣品在同一條件下放置1個(gè)月后,利用Perten 4100 型單籽粒谷物特性測(cè)試儀(Single Kernel Characterization System,SKCS)測(cè)定籽粒硬度指數(shù),單株材料檢測(cè)50 粒,高代品系檢測(cè)300 粒。

2 結(jié)果與分析

2.1 InDel分子標(biāo)記WC656的開發(fā)

通過mInDel軟件,開發(fā)小麥第5同源群短臂的InDel分子標(biāo)記?；谄胀ㄐ←溨袊?guó)春參考基因組序列,針對(duì)5A、5B、5D基因組序列,利用滑動(dòng)窗算法(sliding windows)設(shè)計(jì)覆蓋全部染色體的大規(guī)模探針池,進(jìn)而針對(duì)第5同源群短臂,高通量預(yù)測(cè)染色體臂間的InDel變異,采用鄰近InDel聚合的策略,設(shè)計(jì)開發(fā)出高效、易檢測(cè)的InDel分子標(biāo)記265個(gè)。進(jìn)一步對(duì)265對(duì)第5同源群短臂的InDel標(biāo)記引物預(yù)測(cè)擴(kuò)增條帶片段大小的分析,篩選出5AS、5BS、5DS片段小于600 bp,不同片段大小之間差異較大(大于25 bp)、易于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的65個(gè)標(biāo)記,其中WC656的標(biāo)記引物最大擴(kuò)增片段為471 bp(5BS條帶),5BS與5DS、5DS與5AS之間條帶大小相差分別為49和43 bp,易于區(qū)分5AS、5BS、5DS條帶,因而利用該標(biāo)記用于鑒別5VS純合易位系。

2.2 小麥遺傳材料的標(biāo)記引物WC656分析

2.2.1 小麥-簇毛麥5VS易位系、小麥品種標(biāo)記引物WC656分析

以普通小麥中國(guó)春,T5VS.5AL易位系z(mì)rq5V-2,T5VS.5DL易位系NAU415-2,以及長(zhǎng)江中下游麥區(qū)育成和推廣的21個(gè)小麥品種DNA為模板,以WC656引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果表明,在T5VS.5AL易位系z(mì)rq5V-2中擴(kuò)增出471 bp(5BS)和422 bp(5DS)2條條帶(圖1a,泳道2),缺失379 bp(5AS)條帶,說明zrq5V-2中5AS染色體臂已被代換。在T5VS.5DL易位系NAU415-2中擴(kuò)增出379 bp(5AS)和471 bp(5BS)2條條帶(圖1a,泳道3),缺失422 bp(5DS)條帶,說明NAU415-2中5DS染色體臂已被代換。在中國(guó)春和21個(gè)小麥品種中均擴(kuò)增出379 bp(5AS)、471 bp(5BS)422 bp(5DS)3條條帶(圖1a,泳道4～24),說明這些材料第5同源群染色體短臂均沒有被代換。因而,利用WC656引物進(jìn)行檢測(cè),可以鑒別T5VS.5AL、T5VS.5DL等純合易位系及其與其他普通小麥品種雜交而產(chǎn)生的純合易位后代。

M:100bp DNA ladder;a:小麥品種(系)的WC656檢測(cè)結(jié)果; 1:中國(guó)春;2:zrq5V-2;3:NAU415-2;4:寧麥9號(hào);5:寧麥13;6:寧麥18;7:寧紫麥1號(hào);8:揚(yáng)麥13;9:揚(yáng)麥15;10:揚(yáng)麥16;11:揚(yáng)麥20;12:揚(yáng)麥25;13:揚(yáng)麥29;14:揚(yáng)輻麥4號(hào);15:鎮(zhèn)麥168;16:鎮(zhèn)麥9號(hào);17:鎮(zhèn)麥10號(hào);18:鎮(zhèn)麥12;19:泰麥901;20:華麥1092;21:鹽麥1號(hào);22:農(nóng)麥88;23:瑞華麥596;24:寧麥資166。b:BC4F2群體5VS.5AL純合易位單株的標(biāo)記引物WC656檢測(cè)結(jié)果; 1～24:(zrq5V-2/4*寧麥9號(hào))BC4F2代單株,1、4、5、9、11、18、19為純合易位。c:BC4F2群體5VS.5DL純合易位單株的標(biāo)記引物WC656檢測(cè)結(jié)果;1～24:(寧麥13*4/NAU415-2)BC4F2代單株,1、7、9、12、15、20為純合易位。d:小麥-簇毛麥5VS高代純合易位系的標(biāo)記引物WC656檢測(cè)結(jié)果; 1:中國(guó)春;2～18:以T5VS.5DL為供體親本的高代品系;19～23:以T5VS.5AL為供體親本的高代品系。M: 100bp DNA ladder; a: Identification of different wheat cultivars or lines by WC656 marker; 1: Chinese Spring; 2: zrq5V-2; 3: NAU415-2; 4: Ningmai 9; 5: Ningmai 13; 6: Ningmai 18; 7: Ningzimai 1; 8: Yangmai 13; 9: Yangmai 15; 10: Yangmai 16; 11: Yangmai 20; 12: Yangmai 25; 13: Yangmai 29; 14: Yangfumai 4; 15: Zhenmai 168; 16: Zhenmai 9; 17: Zhenmai 10; 18: Zhenmai 12; 19: Taimai 901; 20: Huamai 1092; 21: Yanmai 1; 22: Nongmai 88; 23: Ruihuamai 596; 24: Ningmaizi 166. b: Identification of 5VS.5AL homozygous translocation individuals in BC4F2 genetic population; 1-24: Individuals of zrq5V-2/4*Ningmai 9 F2 population, 1, 4, 5, 9, 11, 18 and 19 are homozygous. c: Identification of 5VS.5DL homozygous translocation individuals in BC4F2 genetic population; 1-24: Individuals of Ningmai 13*4/NAU415-2 F2 population, 1, 7, 9, 12, 15 and 20 are homozygous. d: Identification of 5VS homozygous advanced translocation lines; 1: Chinese Spring; 2-18: T5VS.5DL advanced translocation lines; 19-23: T5VS.5AL advanced translocation lines.圖1 不同小麥遺傳材料的WC656標(biāo)記引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Agarose-gel electrophoresis of PCR products amplified by WC656 marker in different materials

2.2.2 回交F2代分離群體中純合易位單株的鑒定

以T5VS.5AL易位系z(mì)rq5V-2、T5VS.5DL易位系NAU415-2為供體親本,分別與寧麥9號(hào)、寧麥13雜交、回交,構(gòu)建了回交4次的F2(BC4F2)遺傳群體,分別有94、180個(gè)單株,以這些單株DNA為模板,用WC656引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè),圖1b和圖1c所示部分單株的結(jié)果。圖1b為zrq5V-2為供體親本的BC4F2單株檢測(cè)結(jié)果,單株B10-2、B10-4、B10-5、B10-11、B10-18、B10-19、B10-32(分別對(duì)應(yīng)泳道1、4、5、9、11、18、19)的5AS條帶缺失,表明這7個(gè)單株的5VS代換了5AS,為T5VS.5AL純合易位系單株。圖1c為NAU415-2為供體親本的BC4F2單株檢測(cè)結(jié)果,單株B21-5、B21-25、B21-27、B21-58、B21-61、B21-65(分別對(duì)應(yīng)泳道1、7、9、12、15、20)的5DS條帶缺失,表明這6個(gè)單株的5VS代換了5DS,為T5VS.5DL純合易位系單株。

2.3 5VS純合易位的細(xì)胞學(xué)鑒定

利用寡核苷酸探針套,對(duì)通過標(biāo)記WC656鑒別出的部分5VS純合易位單株的染色體組成進(jìn)行FISH分析。圖2b、圖2e分別為T5VS.5AL易位單株B10-2、T5VS.5DL易位單株B21-5的原位雜交結(jié)果,這2個(gè)單株(2n=6x=42)均含有一對(duì)易位染色體,在5VS染色體臂端部具有1對(duì)較強(qiáng)的紅色信號(hào),近著絲粒區(qū)域有1對(duì)綠色信號(hào)。5AL染色體近著絲粒區(qū)域有1對(duì)綠色信號(hào)、近中部有1對(duì)紅色信號(hào),5DL上有3對(duì)紅色信號(hào),箭頭分別所示5VS.5AL、5VS.5DL易位染色體。以簇毛麥基因組DNA為探針進(jìn)行順序GISH,確認(rèn)易位染色體的短臂來源于簇毛麥(圖2c、圖2f)。

a、b、c分別為T5VS.5AL單株B10-2白粉病抗性鑒定、FISH及GISH檢測(cè)圖;d、e、f分別為T5VS.5DL單株B21-5白粉病抗性鑒定、FISH及GISH檢測(cè)圖。箭頭示易位染色體,比例尺為10 μm。a, b, c: Powdery mildew resistance and sequential FISH and GISH identification of T5VS.5AL single plant B10-2; d, e, f: Powdery mildew resistance and sequential FISH and GISH identification of T5VS.5DL single plant B21-5. Arrow head indicates translocation chromosome, scale bar=10 μm.圖2 T5VS.5AL(a, b, c)、T5VS.5DL(d, e, f)單株白粉病抗性鑒定及順序FISH-GISH檢測(cè)Fig.2 Powdery mildew resistance and sequential FISH and GISH identification of T5VS.5AL and T5VS.5DL individuals

2.4 小麥-簇毛麥5VS易位染色體單株的成株期白粉病抗性表現(xiàn)及遺傳特點(diǎn)

表1 BC4F2群體部分5VS純合易位和無5VS易位單株的白粉病抗性及籽粒硬度指數(shù)Table 1 Powdery mildew resistance and grain hardness index of 5VS homozygous translocation and 5VS non-translocation in BC4F2 partial individuals

表2 BC4F2單株的WC656標(biāo)記分析及白粉病抗性鑒定Table 2 WC656 analysis and identification of powdery mildew resistance in BC4F2 individuals

2.5 籽粒硬度分析

利用Perten 4100型單籽粒谷物特性測(cè)試儀(SKCS 4100),對(duì)回交F2單株籽粒進(jìn)行測(cè)定,回交群體受體親本寧麥9號(hào)、寧麥13籽粒硬度指數(shù)分別為24.0±0.8、58.2±0.6。表1所示兩個(gè)回交群體部分5VS純合易位和無5VS易位F2單株籽粒的硬度指數(shù),標(biāo)記WC656鑒別出的5VS純合易位單株的籽粒硬度指數(shù),顯著低于無5VS易位單株的硬度指數(shù)。對(duì)zrq5V-2/4*寧麥9號(hào)、寧麥13*4/NAU415-2所有F2代單株的籽粒硬度進(jìn)行分析,5VS.5AL、5VS.5DL純合易位單株的平均籽粒硬度指數(shù)分別為9.4、14.9,比無5VS易位的單株分別降低59.3%、74.0%(表3)。

表3 BC4F2不同易位類型單株的籽粒硬度指數(shù)Table 3 Grain hardness index of different translocation types in BC4F2 individuals

2.6 標(biāo)記引物WC656在5VS易位系高代品系選育中的應(yīng)用

以zrq5V-2、NAU415-2為供體親本,與本地區(qū)寧麥9號(hào)、寧麥13、揚(yáng)麥15、揚(yáng)麥20等感白粉病弱筋小麥品種雜交、回交,在F2、F3等早代利用WC656篩選5VS純合易位單株,后續(xù)世代對(duì)白粉病抗性、籽粒質(zhì)地、農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量等進(jìn)行選擇與鑒定,育成攜有5VS染色體臂、抗白粉病的高代品系22個(gè)。以這些品系的DNA為模板,利用WC656引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳檢測(cè)結(jié)果所示(圖1d),泳道1為中國(guó)春,擴(kuò)增出379 bp(5AS)、471 bp(5BS)、422 bp(5DS)3條條帶。泳道(樣品)2-18的5DS條帶缺失,表明這17個(gè)品系的5VS代換了5DS,為T5VS.5DL純合易位系。泳道(樣品)19-23的5AS條帶缺失,表明這5個(gè)品系的5VS代換了5AS,為T5VS.5AL純合易位系。22個(gè)T5VS.5DL和T5VS.5AL易位系籽粒硬度指數(shù)在9.8～25.0之間,同樣表現(xiàn)出較低的硬度指數(shù)。白粉病接種鑒定,新育成的5VS易位系高代品系均抗白粉病。

3 討論

普通小麥?zhǔn)怯葾、B、D 3個(gè)染色體組組成的異源六倍體,染色體分帶、基因組原位雜交(GISH)、熒光原位雜交(FISH)等細(xì)胞遺傳學(xué)方法已廣泛應(yīng)用于普通小麥的起源與進(jìn)化研究,也已用于普通小麥背景中簇毛麥染色體(臂)的鑒別[11,28]。與細(xì)胞遺傳學(xué)方法相比,利用分子標(biāo)記方法鑒別染色體具有便捷、不受小麥生長(zhǎng)發(fā)育條件限制等優(yōu)點(diǎn)。鑒別普通小麥-簇毛麥5VS易位系為供體親本的分離世代植株的純合易位類型,一是可以利用普通小麥5AS、5BS、5DS與簇毛麥5VS染色體臂共顯性分子標(biāo)記進(jìn)行直接鑒別[29, 33-35],二是可以利用普通小麥5AS、5BS、5DS共顯性分子標(biāo)記進(jìn)行間接鑒別。

由于當(dāng)前尚無小麥-簇毛麥5VS易位系基因組信息,嚴(yán)重阻礙了5VS與5AS、5BS、5DS共顯性分子標(biāo)記的大規(guī)模開發(fā)和應(yīng)用。同時(shí),已開發(fā)的可以追蹤5VS的分子標(biāo)記中,只有CINAU211-700標(biāo)記引物可以擴(kuò)增出5VS、5AS、5BS、5DS條帶[34],但擴(kuò)增產(chǎn)物需用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè),還沒有可以經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、高效鑒別這4個(gè)染色體短臂的分子標(biāo)記報(bào)道。InDel分子標(biāo)記是基于基因組中插入/缺失位點(diǎn)兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的標(biāo)記,具有分布廣、重復(fù)性好、開發(fā)成本低、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),已用于對(duì)基因型簡(jiǎn)單快速判別。本研究中的供體親本為普通小麥-簇毛麥5VS.5AL、5VS.5DL易位系,由于5VS染色體臂分別替換了普通小麥5AS、5DS染色體臂,因而利用普通小麥第5同源群染色體短臂的共顯性InDel分子標(biāo)記WC656進(jìn)行檢測(cè),通過分析5AS、5DS電泳條帶是否缺失,可以用來鑒別普通小麥-簇毛麥5VS.5AL、5VS.5DL純合易位。WC656擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶大小分別為379 bp(5AS)、471 bp(5BS)、422 bp(5DS),5AS與5DS、5DS與5BS之間條帶大小相差分別為43 bp、49 bp,通過瓊脂糖凝膠電泳很容易將這3個(gè)條帶區(qū)分開。順序FISH-GISH分析結(jié)果與WC656鑒別的純合易位一致。筆者以CINAU211-700(5EST-237)標(biāo)記引物對(duì)5VS純合易位進(jìn)行分析,其結(jié)果也與WC656標(biāo)記分析結(jié)果一致。

在減數(shù)分裂過程中,由于5VS與普通小麥5AS、5BS、5DS不配對(duì),難以發(fā)生重組交換,因而位于5VS上的基因總是伴隨5VS.5AL或5VS.5DL易位染色體傳遞。本研究以分子標(biāo)記WC656分別對(duì)zrq5V-2/4*寧麥9號(hào)、寧麥13*4/NAU415-2的回交F2分離群體檢測(cè),5VS純合易位單株、5VS雜合易位單株、無5VS易位單株的數(shù)量之比均符合1∶2∶1理論比值,表明5VS/5AL、5VS/5DL易位染色體在普通小麥背景中能夠正常遺傳,同時(shí)5VS純合易位單株表現(xiàn)抗白粉病和低籽粒硬度指數(shù)特性。由于簇毛麥5VS上攜有抗白粉病基因Pm55、籽粒硬度基因Dina/Dinb等有益基因,因而可以將普通小麥-簇毛麥5VS.5AL和5VS.5DL易位系以及InDel分子標(biāo)記WC656,應(yīng)用于軟質(zhì)弱筋小麥品種分子標(biāo)記輔助選擇的遺傳改良研究。

4 結(jié)論

利用普通小麥第5同源群染色體短臂共顯性InDel分子標(biāo)記WC656,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,可以區(qū)分小麥5AS、5BS、5DS染色體臂,通過分析5AS、5DS電泳條帶是否缺失,能夠鑒別出以T5VS.5AL、T5VS.5DL易位系為供體親本的雜交分離后代中的5VS純合易位單株。