棗瘋病植原體胸苷激酶基因的克隆、序列分析與原核表達

宋傳生,康曉飛,樊慶忠,王俊剛,石 雪,張子汝,譚青青,曾小嬌,劉 芳,李英賽,侯常躍

(菏澤學院 農(nóng)業(yè)與生物工程學院,山東 菏澤 274015)

棗樹(ZiziphusjujubaMill.)是原產(chǎn)于我國且極具特色的干鮮果果樹,也是我國第一大干果樹種[1]。棗樹在我國分布極其廣泛,在北起內(nèi)蒙古包頭,南至廣東豫南,西自新疆喀什,東到遼寧和臺灣省的廣大范圍內(nèi)均有分布[1]。我國棗樹資源豐富,正式發(fā)表的品種達700余種[2]。棗樹耐干旱瘠薄,適種范圍極廣,具有重要的經(jīng)濟、生態(tài)和觀賞價值。然而,由病原原核生物植原體侵染導致的棗瘋病給我國棗樹栽培和棗產(chǎn)業(yè)造成了嚴重危害[3]。棗瘋病俗稱棗樹的“癌癥”,由刺吸式昆蟲和嫁接傳播,棗樹患病后,最快當年便可死亡。目前,棗瘋病等植原體病害可通過注射四環(huán)素或土霉素藥劑、選育抗病品種、田間綜合管理等措施進行防治[4-5],雖然上述措施均能起到一定的效果,但該病依然難以根治。因此,探索新的防控措施防治植原體病害具有重要意義。

植原體隸屬細菌界(Bacteria)軟壁菌門(Tenericutes)柔膜菌綱(Mollicutes)無膽甾原體目(Acholeplasmatales)無膽甾原體科(Acholeplasmataceae)植原體暫定屬(Candidatusgenus Phytoplasma)[6-7],無細胞壁,目前依然難以分離培養(yǎng)[8]。研究表明,寄主植物中的植原體增殖到一定濃度是植原體病害發(fā)生的基礎[9]。植原體細胞增殖離不開其自身DNA的合成,植原體DNA的合成缺少從頭合成途徑,僅含補救途徑[10]。在補救途徑中,細胞通常以核苷和游離堿基為原料在多種酶的催化下合成dNTP,用于DNA的合成和修復。胸苷激酶是僅存在于dTTP補救合成途徑中的酶,也是該途徑中的關鍵酶[10]。

胸苷激酶(thymidine kinase)簡稱TK,在原核生物中簡稱TDK,國際系統(tǒng)命名EC 2.7.1.21。在Mg2+的參與下,該酶能催化2′-脫氧胸苷(2′-dT)磷酸化形成2′-脫氧胸苷-5′-單磷酸(dTMP)[11]。迄今,已報道了2種胸苷激酶,即細胞質(zhì)中的胸苷激酶1(TK1)和線粒體中的胸苷激酶2(TK2)[12]。TK1幾乎存在于所有的生物中,而TK2多存在于動物中,原核生物中僅有TK1。在哺乳動物中,TK1與細胞增殖有關,其基因的表達在細胞周期中被嚴格控制,在細胞周期的G1/S期表達增加,在其他時期不表達[13]。水稻(OryzasativaL.)中,TK1的表達似乎與細胞周期無關,其轉(zhuǎn)錄物存在于所有發(fā)育階段[14]。腫瘤細胞中,TK1可持續(xù)表達,因此在臨床實踐中,TK1作為多種癌癥的預測標志物[15],用于癌癥的篩查和化療效果檢測[16-18],同時也是一些癌癥的抗癌新靶點[19]。

目前,未有關于植原體胸苷激酶及其基因的相關研究報道。本研究首次克隆了棗瘋病胸苷激酶基因,構建了其蛋白質(zhì)原核表達載體,誘導表達并純化了胸苷激酶融合蛋白,為后續(xù)體外測定酶活性和抗體制備等研究奠定了基礎,也為篩選植原體的藥物治療靶點提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

棗瘋病樣品JWB-Heze采自山東菏澤。大腸埃希菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細胞(天根公司)用于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與克隆,E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞用于蛋白質(zhì)的原核表達。pET-28a載體用于基因的克隆、測序與蛋白質(zhì)的原核表達。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆與載體構建策略

根據(jù)NCBI中棗瘋病植原體JWB-nky基因組內(nèi)tdk基因的核苷酸序列設計引物并PCR擴增該序列,PCR產(chǎn)物與經(jīng)過BamH Ⅰ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶線性化的pET-28a載體進行重組反應,把反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞,挑取多個單菌落測序,選取序列正確的克隆提取質(zhì)粒用于后續(xù)的蛋白質(zhì)表達實驗。依據(jù)此策略,可在JWB-Heze TDK蛋白的N端融合32個氨基酸,其中包括6×His標簽和T7標簽。

1.2.2 引物設計與PCR擴增

正向引物JWBtdk28aReFBam:5′-ATGGGTC-GCGGATCCATGGTTTTAAAAAAAGAAGGTTTT-3′,斜體標注的序列為pET-28a載體中BamH Ⅰ酶切位點及左側部分核苷酸序列,下劃線標注的序列為BamH Ⅰ限制酶識別序列;反向引物JWBtdk28aRe-RXho:5′-GGTGGTGGTGCTCGAGTTAATTTATAAA-TTTATGACATTT-3′,斜體標注的序列為pET-28a載體中XhoⅠ酶切位點及右側部分核苷酸序列,下劃線標注的序列為XhoⅠ限制酶識別序列。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反應體系25 μL,含2×TaqMix 12.5 μL,正向引物JWBtdk28aReFBam 0.3 μL,反向引物JWBtdk28aReRXho 0.3 μL,JWB-Heze基因組DNA 1 μL,ddH2O 10.9 μL。PCR反應條件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個循環(huán);72 ℃ 10 min。

1.2.3 原核表達載體構建

利用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收目標片段。利用BamH Ⅰ和XhoⅠ限制酶將pET-28a載體線性化,120 μL酶切反應體系中含BamH Ⅰ 6μL、XhoⅠ 6μL、10×K buffer 12 μL、pET-28a質(zhì)粒60 μL、ddH2O 36 μL。酶切反應條件為37 ℃水浴4 h。酶切的pET-28a線性化載體片段進行瓊脂糖凝膠回收。

將回收的JWB-Hezetdk目標片段與pET-28a線性化載體進行重組反應,5 μL反應體系中含5×In-Fusion Enzyme Premix 1 μL、pET-28a線性化載體3 μL、JWB-Hezetdk目標片段1 μL。反應條件為50 ℃、15 min。

將重組反應產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞,培養(yǎng)后挑取多個單菌落送中美泰和生物技術(北京)有限公司測序,選取序列正確的克隆提取質(zhì)粒保存于-20 ℃?zhèn)溆?為便于描述,將該質(zhì)粒命名為pET-28a-JWB-Heze-tdk。

1.2.4 JWB TDK融合蛋白的表達

將載體轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞,平板培養(yǎng)后挑取單菌落搖菌,待D600約0.4時加入IPTG,在不同的溫度、轉(zhuǎn)速和不同濃度的IPTG條件下進行誘導,搖菌誘導約8 h后,取1 mL菌液用于檢測蛋白質(zhì)表達效果,其余菌體收集到50 mL離心管中,每管收集約100 mL菌液的菌體,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 大量大腸埃希菌菌體非變性蛋白質(zhì)提取

于1.2.4節(jié)中含有菌體的50 mL離心管中加入40 mL菌體裂解液(50 mmol·L-1Tris-HCl,0.5 mol·L-1NaCl,5%甘油,10 mmol·L-1咪唑,1% NP-40,0.25%吐溫-20,pH值8.0),充分漩渦振蕩混勻;加入40 μL 100×蛋白酶抑制劑[不含乙二胺四乙酸(EDTA)]、40 mg溶菌酶粉末、25 mg·mL-1RNaseA 40 μL、10 mg·mL-1DNase I 40 μL,充分漩渦振蕩混勻;冰浴1～2 h,期間多次漩渦振蕩混勻,直至溶液澄清透明;4 ℃,13 000×g離心30 min;將上清液轉(zhuǎn)到新的50 mL離心管中,冰浴備用。

1.2.6 蛋白質(zhì)純化

利用蛋白質(zhì)純化緩沖液(50 mmol·L-1Tris-HCl、0.5 mol·L-1NaCl、5%甘油、0.25%吐溫-20,pH值7.8)和500 mmol·L-1咪唑分別配制咪唑濃度為10、20、50、60、100、150、200、250、400 mmol·L-1的蛋白質(zhì)洗脫緩沖液,備用。

在體積為15 mL的柱子中加入2 mL Ni-IDA 6 FF瓊脂糖樹脂;用10 mL蒸餾水清洗柱子,用10 mL菌體裂解液平衡柱子,將蛋白質(zhì)上清液過柱2次,再用60 mL的菌體裂解液過柱清洗雜蛋白質(zhì);然后依次用4 mL含有不同咪唑濃度的蛋白質(zhì)洗脫緩沖液過柱洗脫目標蛋白質(zhì)。取少量上述各步洗脫液用于SDS-PAGE電泳檢測,其余保存于-20 ℃。

1.2.7 蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳分析

配制濃縮膠為5%和分離膠為12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠。蛋白質(zhì)與2×蛋白質(zhì)上樣緩沖液等體積混合后沸水浴變性,上樣量為10 μL,100 V電壓電泳,待溴酚藍移動至玻璃板底端。將凝膠放于染色液中充分染色,然后放于脫色液中充分脫色。

1.2.8 生物信息學分析

利用DNAMAN 6.0軟件分析和比對序列;利用MEGA 7.0軟件進行多序列比對、遺傳距離計算和進化樹構建;利用ProtParam在線預測蛋白質(zhì)分子量、理論等電點、正負電荷殘基數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)、親水性系數(shù)等;利用SignalP 5.0軟件預測信號肽;利用THMM 2.0軟件分析跨膜結構域;利用Cell-Ploc 2.0軟件預測亞細胞定位;利用Pfam和NCBI CD research軟件分析保守功能域;利用SOPMA軟件分析蛋白質(zhì)二級結構;利用SWISS-MODEL軟件預測蛋白質(zhì)三維結構。

2 結果與分析

2.1 JWB-Heze tdk基因的克隆與原核表達載體構建

利用引物JWBtdk28aReFBam/JWBtdk28aReRXho從棗瘋病JWB-Heze材料總DNA中擴增到約600 bp的目標條帶,而健康棗樹中未擴增到任何條帶。目的條帶切膠純化后重組到pET-28a載體并測序,測序結果表明,JWB-Hezetdk基因的ORF長度為576 bp。序列比對結果顯示,JWB-nky和JWB-Hebei-2018植原體tdk基因的ORF序列一致,而JWB-Heze與二者的tdk僅有1個堿基差異,但JWB-Hezetdk基因可正常編碼蛋白質(zhì),且JWB-Heze、JWB-nky、JWB-Hebei-2018棗瘋病植原體TDK的氨基酸序列無差異,表明我們成功克隆了JWB-Hezetdk基因并成功構建了其原核表達載體。

2.2 JWB-Heze TDK蛋白質(zhì)的生物信息學分析

JWB-Hezetdk基因ORF長度為576 bp,編碼191個氨基酸。ProtParam在線預測結果顯示,JWB-Heze TDK蛋白質(zhì)的分子式為C982H1590N258O277S10,分子量為21.76 ku,理論等電點為9.06,帶負電荷殘基總數(shù)為23,帶正電荷殘基總數(shù)為30,不穩(wěn)定系數(shù)為21.93,表明該蛋白質(zhì)性質(zhì)較為穩(wěn)定。脂肪族氨基酸指數(shù)為101.99,親水性平均系數(shù)為-0.110,表明該蛋白質(zhì)為親水蛋白質(zhì)。

SignalP 5.0軟件分析表明,JWB-Heze TDK蛋白質(zhì)不含信號肽;THMM 2.0在線分析表明,該蛋白質(zhì)無跨膜結構域;Cell-Ploc 2.0軟件預測顯示,該蛋白質(zhì)定位于細胞質(zhì)。Pfam和NCBI的CD Search分析保守功能域分析結果表明,該蛋白質(zhì)屬于胸苷激酶超級家族。

SOPMA在線預測表明,該蛋白質(zhì)二級結構中,α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲分別占氨基酸殘基的36.65%、20.42%和34.03%。以蛋白質(zhì)結構數(shù)據(jù)庫(Protein Data Ban,PDB)中金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)胸苷激酶(PDB:3e2i.1.A)的三維結構為模板,用SWISS-MODEL軟件預測JWB-Heze TDK蛋白質(zhì)三維結構,預測結果如圖1所示。

圖1 預測的JWB-Heze TDK蛋白質(zhì)三維結構Fig.1 Predicted three-dimensional structure of JWB-Heze TDK protein

利用DNAMAN 6.0軟件對不同16Sr組植原體和金黃色葡萄球菌(S.aureus)的TDK,以及智人(Homosapiens)、牛痘病毒(Vacciniavirus)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)的TK1蛋白質(zhì)序列進行多序列比對和相似性分析,結果如圖2所示。a、b、c、d 4個區(qū)域較為保守,這些保守區(qū)域尤其是其中的不變氨基酸殘基可能是胸苷激酶維持其酶活性所必需的。序列相似分析結果顯示,16SrV組的JWB與其他組植原體的胸苷激酶氨基酸序列相似性為47.2%～68.3%,與金黃色葡萄球菌、牛痘病毒、智人的TK1相似性分別為38.50%、29.84%、22.51%,與擬南芥atTK1a和atTK1b的相似性分別為23.27%和21.80%。

2.3 基于tdk基因序列的植原體分類分析

為明確tdk基因序列是否可用于植原體的分子分類,在NCBI公布的植原體基因組中截取tdk基因的ORF序列和16S rDNA序列,共獲得了12個16Sr組內(nèi)46個植原體的相應序列。在查找tdk基因時還發(fā)現(xiàn),所有植原體基因組中的tdk基因均為單拷貝?；蛐蛄斜葘瓦z傳距離計算結果表明,除個別16Sr組內(nèi)的少數(shù)植原體外,絕大多數(shù)植原體tdk基因間的遺傳距離都大于其16S rDNA序列間的遺傳距離,這表明,相比于16S rDNA序列,植原體tdk基因的變異程度更高。而進化樹分析結果顯示(圖3),基于植原體tdk基因序列和16S rDNA序列構建的進化樹高度一致,表明植原體tdk基因序列可較好地用于植原體的分子分類研究。

A,基于植原體tdk序列構建的進化樹;B,基于植原體16S rDNA序列構建的進化樹。▲所注為本研究中克隆的JWB-Heze tdk;進化樹構建方法為NJ法,bootstrap重復次數(shù)為500。A, Phylogenetic tree based on the tdk sequences of Phytoplasmas; B, Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences of phytoplasmas. ▲ shows the JWB-Heze tdk cloned in this study; NJ method was used to construct the phylogenetic tree and the number of bootstrap repeats was 500.圖3 基于植原體tdk和16S rDNA序列構建的進化樹Fig.3 Phylogenetic trees based on phytoplasma tdk sequence and 16S rDNA sequence

2.4 JWB-Heze TDK融合蛋白的表達

為明確IPTG濃度對JWB-Heze TDK融合蛋白誘導表達效果的影響,IPTG濃度分別為0、0.1、1.0 mmol·L-1時,28 ℃、140 r·min-1誘導表達約8 h,結果如圖4所示。在IPTG誘導下,E.coliBL21(DE3)成功表達了JWB-Heze TDK融合蛋白,并且1.0 mmol·L-1IPTG誘導表達的JWB-Heze TDK融合蛋白的量高于0.1 mmol·L-1IPTG。

M,蛋白質(zhì)分子量標準;1～3,pET-28a-JWB-Heze-tdk載體;4～6,pET-28a空載體。1、4,未經(jīng)IPTG誘導;2、5,IPTG濃度為1.0 mmol·L-1;3、6,IPTG濃度為0.1 mmol·L-1。2、3,泳道中最粗的條帶為目標蛋白質(zhì);箭頭所指為目標蛋白質(zhì)的位置。M, Protein marker; 1-3, pET-28a-JWB-Heze-tdk vector; 4-6, pET-28a empty vector. Lanes 1 and 4, not induced by IPTG; Lanes 2 and 5, induced by 1.0 mmol·L-1 IPTG; 3 and 6, induced by 0.1 mmol·L-1 IPTG. The thickest band in lanes 2 and 3 were the target proteins; The arrow indicated the location of the target protein.圖4 JWB-Heze TDK融合蛋白誘導表達結果Fig.4 Expression of the JWB-Heze TDK fusion protein

2.5 可溶性JWB-Heze TDK融合蛋白的純化

收集1.0 mmol·L-1IPTG、28 ℃、140 r·min-1條件下誘導的菌體,將菌體裂解液離心后,取上清液過柱純化,結果未純化到可溶性的JWB-Heze TDK融合蛋白(結果未展示)。用同樣的方法,從0.1 mmol·L-1IPTG、28 ℃、140 r·min-1條件誘導的菌體裂解液上清液中純化目標蛋白質(zhì),結果如圖5所示,純化到了微量的可溶性JWB-Heze TDK融合蛋白。從圖5可知,SF泳道即蛋白質(zhì)上清液中的可溶性JWB-Heze TDK融合蛋白含量極低,遠低于圖2菌體總蛋白質(zhì)(圖2泳道2和3中最粗的條帶)中JWB-Heze TDK的含量,這表明在上述條件下,誘導表達的JWB-Heze TDK蛋白可能主要以包涵體沉淀的形式存在。

M,蛋白質(zhì)分子量標準;SF,菌體裂解液上清液;FT,過柱流穿液;E1～E9,不同濃度咪唑的蛋白質(zhì)洗脫液洗脫的蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)洗脫液中咪唑的濃度分別為10、20、50、60、100、150、200、250、400 mmol·L-1;箭頭所指為目標蛋白質(zhì)的位置。圖7同。M, Protein marker; SF, Cell lysate supernatant; FT, Flow-through liquid; E1-E9, Proteins eluted by eluates containing 10, 20, 50, 60, 100, 150, 200, 250 and 400 mmol·L-1 imidazole respectively; The arrow indicated the location of the target protein. The same as in figure 7.圖5 0.1 mmol·L-1 IPTG、28 ℃、140 r·min-1條件下誘導表達的JWB-Heze TDK融合蛋白的純化結果Fig.5 Purification of JWB-Heze TDK fusion protein induced by 0.1 mmol·L-1 IPTG at 28 ℃ and 140 r·min-1

將上述菌體裂解后離心獲得的沉淀用包涵體清洗液清洗,清洗液離心后將沉淀用含有高濃度尿素的包涵體裂解液裂解,離心后將上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測,結果如圖6所示,誘導表達的JWB-Heze TDK融合蛋白的確主要以包涵體形式存在,且8 mol·L-1的尿素很難將該包涵體裂解。

M,蛋白質(zhì)分子量標準;1,未經(jīng)處理的菌體裂解液沉淀;2、3,分別為菌體裂解液沉淀經(jīng)蒸餾水洗滌后離心獲得的上清液和沉淀;4、5,分別為菌體裂解液沉淀在20 ℃ 8 mol·L-1尿素溶液中處理后離心獲取的上清液和沉淀;6、7,分別為菌體裂解液沉淀在50 ℃ 8 mol·L-1尿素溶液中處理后離心獲得的上清液和沉淀;箭頭所指為目標蛋白質(zhì)的位置。M, Protein marker; 1, Bacterial lysate precipitation without treatment; 2 and 3, Obtained from the distilled water used for washing the bacterial lysate precipitation; 4 and 5, Obtained from the 8 mol·L-1 urea solution used for dissolving the bacterial lysate precipitation at 20 ℃;6 and 7, Obtained from the 8 mol·L-1 urea solution used for dissolving the bacterial lysate precipitation at 50 ℃. The arrow indicated the location of the target protein.圖6 JWB-Heze TDK融合蛋白質(zhì)包涵體的鑒定和裂解結果Fig.6 Identification and lysis of inclusion bodies of the JWB-Heze TDK fusion protein

為獲得較高濃度的可溶性JWB-Heze TDK融合蛋白,在0.1 mmol·L-1IPTG、20 ℃、140 r·min-1的條件下再次誘導表達后純化,結果如圖7所示。SF泳道JWB-Heze TDK融合蛋白的濃度明顯高于圖5中SF泳道JWB-Heze TDK融合蛋白的濃度,這表明較低的溫度有利于誘導可溶性JWB-Heze TDK融合蛋白的形成。圖7還顯示,高于150 mmol·L-1的咪唑容易將JWB-Heze TDK蛋白從Ni-IDA瓊脂糖樹脂中洗脫下來。此次純化獲得了較高濃度的可溶性JWB-Heze TDK融合蛋白,雖然純化的蛋白質(zhì)溶液中含有雜蛋白質(zhì)或目標蛋白質(zhì)發(fā)生了降解,但利用ImageJ軟件分析表明,在洗脫的蛋白質(zhì)溶液中,完整的可溶性JWB-Heze TDK融合蛋白的比例高于75%。

圖7 0.1 mmol·L-1 IPTG、20 ℃、140 r·min-1條件下誘導表達的JWB-Heze TDK融合蛋白的純化結果Fig.7 Purification of JWB-Heze TDK fusion protein induced by 0.1 mmol·L-1 IPTG at 20 ℃ and 140 r·min-1

3 結論與討論

本研究從棗瘋病植原體中克隆了胸苷激酶基因tdk,其ORF長度為576 bp,編碼191個氨基酸,與已知棗瘋病植原體JWB-nky和JWB-Hebei-2018基因組中tdk的ORF長度一致且各有1個堿基差異[20],但三者編碼的氨基酸序列完全相同。對JWB-Heze TDK蛋白質(zhì)序列的電荷、不穩(wěn)定系數(shù)、信號肽、跨膜結構域、亞細胞定位等分析和預測表明,該蛋白質(zhì)為植原體細胞質(zhì)中性質(zhì)相對穩(wěn)定的親水蛋白質(zhì),這可能與該蛋白質(zhì)行使的功能相吻合。因為在生物中,TK1發(fā)揮著合成和修復DNA等生命所必需的基礎功能[11],一旦該酶失活,生物將無法存活。例如,擬南芥基因組包含2個TK1,即AtTK1a和AtTK1b,二者均編碼具有TK活性的酶,雖然AtTK1a和AtTK1b基因的T-DNA插入突變體能正常生長,但雙突變體發(fā)育不良,植株在早期便死亡[21]。本研究通過比對分析植原體和金黃色葡萄球菌TDK,以及牛痘病毒、智人、擬南芥TK1的氨基酸序列還發(fā)現(xiàn),胸苷激酶中存在多個保守區(qū)域,在這些區(qū)域內(nèi),上述物種的一些氨基酸殘基完全一致,推測這些保守區(qū)域尤其是其內(nèi)的不變氨基酸殘基可能是胸苷激酶所必需的,當然這需要嚴格的實驗證明。

由于植原體無法分離培養(yǎng),其分類主要依靠16S rDNA序列相似性和其限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)的分子分類[6,22]。由于16S rDNA非常保守,探尋保守程度適宜的基因進行多基因分類則可使分類結果更為細致和可靠[23-24]。本研究中,搜集了NCBI數(shù)據(jù)庫中幾乎所有的植原體tdk基因ORF序列和對應植原體的16S rDNA序列,并進行了遺傳距離分析和進化樹構建,相比于植原體16S rDNA序列,植原體tdk基因的變異程度更高,而基于tdkORF序列和16S rDNA序列的進化樹結果高度相似,因此,tdk基因適于植原體的分子分類。

為后續(xù)JWB-Heze TDK體外酶活性測定和抗體制備等功能研究需要,制備具有天然構象的可溶性JWB-Heze TDK蛋白質(zhì)非常有必要。原核細胞是快速有效表達和制備蛋白質(zhì)的手段,但該體系有時易于形成包涵體沉淀,這給制備具有天然構象的蛋白質(zhì)帶來了困難。目前,雖然包涵體形成機制尚不十分清晰[25],但已有的研究表明,有利于蛋白質(zhì)不溶性聚集的因素通常都利于包涵體的形成,尤其是蛋白質(zhì)中長的疏水性肽段、高誘導溫度和誘導物濃度等關鍵因素[26-27]。較高的誘導溫度和誘導物濃度會使蛋白質(zhì)表達過快,肽鏈來不及正確折疊而形成不溶性聚集[28-29]。另外,包涵體的形成還與表達菌株、表達載體、培養(yǎng)基等因素有關[30]。本研究中,利用E.coliBL21(DE3)菌株和pET-28a載體在28 ℃、140 r·min-1、1.0 mmol·L-1或0.1 mmol·L-1IPTG條件下,誘導表達的JWB-Heze TDK蛋白質(zhì)含量均較高,但IPTG濃度為1.0 mmol·L-1時,表達的JWB-Heze TDK幾乎全為包涵體,而IPTG濃度為0.1 mmol·L-1時,可溶性JWB-Heze TDK蛋白質(zhì)的比例有所提高;在20 ℃、140 r·min-1、0.1 mmol·L-1IPTG誘導條件下,可溶性JWB-Heze TDK蛋白質(zhì)的比例獲得了大幅提高。因此,較低的溫度和較低的誘導物濃度同樣有利于可溶性JWB-Heze TDK蛋白質(zhì)的形成。

綜上所述,本研究克隆了棗瘋病植原體的胸苷激酶基因,對其胸苷激酶氨基酸序列進行了多種生物信息學分析,進行了基于tdk基因序列的植原體分子分類分析,構建了原核表達載體并進行了可溶性蛋白的誘導表達與純化。該研究結果為棗瘋病植原體胸苷激酶體外酶活性測定和抗體制備奠定了基礎,為深入研究其功能并用于篩選抑制劑以控制植原體病害提供了依據(jù)。