濃香型酒醅中活性梭菌群落多樣性及其與揮發(fā)性有機(jī)酸代謝的關(guān)聯(lián)性

胡曉龍, 馮大鴻, 楊雨惠, 遲 雷, 張 勇,王亞平, 朱文優(yōu), 孫繼祥, 曾 田

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,河南 鄭州 450000;2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗室,四川 宜賓 644000;3.河南皇溝酒業(yè)有限責(zé)任公司,河南 永城 476600;4.河南省五糧濃香固態(tài)釀造發(fā)酵工程技術(shù)研究中心,河南 淮濱 464400)

濃香型白酒是中國白酒的重要代表之一,酒醅是其發(fā)酵的主體,也是發(fā)酵微生物的主要載體,酒醅中微生物群落的多樣性和組成與濃香型白酒的呈味物質(zhì)密切相關(guān)[1]。Clostridia(梭菌綱,簡稱梭菌)是濃香型白酒發(fā)酵微生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分。胡曉龍等[2]在濃香型酒醅中共檢測到39個梭菌綱中的屬,其中Caproiciproducens(產(chǎn)己酸菌屬)是優(yōu)勢屬;馬箭等[3]也在酒醅中鑒定到152個屬于梭菌綱的OTU,且預(yù)測發(fā)現(xiàn)梭菌主要參與氨基糖和核苷酸糖代謝、磷酸戊糖代謝、果糖和甘露糖代謝等途徑;蒲秀鑫[4]通過預(yù)測梭菌培養(yǎng)基從窖泥中分離得到31株梭菌。梭菌還是一類產(chǎn)有機(jī)酸的主要微生物,其產(chǎn)生的己酸、丁酸和乙酸等能直接影響白酒的呈香和呈味程度。如Clostridiumkluyveri是典型的己酸菌,能以乙醇、琥珀酸和丙醇為底物產(chǎn)生乙酸、丁酸和己酸等[5]。由于酒醅中梭菌群落及代謝途徑復(fù)雜,目前對酒醅中有機(jī)酸形成相關(guān)的梭菌及其代謝途徑尚不明晰。

宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)是直接分析環(huán)境樣本中的mRNA,可有效檢測具有生理或轉(zhuǎn)錄活性的微生物。諸多研究證明了宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)的優(yōu)勢且較DNA水平的結(jié)果具有較大差異。Hu等[6]通過宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序和16S rRNA/ITS 基因擴(kuò)增子測序在濃香型酒醅的研究中發(fā)現(xiàn),在RNA水平上共檢測到1331個微生物屬,而DNA水平上僅獲得332個;Duan等[7]發(fā)現(xiàn)Lactobacillus(乳酸桿菌)、Enterococcus(腸球菌)、Streptococcus(鏈球菌)僅在宏轉(zhuǎn)錄中被發(fā)現(xiàn),而16S rRNA檢測的一部分細(xì)菌在RNA水平上沒有基因表達(dá)。宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用到濃香型大曲[8]、醬香型大曲[9]和泡菜[10]等發(fā)酵產(chǎn)品之中,均從基因轉(zhuǎn)錄水平揭示了微生物組成、功能及酶譜,這為認(rèn)識微生物群落提供了一個新的角度。目前,宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于酒醅活性梭菌群落演替的研究鮮有報道。

本研究以濃香型白酒整個發(fā)酵周期(60 d)的酒醅為研究對象,采用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法揭示酒醅中具有生理活性的梭菌群落多樣性及其相關(guān)功能,并探究梭菌群落與濃香型白酒重要有機(jī)酸的關(guān)聯(lián)性,以期為進(jìn)一步闡明濃香型白酒發(fā)酵過程中梭菌群落的演替規(guī)律、代謝功能和發(fā)酵機(jī)理等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅樣品取自河南省某濃香型白酒釀造車間。

Ribo-ZeroTM rRNA Removal Kits(Bacteria)和Ribo-ZeroTM Magnetic Gold Kit(Yeast)試劑盒,上海麥克林生化科技有限公司,水飽和酚(pH值 4.5),上海源葉生物科技有限公司;Tris、RNase-Free Water、2×Taq Master Mix,北京索萊寶科技有限公司;二氯甲烷,色譜純,天津市大茂化學(xué)試劑廠;叔戊醇、2-乙基丁酸、乙酸正戊酯,均為色譜純,上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-8C型電泳儀,北京市六一儀器廠;WD-9403C型紫外分析儀,北京六一生物科技有限公司;NanoDrop 2000型微量分光光度計,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;2100型生物分析儀,北京愛立斯生物科技有限公司;7890B-5977B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國安捷倫公司;KQ3 200DA型數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;TGL-20M型高速離心機(jī),上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1樣品采集

隨機(jī)選取正常發(fā)酵的3口平行窖池,對每口窖池中發(fā)酵第3、7、15、25、45、60天的酒醅進(jìn)行跟蹤取樣。對每口窖池下層(距窖底約50 cm)平面上任一對角線的1/2、1/4及其距窖壁20 cm處3個不同位置的酒醅分別采集并混勻作為該窖池的代表性酒醅樣品。共獲得18個酒醅樣品,3d-1、3d-2、3d-3、7d-1、7d-2、7d-3、15d-1、15d-2、15d-3、25d-1、25d-2、25d-3、45d-1、45d-2、45d-3、60d-1、60d-2、60d-3。以3d-1、3d-2、3d-3為例,其中3d代表發(fā)酵時間為第3天,-1、-2、-3代表3個平行樣品。

1.3.2酒醅RNA提取

按照胡曉龍等[11]的SDS-苯酚法對酒醅進(jìn)行總RNA提取,然后采用質(zhì)量濃度1 g/100 mL瓊脂糖凝膠電泳、微量分光光度計和生物分析儀評估總RNA的純度和完整性。

1.3.3宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序文庫準(zhǔn)備和Illumina測序

RNA樣本檢測合格后,使用Ribo-ZeroTM rRNA Removal Kits(Bacteria)和Ribo-ZeroTM Magnetic Gold Kit(Yeast)試劑盒分別去除細(xì)菌和真菌核糖體RNA。文庫的構(gòu)建和測序在北京奧維森基因科技有限公司Illumina HiSeq 2500(Illumina,San Diego,CA,United States)平臺上完成。

1.3.4揮發(fā)性有機(jī)酸檢測

樣品預(yù)處理:酒醅樣品預(yù)處理參照王康麗[12]的方法進(jìn)行。

色譜條件:色譜柱為DB-FFAP毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),升溫程序為初始溫度45 ℃保留3 min,以5 ℃/min 的速率升溫至220 ℃后保持5 min,再以250 ℃運(yùn)行2 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃;柱前壓50 754.095 Pa;載氣為高純 He(體積分?jǐn)?shù)99.999%),載氣流量1.0 mL/min;不分流模式;溶劑延遲時間3.6 min;進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件:電子轟擊離子源,離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,電子能量70 eV,激活電壓1.5 V,掃描范圍m/z為35～550 amu。

揮發(fā)性有機(jī)酸相對含量分析:根據(jù)揮發(fā)性有機(jī)酸的質(zhì)譜特征離子峰(m/z=60),對其特征離子進(jìn)行提取,然后通過GC-MS標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索,得到各色譜峰對應(yīng)的物質(zhì)。最后將各酸的峰面積與內(nèi)標(biāo)中的2-乙基丁酸峰面積的比值作為半定量結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測序后獲得原始數(shù)據(jù),通過過濾帶有測序接頭、未知堿基含量大于1%和低質(zhì)量堿基(Q≤20)含量大于50%的reads后得到clean reads,采用Trinity(v0.27)對clean reads進(jìn)行拼接,然后使用prodigal軟件對拼接組裝得到的contig序列進(jìn)行開放閱讀框預(yù)測,再通過CD-HIT軟件對預(yù)測的基因序列以95%相似度去除冗余基因從而得到非冗余基因集。利用diamond將非冗余基因集與NR數(shù)據(jù)庫比對分析,并利用megan進(jìn)行微生物分類學(xué)解析得到物種信息,篩選出梭菌數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。通過FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments,每百萬片段中來自某一基因每千堿基長度的片段數(shù)目)值對梭菌基因進(jìn)行表達(dá)豐度水平計算。用KEGG(https:∥www.kegg.jp/)和CAZy(http:∥www.cazy.org)數(shù)據(jù)庫將梭菌的非冗余基因集序列進(jìn)行功能注釋和碳水化合物酶注釋。用Canoco5軟件進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA),基于KEGG注釋結(jié)果和KEGG數(shù)據(jù)庫繪制代謝途徑,其余圖均使用Origin 9.0繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅中活性梭菌群落組成分析

通過NR數(shù)據(jù)庫注釋,不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)酒醅中綱水平的細(xì)菌和科水平的梭菌組成如圖1。所有酒醅樣品共注釋到79個細(xì)菌界中的綱,其中優(yōu)勢綱(平均相對豐度>1%)共4個,分別為Bacilli(芽孢桿菌綱,87.23%)、Clostridia(梭菌綱,3.04%)、Gammaproteobacteria(γ-變形菌綱,1.59%)和Actinobacteria(放線菌綱,1.33%)[圖1(a)]。梭菌綱由6個目、27個科及148個屬組成,其相對豐度在0.34%～9.95%,在發(fā)酵3 d時最低,發(fā)酵15 d最高。在科水平下分析梭菌組成,共檢測到1個可鑒定的優(yōu)勢菌科Heliobacteriaceae(太陽桿菌科,1.49%)以及3個次優(yōu)勢菌科(平均相對豐度0.1%～1.0%),Ruminococcaceae(瘤胃菌科,0.87%)、Clostridiaceae(梭菌科,0.34%)和Lachnospiraceae(毛螺旋菌科,0.15%)[圖1(b)]。Heliobacteriaceae、Ruminococcaceae和 Clostridiaceae的相對豐度在發(fā)酵15 d增加至最高,Lachnospiraceae在發(fā)酵45 d增加至最大值。梭菌的變化可能與酒醅理化性質(zhì)和其他微生物有關(guān),如發(fā)酵3 d時酒醅中氧氣的存在會抑制梭菌的生長,導(dǎo)致其豐度僅為0.34%;隨發(fā)酵的進(jìn)行氧氣逐漸消耗,給梭菌提供了合適的生長環(huán)境,其相對豐度增加直至9.95%。隨后梭菌的豐度開始減少,這可能和乳酸桿菌的豐度在發(fā)酵過程中不斷上升有關(guān),其代謝產(chǎn)生的乳酸鏈球菌素和乳酸菌素等細(xì)菌素會抑制革蘭氏陽性菌的生長,導(dǎo)致酒醅中梭菌較少[13]。在不同的發(fā)酵節(jié)點(diǎn)酒醅中梭菌科組成具有明顯差異,在發(fā)酵3 d時,Clostridiaceae具有最高的豐度(0.10%);發(fā)酵7～15 d的酒醅中Heliobacteriaceae快速增加成為主要的優(yōu)勢菌科,其次為Ruminococcaceae;隨著發(fā)酵的繼續(xù)進(jìn)行,Clostridiaceae和Lachnospiraceae成為主要的梭菌。

圖1 不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)酒醅中綱水平細(xì)菌組成和科水平梭菌組成

梭菌群落屬水平上β多樣性分析見圖2。屬水平上中共檢測到148種梭菌,基于這148個屬的相對豐度進(jìn)行PCA分析[圖2(a)]。PC1和PC2分別可以解釋76.69%和12.76%的梭菌群落結(jié)構(gòu)差異,累計解釋了酒醅樣品中梭菌群落組成變化的89.45%。酒醅樣品在第1軸和第2軸上可以明顯被分為3組,其中發(fā)酵3 d樣品聚集在第二象限,7 d和15 d樣品主要聚集在第一象限,而25 d、45 d和60 d樣品聚集在第三象限。同一象限內(nèi)的梭菌群落較為類似,即表明梭菌群落的變化能通過發(fā)酵時間很好地區(qū)分開,且主要的變化發(fā)生在發(fā)酵前25 d。這也表明,酒醅發(fā)酵過程可分為3個階段,即發(fā)酵前期(3～7 d)、發(fā)酵中期(7～25 d)和發(fā)酵后期(25～60 d),與Hu等[14]的研究結(jié)果一致。此外,相對于錢瑋等[15]和胡曉龍等[2]基于DNA水平的研究,本研究檢測到更多梭菌屬(148個),豐富了對酒醅中梭菌的認(rèn)識。

圖2 梭菌群落β多樣性分析

為進(jìn)一步了解酒醅樣品聚類的原因,挑選相對豐度前10(top10)的可鑒定屬進(jìn)行分析,其他的合并為others,圖2(b)展示了這10個屬的相對豐度隨時間的變化。這10個屬的總平均相對豐度占梭菌綱的65.44%,因此可以反映酒醅中梭菌群落水平的整體變化規(guī)律,其中僅Heliobacterium(太陽桿菌屬)為優(yōu)勢屬(1.49%)。從發(fā)酵天數(shù)上看,所有樣品聚為3類,即3 d樣品被分為i組,7 d和15 d被分為ii組,其余樣品被分為iii組,結(jié)果與PCA類似,再次表明發(fā)酵時間是影響酒醅梭菌群落組成的重要因素。梭菌群落變化同樣可聚為3類,其中,Ⅰ包含Heliobacterium、Clostridium(梭菌屬)和Pseudoflavonifractor(假黃銅單胞菌),其相對豐度呈現(xiàn)先增加(3～15 d)后減少的趨勢(15～60 d),而馬箭等[3]在DNA水平上發(fā)現(xiàn)與Clostridium相似的OTU在發(fā)酵第7天顯著高于其他發(fā)酵節(jié)點(diǎn),與本研究結(jié)果類似。Ⅱ中6種梭菌的相對豐度在發(fā)酵25～45 d時較高,在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)增加的趨勢。Ⅲ中僅包含Anaerotruncus(厭氧棍狀菌屬),其相對豐度在發(fā)酵3 d時最高,隨后開始減少。Clostridium是濃香型白酒中研究較多的梭菌綱中的屬,研究表明,Clostridium的相對豐度會隨著窖泥質(zhì)量的增加而增加,因此推斷其在維護(hù)窖泥質(zhì)量和發(fā)酵環(huán)境等方面有重要作用[2],Clostridiumsp.W1還能將乙酸和乙醇轉(zhuǎn)換為丁酸和己酸[13]。Pseudoflavonifractor是一種產(chǎn)丁酸鹽的細(xì)菌,常見于腸道微生物的研究中[16],但很少作為優(yōu)勢菌在白酒研究中有報道,說明到發(fā)酵中期的時候,酒醅已經(jīng)具備了產(chǎn)丁酸和己酸的潛力。Anaerotruncus屬于瘤胃菌科,其分類學(xué)下的物種,如Anaerotruncuscolihominis、Anaerotruncusmassiliensis能產(chǎn)生乙酸、丁酸和琥珀酸作為最終代謝產(chǎn)物[17-18]。Pseudobutyrivibrio(假丁酸弧菌屬)和Butyrivibrio(丁酸弧菌屬)是厭氧環(huán)境中常見的梭菌,其相對豐度分別在發(fā)酵60 d和45 d達(dá)到最高。Pidcock等[19]對Pseudobutyrivibrio和Butyrivibrio的71個基因組進(jìn)行EggNOG注釋發(fā)現(xiàn),其功能條目主要集中在碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝以及細(xì)胞壁/膜/包膜生物發(fā)生上,它們能將大部分遺傳能力用于復(fù)雜多糖的分解和重組,由此產(chǎn)生的單糖經(jīng)過發(fā)酵產(chǎn)生丁酸鹽。

2.2 酒醅梭菌群落的功能特性分析

圖3表示使用KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行6個發(fā)酵節(jié)點(diǎn)酒醅中梭菌富集的基因功能注釋結(jié)果。在一級代謝通路上,代謝注釋到的基因數(shù)量最多(3 306個),其次是基因信息(965個)、環(huán)境信息過程(711個)、細(xì)胞過程(546個)和生物體系統(tǒng)(299個)。在二級通路上,梭菌在碳水化合物代謝(1 013個基因)、全球和概覽地圖(648個)、翻譯(552個)和能量代謝(463個)4個方面的能力最強(qiáng)。酒醅原料中富含大量的碳水化合物,如淀粉、葡萄糖和蔗糖等發(fā)酵底物,而梭菌具有廣泛的底物利用譜,能通過淀粉和蔗糖代謝、糖酵解和丁酸代謝等途徑利用這些底物產(chǎn)生乙酸、丁酸和己酸等重要有機(jī)酸,此外碳水化合物代謝通常伴隨著能量代謝,從而滿足梭菌自身需求[15-16]。梭菌基因的富集結(jié)果說明其參與部分或全部次級代謝物的生物合成、碳代謝和脂肪酸代謝等11種途徑,對白酒中微量元素和有機(jī)酸的產(chǎn)生可能有積極作用。翻譯是合成蛋白質(zhì)的關(guān)鍵步驟,蛋白質(zhì)合成后經(jīng)各種化學(xué)修飾,從而會形成不同功能的蛋白質(zhì)參與到梭菌生理代謝中。能量代謝是代謝中的核心問題,貫穿梭菌的整個生命周期,其作用主要是將有機(jī)物或無機(jī)物轉(zhuǎn)化為通用能源ATP從而維持梭菌的生長代謝。此外,梭菌基因還注釋到膜轉(zhuǎn)運(yùn)基因(401個),說明酒醅中梭菌較為活躍,通過細(xì)胞膜進(jìn)行物質(zhì)交換的代謝較為頻繁;氨基酸代謝也注釋到394個基因,其代謝作用主要用于合成自身獨(dú)特的蛋白質(zhì)、多肽和其他含氮物質(zhì),以產(chǎn)生相應(yīng)的氮源為微生物利用,同時可利用α-酮酸通過胺化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為糖、脂質(zhì)或非必需氨基酸,也可參與三羧酸循環(huán)完全氧化成CO2和水,并釋放出大量能量[20]。酒醅中梭菌活動較為活躍,表達(dá)的基因主要參與代謝活動,這可能對濃香型白酒的發(fā)酵起到積極作用,特別是對碳水化合物的分解產(chǎn)生重要的有機(jī)酸過程。

圖3 酒醅中梭菌KEGG功能注釋分析

2.3 酒醅中揮發(fā)性有機(jī)酸變化規(guī)律及與梭菌的關(guān)聯(lián)性分析

在酒醅樣品共檢測到乙酸、丁酸、戊酸、己酸、苯甲酸、苯丙二酸、3-甲基丁酸和2-甲基丙酸8種碳原子數(shù)小于10的揮發(fā)性有機(jī)酸,具有乳酪酸香、奶酪香和甜香等風(fēng)味,對濃香型白酒的風(fēng)味均有較大貢獻(xiàn)[21]。圖4表示這8種酸的相對含量隨時間的變化。半定量分析結(jié)果表明,苯甲酸是酒醅中相對含量較高的有機(jī)酸,且在發(fā)酵過程中保持較高的水平。相關(guān)研究表明,苯甲酸在白酒中屬于相對含量極微的第3類有機(jī)酸,質(zhì)量濃度一般僅為1 mg/L[22];但其在濃香型白酒中的產(chǎn)生機(jī)制和影響也未見詳細(xì)報道。此外,雖然自發(fā)發(fā)酵產(chǎn)生的微量苯甲酸能給酒體帶來芳香味,但其在食品工業(yè)上常常添加用作廣譜抑菌劑進(jìn)行防腐[23]。己酸是相對含量第2的有機(jī)酸,但其對濃香型白酒風(fēng)味的貢獻(xiàn)最大,經(jīng)酯化反應(yīng)形成的己酸乙酯是衡量濃香型白酒質(zhì)量的重要指標(biāo)之一,主要呈現(xiàn)出窖香和水果香,其相對含量在發(fā)酵第7天增加至最高,發(fā)酵15 d和45 d時相對含量也較多。相對含量較多的還有乙酸、丁酸和戊酸,其對應(yīng)的酯呈現(xiàn)菠蘿香、奶酪香和水蜜桃香,但本研究中丁酸和戊酸的相對含量較少,都在發(fā)酵7 d達(dá)到最大值,發(fā)酵25 d最少,而乙酸主要在發(fā)酵中后期具有較高含量,特別是發(fā)酵45 d。從發(fā)酵節(jié)點(diǎn)上看,酒醅中有機(jī)酸在發(fā)酵3 d時含量最低,隨發(fā)酵的進(jìn)行各有機(jī)酸的相對含量不斷發(fā)生動態(tài)變化,直至發(fā)酵60 d時有機(jī)酸總相對含量達(dá)到最高。乙酸、丁酸、己酸和乳酸通常認(rèn)為是濃香型白酒的四大酸,但是供試樣品中并沒有檢測到乳酸,這可能是因為乳酸是屬于含量較高但是不揮發(fā)的酸,在GC-MS的氫離子火焰檢測器上無響應(yīng),一般需要前衍生或者使用頂空進(jìn)樣,而本研究直接進(jìn)樣無法分析酒醅中的乳酸[24]。

圖4 不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)酒醅中有機(jī)酸組成

盡管酒醅中風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生是多種微生物共同作用的結(jié)果,但仍然可以通過spearman相關(guān)性分析初步解析top10梭菌對揮發(fā)性有機(jī)酸形成的貢獻(xiàn),見表1。乙酸與Butyrivibrio、Inediibacterium和Caldicellulosiruptor呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。丁酸分別與Pseudobutyrivibrio和Pseudoflavonifractor呈顯著負(fù)相關(guān)和正相關(guān)(P<0.05)。己酸與Heliobacterium和Clostridium呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與Anaerotruncus呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。戊酸與Clostridium和Pseudoflavonifractor呈顯著正相關(guān),與Pseudobutyrivibriofractor呈顯著負(fù)相關(guān)。從微生物水平上看,Heliobacterium和Clostridium僅與苯甲酸呈負(fù)相關(guān),Pseudobutyrivibrio與苯甲酸和乙酸呈正相關(guān),而Anaerotruncus僅與苯甲酸呈正相關(guān)。結(jié)合苯甲酸的相對含量以及與梭菌屬的關(guān)系看,苯甲酸在本研究的樣品中很可能是主要由梭菌之外的細(xì)菌或真菌產(chǎn)生,而Heliobacterium和Clostridium對有機(jī)酸的代謝有重要貢獻(xiàn)。

表1 有機(jī)酸與優(yōu)勢梭菌相關(guān)性分析

2.4 重要有機(jī)酸代謝途徑分析

有機(jī)酸類化合物是濃香型白酒中重要的呈味物質(zhì),供試樣品中檢測到的乙酸、己酸、丁酸是濃香型白酒的主要有機(jī)酸[21],因此本研究結(jié)合梭菌物種注釋結(jié)果和KEGG數(shù)據(jù)庫繪制了梭菌參與這3種酸合成的主要途徑(圖5)。其主要涉及ko00010(糖酵解)、ko00620(丙酮酸代謝)、ko00650(丁酸代謝)和ko00062(脂肪酸鏈延長)4條途徑,涉及了梭菌中12種可鑒定的屬及1種不可鑒定屬中的25個基因、22個關(guān)鍵酶。其中Clostridium(9個基因)、Ruminiclostridium(2個基因)和Proteiniclasticum(2個基因)是整個代謝過程中主要的貢獻(xiàn)菌,圖5中熱圖展示了途徑中每一步參與梭菌基因的表達(dá)量(以FPKM值衡量)。在糖酵解途徑中,來自Herbinix、Proteiniclasticum和Clostridium等7種梭菌的磷酸葡萄糖變位酶、6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶等11種碳水化合物酶將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸。其中6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶是2種關(guān)鍵的限速酶,分別對應(yīng)糖酵解途徑中2步不可逆的反應(yīng),因此這2種酶具有調(diào)節(jié)糖酵解速度的作用,不可逆的步驟也保證梭菌能最大程度地利用葡萄糖[25]。在能量代謝方面,1分子葡萄糖分解后凈產(chǎn)生2分子ATP,這是微生物在無氧條件下獲得能量的重要途徑,同時產(chǎn)生一些重要中間體和其他代謝途徑關(guān)聯(lián),其中丙酮酸是重要的中間體之一,可參與到乳酸、乙酸和乙醇等重要的代謝產(chǎn)物的合成途徑中。如在丙酮酸脫氫酶和丙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的催化作用下生成乙酸,這一步反應(yīng)主要是由Clostridiisalibacter和Clostridium參與完成。丙酮酸在氧化還原酶的作用下還原生成另一個必要的中間體乙酰輔酶A。乙酰輔酶A與?；D(zhuǎn)移酶偶聯(lián)生成雙乙酰輔酶A從而進(jìn)入丁酸代謝途徑,這一步僅Oscillibacter(顫桿菌克屬)具有相關(guān)的基因和酶,表明該梭菌可能是鏈接丙酮酸代謝和丁酸代謝2個途徑的重要梭菌,但Oscillibacter在之前的濃香型白酒研究中鮮有報道。雙乙酰輔酶A在一系列酶促反應(yīng)的作用下得到產(chǎn)生丁酸的關(guān)鍵中間體丁酰輔酶A。丁酰輔酶A在乙酰/雙乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的作用下將一個CoA轉(zhuǎn)移到乙酸,同時生成丁酸并釋放乙酰輔酶A開始乙酸鹽延伸。隨后乙酰輔酶A與丁酰輔酶A偶聯(lián),開始丁酸延伸為己酸的脂肪酸延長途徑。在本研究的注釋結(jié)果中,缺失丁酸代謝途徑中的巴豆酰胺輔酶A到丁酰輔酶A的巴豆酰胺輔酶A還原酶及己酸合成相關(guān)的酶,這可能是1)受到測序原理和RNA提取誤差的影響,從而造成梭菌信息的缺失;2)任聰?shù)萚26]和朱曉軍[27]的研究發(fā)現(xiàn)濃香型白酒產(chǎn)己酸的主體菌并不一定屬于梭菌屬,甚至可能存在一些尚未報道的產(chǎn)己酸途徑;3)這可能與供試酒醅樣本中相應(yīng)梭菌含量較低有關(guān),進(jìn)而導(dǎo)致不能有效提取其RNA。

在糖酵解途徑的5個主要反應(yīng)步驟中,梭菌屬的基因表達(dá)量基本在發(fā)酵45 d時增加至最大,Clostridium雖然參與到圖5中第5步的反應(yīng)中,但是其基因表達(dá)量較低,對丙酮酸的形成可能無明顯的促進(jìn)作用。在乙酸的形成步驟中,Clostridium同樣在發(fā)酵45 d時具有最大的表達(dá)量,乙酸的相對含量也在發(fā)酵45 d時最高,表明Clostridium對乙酸的形成具有積極作用,之前的研究也表明Clostridium能將淀粉轉(zhuǎn)化為各種有機(jī)酸[13]。在圖5中第7步、第8步和丁酸代謝的反應(yīng)途徑中,梭菌的基因表達(dá)量均在發(fā)酵45 d最高。由此可見,在濃香型白酒發(fā)酵45 d時梭菌對乙酸和丁酸的貢獻(xiàn)較大,但是對己酸形成的貢獻(xiàn)暫不明確。

3 結(jié) 論

采用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)解析了濃香型白酒6個發(fā)酵節(jié)點(diǎn)酒醅中活性梭菌群落及其功能,并結(jié)合GC-MS探究酒醅中揮發(fā)性有機(jī)酸的變化規(guī)律及與優(yōu)勢活性梭菌之間的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn):酒醅中活性梭菌群落由6個目、27個科及148個屬組成,梭菌群落主要參與到碳水化合物代謝、翻譯和能量代謝等過程,極大地豐富了對酒醅中梭菌群落的認(rèn)識;酒醅中共檢測到8種揮發(fā)性有機(jī)酸,其中乙酸、丁酸和己酸等重要有機(jī)酸在發(fā)酵7 d和45 d時具有較高的含量;通過KEGG數(shù)據(jù)庫注釋發(fā)現(xiàn)梭菌綱中的12種可鑒定屬及不可鑒定屬中的25個基因、22個關(guān)鍵酶參與到糖酵解、丙酮酸代謝和丁酸代謝的途徑中,Clostridium是主要的貢獻(xiàn)菌,發(fā)酵45 d時梭菌具有較大的貢獻(xiàn)。本研究從轉(zhuǎn)錄層面解析了濃香型發(fā)酵酒醅中梭菌的群落多樣性以及功能,揭示了酒醅中梭菌群落的主要貢獻(xiàn)菌(Clostridium)和貢獻(xiàn)節(jié)點(diǎn)(45 d),旨在為提高濃香型白酒的質(zhì)量提供理論支持。