核桃多酚對皮質(zhì)酮損傷PC12細(xì)胞的作用機制

鄒存恩, 李孟雪, 王 珂, 黎 明, 安 磊, 王友升,*

(1.北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心/老年營養(yǎng)與健康教育部重點實驗室,北京 100048;2.山東凱普菲特生物科技有限公司 日照華偉大健康產(chǎn)業(yè)研究院,山東 日照 276801;3.定州市人民醫(yī)院 臨床營養(yǎng)科,河北 定州 073000)

隨著生活節(jié)奏的加快,人們面臨的壓力持續(xù)增加,慢性壓力應(yīng)激引起的大腦功能受損及疾病狀態(tài),如抑郁癥等,對人體健康的危害正日益凸顯?，F(xiàn)有緩解壓力應(yīng)激及抗抑郁治療的藥物大多存在不良反應(yīng)多、起效慢、效率不高和價格昂貴等缺點。研究表明,營養(yǎng)干預(yù)或膳食補充劑在改善情緒和預(yù)防相關(guān)疾病中可能具有獨特優(yōu)勢[1]。

核桃(JuglansregiaL.),又名胡桃,與腰果、榛子、扁桃并稱世界四大干果。自古以來,核桃就被認(rèn)為是健腦益智的佳品。核桃營養(yǎng)價值極為豐富,核桃仁含有大量多聚不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFAs)、多酚類成分、蛋白質(zhì)以及多種礦物質(zhì)等[2-3]。大量動物和人體實驗研究表明,核桃可多方面促進(jìn)大腦健康[4-6]。美國一項為期10年的健康和營養(yǎng)調(diào)查研究數(shù)據(jù)顯示,食用核桃的消費者患抑郁癥的風(fēng)險顯著低于不食用核桃的消費者(降低26%),也明顯低于食用其他堅果的消費者(降低8%)[7]。最近的一項隨機對照實驗顯示,為期8周的核桃飲食干預(yù)可明顯改善非抑郁健康年輕男性的心境和情緒[8]。但目前,關(guān)于核桃潛在改善心境和抗抑郁的功能組分及作用機制尚不清楚。

應(yīng)激性生活事件可誘發(fā)抑郁癥已成為不爭的事實。當(dāng)機體感受應(yīng)激源時,下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic pituitary adrenal axis,HPA)興奮性提高,腎上腺分泌的應(yīng)激激素糖皮質(zhì)類固醇(glucocorticoids,GC,人類為皮質(zhì)醇,嚙齒類動物為皮質(zhì)酮)升高,從而動員儲能,提高心血管張力、糖代謝等。適當(dāng)應(yīng)激反應(yīng)有利于機體渡過短期惡劣環(huán)境,但若機體長期處于不良應(yīng)激狀態(tài),HPA功能持續(xù)亢進(jìn),繼而導(dǎo)致GC水平持續(xù)升高,造成對大腦,特別是海馬等關(guān)鍵腦區(qū)神經(jīng)元的選擇性損傷,被認(rèn)為是抑郁癥發(fā)生發(fā)展的生理生化基礎(chǔ)。體外實驗發(fā)現(xiàn),皮質(zhì)酮可導(dǎo)致類神經(jīng)細(xì)胞如大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12細(xì)胞)出現(xiàn)損傷和凋亡,模擬應(yīng)激狀態(tài)的海馬神經(jīng)元損傷,是目前最常用和最公認(rèn)的壓力應(yīng)激和抑郁癥的體外細(xì)胞模型[9]。經(jīng)典的抗抑郁藥和植物有效成分在該模型上表現(xiàn)出很好的細(xì)胞保護作用[10-12]。

前期研究發(fā)現(xiàn),攝食質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%和9%的核桃飼料8周,可顯著促進(jìn)D-半乳糖腦老化模型大鼠海馬環(huán)磷酸腺苷(cAMP)反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-responsive element-binding protein,CREB)的磷酸化及其下游靶蛋白腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的表達(dá),并上調(diào)海馬齒狀回部位神經(jīng)元再生[13]。CREB及其靶蛋白BDNF是介導(dǎo)神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)可塑性的關(guān)鍵分子,CREB中133位點絲氨酸(S133)的磷酸化是激活CREB轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵,cAMP依賴性蛋白激酶A (cAMP-dependent protein kinase A,PKA) 是調(diào)控這一過程的主要激酶,并受到上游二級信使cAMP的調(diào)控。大量研究證實,PKA/CREB/BDNF 信號是調(diào)控海馬神經(jīng)元損傷及保護的關(guān)鍵細(xì)胞信號通路[14-16]。本研究團隊在研究中證實,核桃多酚可顯著逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞損傷,并上調(diào)PKA/CREB/BDNF信號通路活性[17]。但是,核桃多酚對皮質(zhì)酮所致PC12細(xì)胞損傷是否具有保護作用,其機制是否與PKA/CREB/BDNF信號通路的調(diào)控作用有關(guān)尚未見相關(guān)報道。鑒于此,本研究擬采用皮質(zhì)酮損傷的PC12細(xì)胞模型,探討核桃多酚的細(xì)胞保護作用及信號通路機制,希望為揭示核桃多酚的潛在抗抑郁活性及機制,并為核桃粕資源的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12細(xì)胞),購自美國細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中心(ATCC?CRL1721.1TM)。

RPMI 1640培養(yǎng)基,美國Hyclone公司;馬血清,美國Biological公司;胎牛血清,以色列Biological Industries 公司;胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素雙抗,美國Gibco公司;H89、皮質(zhì)酮、2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)探針、BDNF一抗,美國Sigma公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒、鈣離子試劑盒、二苯甲亞胺細(xì)胞凋亡(Hoechst 33342)染色試劑盒,碧云天生物技術(shù)研究所;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、牛血清白蛋白五組分,北京Biotopped公司;ECL顯影液,北京全品速生物科技有限公司;β-actin一抗、p-PKA 底物(substrate)一抗、CREB 一抗,美國Cell Singal Technology公司;p-CREB(Ser133) 一抗,德國Merck公司;碘化丙啶(propidium iodide,PI),北京蘭博利德公司;蛋白質(zhì)定量試劑盒、羊抗兔二抗、羊抗小鼠二抗,北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Infinite M1000 PRO型酶標(biāo)儀,瑞士 Tecan 公司;Mini-PROTEAN Tetra型垂直電泳槽、Mini-PROTEAN Tetra型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、Universal Hood Ⅲ型顯影儀,美國Bio-Rad;170 liters型CO2培養(yǎng)箱,德國Galaxy S公司;Axiovert 200型倒置顯微鏡,蔡司光學(xué)儀器上海國際貿(mào)易有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1核桃多酚的制備方法及成分鑒定

核桃多酚的制備方法參考本課題組前期研究。脫脂核桃粕經(jīng)粉碎機粉碎后,過200目篩備用。按料液比(g∶mL)1∶50加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇攪拌浸提,重復(fù)3次后合并濾液旋蒸濃縮。濃縮液按1∶1的體積比用乙酸乙酯萃取3次,旋干溶劑得到乙酸乙酯提取物。將提取物依次通過NKA-9和HP-20大孔吸附樹脂進(jìn)行純化,洗脫液經(jīng)45 ℃旋蒸濃縮后,冷凍干燥即得核桃多酚。產(chǎn)物通過UPLC-Q-TOF MS/MS鑒定成分[17]。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)

采用RPMI 1640培養(yǎng)基,配置成含體積分?jǐn)?shù)為10%的馬血清、5%的胎牛血清和1%的雙抗的完全培養(yǎng)液。在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)PC12細(xì)胞。3～4 d傳代1次,取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.3皮質(zhì)酮損傷PC12細(xì)胞模型的建立

將PC12細(xì)胞按照1×104個/孔的密度接種于96孔板中,每孔100 μL孵育過夜。用無血清培養(yǎng)基配置100、200、300、400 μmol/L的皮質(zhì)酮溶液,與PC12細(xì)胞共孵育24 h,每組設(shè)置6個復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL,37 ℃孵育4 h后棄去上清液,每孔加入100 μL DMSO,振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解,用酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光值。相對細(xì)胞活力計算方法見式(1)。

(1)

式(1)中,OD(實驗)為處理后細(xì)胞孔中溶液的吸光值,OD(對照)為未處理細(xì)胞孔中溶液的吸光值,OD(空白)為PBS的吸光值。

1.3.4核桃多酚預(yù)孵育條件下的正常培養(yǎng)PC12細(xì)胞活力的測定

推薦理由:作者傅瑩有深厚的學(xué)術(shù)功底，寶貴的外交經(jīng)驗，她曾任我國駐菲律賓、澳大利亞、英國大使，外交部副部長，十二屆全國人大一至五次會議新聞發(fā)言人。本書集結(jié)傅瑩大使數(shù)年文章和演講精華，內(nèi)容涉及世界秩序、全球格局與中國角色、中美關(guān)系、中俄關(guān)系、東亞問題、南海局勢等，可幫助讀者更好地了解和把握中國對外政策與國際關(guān)系的態(tài)勢和趨勢。

將PC12細(xì)胞按照1×104個/孔的密度接種于96孔板中,每孔100 μL孵育過夜。用無血清培養(yǎng)基配制質(zhì)量濃度為50、75、100、150 μg/mL的核桃多酚培養(yǎng)液,加入96孔板中,對照組加入無血清培養(yǎng)液,每組6個復(fù)孔,孵育24 h。孵育結(jié)束采用MTT法檢測細(xì)胞活力變化。

1.3.5核桃多酚預(yù)孵育條件下的皮質(zhì)酮模型PC12細(xì)胞活力的測定

將PC12細(xì)胞按照1×104個/孔的密度接種于96孔板中,每孔100 μL孵育過夜。加入50、75、100、150 μg/mL的核桃多酚培養(yǎng)液,對照組和模型組加入無血清培養(yǎng)液,孵育12 h。12 h后,棄原培養(yǎng)液,模型組和核桃多酚處理組加入200 μmol/L皮質(zhì)酮(根據(jù)1.3.3中實驗結(jié)果選用200 μmol/L的皮質(zhì)酮建立慢性應(yīng)激模型),對照組加入無血清培養(yǎng)液,孵育24 h。孵育結(jié)束用MTT法測定細(xì)胞活力。

1.3.6PC12細(xì)胞凋亡檢測

將PC12細(xì)胞按照1×105個/mL接種于6孔板中,孵育過夜。加入質(zhì)量濃度為75、150 μg/mL的核桃多酚溶液,對照組和模型組加入無血清培養(yǎng)液,孵育12 h。棄原培養(yǎng)液,模型組與核桃多酚處理組加入200 μmol/L的皮質(zhì)酮溶液,孵育24 h。處理結(jié)束后用PBS洗滌1次,并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定15 min,之后用PBS洗滌5 min,重復(fù)3次。用Hoechst 33342染色液(原液稀釋100倍)在37 ℃下孵育10 min,PBS洗滌5 min,重復(fù)3次,再用PI (5 μg/mL)溶液染色5 min,用PBS洗滌5 min,重復(fù)3次后,在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.7LDH釋放水平檢測

按照1.3.6中的方法進(jìn)行實驗,細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后,每孔取1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液,離心后取上清液按試劑盒說明書操作,通過測定LDH在反應(yīng)體系中生成的丙酮酸的量來表示LDH的活性。用酶標(biāo)儀檢測樣品在450 nm處的吸光值。按式(2)和式(3)計算培養(yǎng)液中LDH活性和相對LDH活性。

(2)

(3)

1.3.8細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平檢測

將PC12細(xì)胞按照1×104個/孔的密度接種于96孔黑邊透明底板,孵育過夜。加入75、150 μg/mL的核桃多酚培養(yǎng)液,孵育12 h。12 h后,加入含有200 μmol/L的皮質(zhì)酮溶液,孵育24 h。棄去培養(yǎng)液,加入無血清培養(yǎng)液配制的5 μmol/L探針溶液,37 ℃培養(yǎng)30 min。用PBS洗滌3次除去未裝載的探針。采用酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長檢測,激發(fā)波長為340 nm和380 nm,發(fā)射波長為510 nm。用340 nm和380 nm兩個熒光波長的比值來表示細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度,最后結(jié)果用相對于對照組鈣離子濃度的比值表示。

1.3.9PKA/CREB/BDNF信號通路活性檢測

按照1.3.6中的方法進(jìn)行實驗,細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后,采用蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞內(nèi)PKA/CREB/BDNF活性或表達(dá)量。用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的 RIPA 裂解液在冰上裂解細(xì)胞,離心收集蛋白,采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離,采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h。再分別加入一抗p-PKA substrate(1∶2 000)、p-CREB(1∶2 000)、CREB(1∶4 000)、BDNF(1∶4 000)、β-actin(1∶4 000),4 ℃搖床孵育過夜。PBST緩沖液洗滌10 min,重復(fù)3次,加入二抗室溫孵育1 h,PBST 緩沖液再洗滌10 min,重復(fù)3次。加入ECL化學(xué)發(fā)光液,并采用凝膠成像儀進(jìn)行曝光檢測,通過Image J軟件進(jìn)行分析,以β-actin為內(nèi)參計算相對灰度值,用來表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。進(jìn)行3次平行實驗。

1.3.10H89阻斷實驗

PC12細(xì)胞種板后過夜培養(yǎng),加入含有10 μmol/L的PKA 抑制劑 H89的空白培養(yǎng)液預(yù)處理1 h。加入質(zhì)量濃度為75、150 μg/mL的核桃多酚,另設(shè)未經(jīng)H89阻斷的加藥組,孵育12 h。棄原培養(yǎng)液,加入含200 μmol/L的皮質(zhì)酮培養(yǎng)液,孵育24 h,通過MTT法測定阻斷PKA后的細(xì)胞活力;另加入質(zhì)量濃度為100 μg/mL的核桃多酚,細(xì)胞處理方法與MTT法相同。采用蛋白免疫印跡法測定阻斷PKA后的 PKA/CREB/BDNF信號通路活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)表示,每個實驗結(jié)果至少進(jìn)行 3次平行實驗。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間兩兩比較采用Dunnett檢驗,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃多酚預(yù)孵育對皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力的影響

建立皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型,模擬壓力應(yīng)激狀態(tài)時高應(yīng)激激素水平對大腦神經(jīng)元損傷狀態(tài),實驗結(jié)果如圖1。由圖1(a)可知,皮質(zhì)酮作用24 h后能夠劑量依賴性地誘導(dǎo)PC12細(xì)胞活力降低。200 μmol/L皮質(zhì)酮處理的PC12細(xì)胞活力下降至對照組的60%左右(P<0.01),適宜進(jìn)行保護作用的評價。因此,確定建立皮質(zhì)酮損傷細(xì)胞模型的條件為200 μmol/L皮質(zhì)酮作用24 h。

**表示與未處理細(xì)胞相比,組間數(shù)據(jù)具有極顯著差異(P<0.01);##表示與僅皮質(zhì)酮處理細(xì)胞相比,組間數(shù)據(jù)具有極顯著差異(P<0.01)。

在核桃多酚保護作用實驗前,先考察核桃多酚對正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞的影響。由圖1(b)可見,核桃多酚(50、75、100、150 μg/mL)作用12 h對PC12細(xì)胞活力無明顯影響,而較高濃度的核桃多酚(200 μg/mL)顯著降低了細(xì)胞活力至80%左右(P<0.01),提示該濃度對PC12細(xì)胞存活有害。因此選用50～150 μg/mL劑量進(jìn)行保護作用實驗。由圖1(c)可見,與損傷細(xì)胞相比,用核桃多酚預(yù)處理12 h,顯著提高了皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力(P<0.01)。核桃多酚質(zhì)量濃度為150 μg/mL時的作用效果最顯著(P<0.01)?；诩?xì)胞活力的量效實驗結(jié)果,后續(xù)實驗選擇代表性有效劑量75 μg/mL和150 μg/mL開展相關(guān)研究。

2.2 核桃多酚預(yù)孵育對皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡、LDH釋放及鈣離子含量的影響

為了進(jìn)一步評價核桃多酚對皮質(zhì)酮損傷的PC12細(xì)胞的保護作用,觀察核桃多酚對細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外LDH釋放量和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響,實驗結(jié)果見圖2。采用Hoechst 33342染色法,通過觀察細(xì)胞染色質(zhì)的變化評價細(xì)胞凋亡情況。由圖2(a)可知:正?；罴?xì)胞呈彌散均勻低藍(lán)色熒光,細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常;皮質(zhì)酮處理后,細(xì)胞核皺縮、染色質(zhì)固縮凝聚,呈現(xiàn)出典型的凋亡樣形態(tài),發(fā)出亮藍(lán)色熒光的凋亡細(xì)胞增多,而且晚期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜受損,PI嵌入DNA顯示淺紅色熒光,壞死細(xì)胞DNA也被PI染色,呈現(xiàn)亮紅色熒光;75、150 μg/mL的核桃多酚預(yù)處理后細(xì)胞核染色質(zhì)形態(tài)正?；?凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯降低。LDH廣泛存在于各種細(xì)胞中,當(dāng)細(xì)胞膜不再完整或受損時,LDH就釋放到培養(yǎng)基中,因此細(xì)胞外LDH水平是細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)。由圖2(b)可知,皮質(zhì)酮處理的細(xì)胞培養(yǎng)液中,LDH水平顯著升高到對照組的1.5倍左右(P<0.01)。核桃多酚預(yù)處理后顯著降低了LDH的釋放。同樣的核桃多酚預(yù)處理顯著降低了由皮質(zhì)酮導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高[圖2(c)]。這些結(jié)果進(jìn)一步證實了核桃多酚對PC12細(xì)胞的保護作用。

##表示與未處理細(xì)胞相比,組間數(shù)據(jù)具有極顯著差異(P<0.01);**表示與僅皮質(zhì)酮處理細(xì)胞相比,組間數(shù)據(jù)具有極顯著差異(P<0.01)。

2.3 核桃多酚預(yù)孵育對皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞PKA/CREB/BDNF神經(jīng)營養(yǎng)通路的影響

PKA是調(diào)控CREB磷酸化的主要上游激酶,可誘導(dǎo)CREB磷酸化而激活CREB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。本研究中,應(yīng)用PKA磷酸化底物的抗體來檢測PKA的活性[18],實驗結(jié)果見圖3。Western blot結(jié)果[圖3(a)]表明,皮質(zhì)酮處理顯著降低了PC12細(xì)胞PKA磷酸化底物表達(dá),抑制PKA的活性(P<0.05),而核桃多酚(75、150 μg/mL)處理顯著上調(diào)PC12細(xì)胞PKA活性,并顯著增加CREB Ser133位點的磷酸化水平[圖3(b)]及其下游蛋白BDNF的表達(dá)(P<0.01)[圖3(c)]。這些結(jié)果表明,核桃多酚處理顯著上調(diào)了PC12細(xì)胞PKA/CREB/BDNF神經(jīng)營養(yǎng)通路,這與前期的研究結(jié)果相一致,可能是核桃多酚發(fā)揮抗皮質(zhì)酮損傷的重要機制。

為未處理細(xì)胞,為皮質(zhì)酮處理細(xì)胞。#表示與未處理細(xì)胞相比,組間數(shù)據(jù)具有顯著差異(P<0.05),##表示與未處理細(xì)胞相比,組間數(shù)據(jù)具有極顯著差異(P<0.01);*表示與僅皮質(zhì)酮處理細(xì)胞相比,組間數(shù)據(jù)具有顯著差異(P<0.05),**表示與僅皮質(zhì)酮處理細(xì)胞相比,組間數(shù)據(jù)具有極顯著差異(P<0.01)。

2.4 阻斷PKA活性對核桃多酚預(yù)孵育的皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的影響

在確定核桃多酚可顯著上調(diào)PKA/CREB/BDNF信號通路基礎(chǔ)上,應(yīng)用PKA特異性抑制劑H89(10 μmol/L)預(yù)處理PC12細(xì)胞1 h,觀察核桃多酚對皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力的影響和阻斷效果,實驗結(jié)果見圖4。圖4(a)顯示,單獨用H89處理不影響PC12細(xì)胞活力,而用H89預(yù)處理取消了核桃多酚(75、150 μg/mL)的細(xì)胞保護作用。同樣,在H89作用于PC12細(xì)胞的情況下,PKA磷酸化底物、磷酸化CREB和BDNF表達(dá)量上調(diào)作用均出現(xiàn)被抑制的現(xiàn)象[圖4(b)、(c)、(d)]。研究結(jié)果表明,上調(diào)PKA/CREB/BDNF通路是核桃多酚改善皮質(zhì)酮引發(fā)PC12細(xì)胞損傷作用的關(guān)鍵機制。

為未處理細(xì)胞,為皮質(zhì)酮處理細(xì)胞,為皮質(zhì)酮與H89共處理細(xì)胞,為僅H89處理細(xì)胞。##表示與未處理細(xì)胞相比,組間數(shù)據(jù)具有極顯著差異(P<0.01);*表示與僅皮質(zhì)酮處理細(xì)胞相比,組間數(shù)據(jù)具有顯著性差異(P<0.05),**表示與僅皮質(zhì)酮處理細(xì)胞相比,組間數(shù)據(jù)具有極顯著差異(P<0.01);&表示與同等劑量多酚處理細(xì)胞相比,組間數(shù)據(jù)具有顯著性差異(P<0.05),&&表示與同等劑量多酚處理細(xì)胞相比,組間數(shù)據(jù)具有極顯著差異(P<0.01)。

3 討 論

壓力應(yīng)激會引起胞內(nèi)信號傳導(dǎo)及基因表達(dá)變化,從而引起特定腦區(qū)神經(jīng)營養(yǎng)障礙,神經(jīng)可塑性下降。神經(jīng)營養(yǎng)因子及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路失調(diào)或改善是抑郁癥發(fā)生與康復(fù)的重要細(xì)胞內(nèi)機制[19]。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族重要成員,是CREB的關(guān)鍵下游靶蛋白,BDNF與其特異性受體酪氨酸激酶受體B(TrkB)結(jié)合后,能夠在促進(jìn)神經(jīng)元的生長、分化,維持成熟神經(jīng)元功能和突觸可塑性方面發(fā)揮重要作用[20]。上調(diào)CREB活性及其靶蛋白BDNF表達(dá)水平被認(rèn)為是抗抑郁劑發(fā)揮作用的重要靶標(biāo)和神經(jīng)營養(yǎng)機制[21]。

研究表明,膳食多酚的消耗量和抑郁相關(guān)癥狀具有顯著的負(fù)相關(guān)[22]。鞣花單寧(ellagitannins,ETs) 和鞣花酸 (ellagic acid,EA)是重要的膳食多酚,存在于多種水果、蔬菜和堅果中,研究顯示,這些多酚類物質(zhì)在多種動物模型上表現(xiàn)出良好的抗抑郁活性[23-24],并可顯著增加抑郁小鼠海馬BDNF表達(dá)量[25]。核桃中的多酚類化合物主要為鞣花單寧類物質(zhì)[26],前期研究中我們應(yīng)用UPLC/MS分析本研究中的核桃多酚樣品,發(fā)現(xiàn)其主要為鞣花單寧或鞣花酸類成分,包括pedunculagin/casuariin、casuarinin/casuarictin、strictinin/isostrictinin、tellimagrandin I、valoneic acid dilactone、sanguisorbic acid dilactone、glansrin C、glansrin B、praecoxin A/platycariin和鞣花酸[17],進(jìn)一步提示核桃多酚及其中的鞣花單寧類成分可能是核桃抗抑郁作用的重要功效組分。

4 結(jié) 論

本研究采用皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型,通過細(xì)胞活力、LDH釋放量和鈣離子濃度等指標(biāo)評價核桃多酚的細(xì)胞保護作用,并進(jìn)一步采用蛋白免疫印跡分析與化學(xué)阻斷方法相結(jié)合的方式,探討核桃多酚細(xì)胞保護作用的分子機制。研究結(jié)果顯示,核桃多酚可顯著逆轉(zhuǎn)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力降低、細(xì)胞凋亡、LDH釋放和鈣超載,發(fā)揮細(xì)胞保護作用,提示核桃多酚具有潛在的抗抑郁活性。進(jìn)一步的機制研究表明,核桃多酚可顯著上調(diào)皮質(zhì)酮損傷PC12細(xì)胞PKA/CREB/BDNF活性或表達(dá),并且這一調(diào)控作用是核桃多酚發(fā)揮細(xì)胞保護作用的關(guān)鍵機制。本研究報道了核桃多酚的潛在抗抑郁活性,但限于體外細(xì)胞實驗,可進(jìn)一步采用動物實驗評價核桃多酚的抗抑郁活性及神經(jīng)營養(yǎng)作用。核桃加工的主要產(chǎn)品為核桃油,榨油的同時生成了大量的副產(chǎn)物核桃粕,而核桃多酚是核桃粕中重要的生物活性物質(zhì)之一。目前核桃粕主要作為飼料或被廢棄。對核桃多酚活性及作用機制的研究可望為核桃粕資源高值化利用以及將核桃多酚作為一種抗抑郁功效成分提供理論參考。