枯草芽孢桿菌對(duì)藜麥霜霉病的防治效果及其促生和改善土壤真菌群落作用

秦楠　周建波　呂紅　任璐　陳亞蕾　田淼　殷輝　趙曉軍

摘要：為研究枯草芽孢桿菌菌株LF17對(duì)藜麥霜霉病的防治效果及其促生和改善土壤真菌群落的作用，根施LF17菌劑進(jìn)而測(cè)定不同處理藜麥苗主要農(nóng)藝性狀指標(biāo)（莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量等）；采用宏基因組測(cè)序技術(shù)分析不同處理的真菌群落結(jié)構(gòu)；通過田間噴施LF17菌劑研究其對(duì)霜霉病的防治效果。結(jié)果表明，處理2的藜麥苗鮮質(zhì)量和莖長(zhǎng)分別比對(duì)照提高54.5%、24.2%，穗長(zhǎng)和千粒質(zhì)量分別比對(duì)照提高20.4%、29.1%。宏基因組分析結(jié)果表明，處理A、處理B與對(duì)照共產(chǎn)生751個(gè)OTUs，其中A與B共有的OTU數(shù)最高；A與B在科與屬水平存在差異，A、B與對(duì)照相比提高了Plectosphaerellaceae、Pyronemataceae等的相對(duì)豐度，降低了Conocybe、Preussia、Stilbella、Fusarium等的相對(duì)豐度；聚類分析表明A、B與對(duì)照的群落組成有明顯差異，說明施用LF17菌劑可以改變土壤中真菌的群落結(jié)構(gòu)，降低土壤中病原菌基數(shù)。田間試驗(yàn)表明LF17菌劑對(duì)霜霉病的防效為59.59%，顯著高于烯酰嗎啉、霜霉威鹽酸鹽等藥劑。本研究表明枯草芽孢桿菌LF17對(duì)藜麥具有促生作用且對(duì)藜麥霜霉病有良好的防治效果。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；藜麥；霜霉?。淮偕?；田間防治

中圖分類號(hào)：S435.129文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）14-0159-05

藜麥（Chenopodium quinoa）為藜屬的一年生雙子葉植物，其單體作物即可滿足人體所需的全部營(yíng)養(yǎng)，是聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）推薦的全營(yíng)養(yǎng)食品［1-2］。我國(guó)藜麥產(chǎn)業(yè)起步較晚，2014年以來，在我國(guó)的山西、青海、甘肅、河北等省份開始規(guī)?；N植。然而，隨著藜麥大面積連作，霜霉病成為生產(chǎn)中的重要病害，嚴(yán)重制約了藜麥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［3］。藜麥霜霉病致病菌為Peronospora variabilis，致使葉片枯黃脫落，嚴(yán)重地塊發(fā)病率達(dá)95%，減產(chǎn)約40%［3］。目前，化學(xué)藥劑是常用防治措施，但防治手段單一容易導(dǎo)致抗藥性、生態(tài)環(huán)境惡化等問題。因此，探索生物防治藜麥霜霉病的方法顯得尤為重要。

芽孢桿菌是重要的生防資源，這類細(xì)菌具有抑制多種植物病原菌的能力，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究和關(guān)注［4-6］。迄今，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)藜麥種子中有生防作用的芽孢桿菌最多，包括好氧芽孢桿菌（Bacillus aerophilus）、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）、南海芽孢桿菌（B. australimaris）、短小芽孢桿菌（B. pumilus）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）。2019年，徐瑛等發(fā)現(xiàn)B. amyloliquefaciens菌株11B91能促進(jìn)藜麥生長(zhǎng)，增加其根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)及鮮質(zhì)量［7］。2022年，趙富清等研究表明B. velezensis菌株LMJB-14的發(fā)酵液浸種有助于促進(jìn)藜麥種子萌發(fā)［8］。

目前，鮮有關(guān)于藜麥霜霉病生物防治的研究；但是有研究表明生防菌可以用來防治其他作物的霜霉?。?-12］。已篩選出B. amyloliquefaciens、B. megaterium對(duì)葡萄霜霉病菌有抑制作用［10］。田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)B. subtilis（菌株B-FS01）的可濕性粉劑對(duì)葡萄霜霉病具有良好的田間應(yīng)用前景，防效與72%霜脲氰·錳鋅可濕性粉劑相當(dāng)［11］。因此，探索B. subtilis對(duì)藜麥霜霉病的促生防病作用對(duì)生產(chǎn)有著重要的現(xiàn)實(shí)和理論意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試生防菌株為1×109 CFU/mL枯草芽孢桿菌水劑（LF17），由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病害研究室提供。

供試藜麥種子為稼祺505，由山西農(nóng)谷稼祺種業(yè)有限公司提供。

供試化學(xué)藥劑：供試藥劑名稱、藥劑類型和使用劑量如表1所示。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌（LF17）對(duì)藜麥的促生測(cè)定

2020年4月8日，在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)東陽(yáng)試驗(yàn)基地溫室中，放置180個(gè)內(nèi)徑20 cm的盆缽，每行（20盆）為 1個(gè)小區(qū)，共設(shè)置3個(gè)處理，3次重復(fù)。每盆中播種藜麥種子（稼祺505）3～5粒，待出苗后定植，在處理組藜麥幼苗周圍分別均勻根施枯草芽孢桿菌（LF17）菌劑10 mL（處理1）、20 mL（處理2），以噴施20 mL清水處理作為空白對(duì)照。每7 d根施1次，共施3次，分別于30 d后將藜麥苗連根挖出，清洗晾干，分別統(tǒng)計(jì)藜麥苗莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量及干質(zhì)量，120 d后統(tǒng)計(jì)藜麥穗長(zhǎng)和千粒質(zhì)量。

1.2.2 枯草芽孢桿菌（LF17）對(duì)藜麥田根圍土壤真菌群落的影響

2022年6月8日，對(duì)盆栽藜麥60 d藜麥苗根施LF17菌劑20 mL（A）、菌劑LF17發(fā)酵液10 mL（B），以根施20 mL清水作空白對(duì)照，每隔7 d根施1次，共3次。30 d后隨機(jī)選取藜麥苗10株，除去地表層雜物，采集藜麥根系，將根系裝入塑料袋，回實(shí)驗(yàn)室后抖落根系附著土壤約10 g。移去表層土壤，采集藜麥根部周圍土壤，每個(gè)處理采集20份土樣、充分混勻，用于土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的分析。提取樣品的總DNA并通過Mini Dorp測(cè)定樣品DNA的濃度及純度后，PCR擴(kuò)增ITS1基因［生工生物工程（上海）股份有限公司］。

1.2.3 枯草芽孢桿菌（LF17）和化學(xué)藥劑對(duì)藜麥霜霉病的田間防效試驗(yàn)

2022年7月8日，在山西省忻州市五臺(tái)縣靈境鄉(xiāng)靈境村的露地藜麥田進(jìn)行，試驗(yàn)地面積為 405 m2，周邊藜麥種植面積約 66 700 m2。試驗(yàn)地土壤偏堿性，肥力較高，澆水便利，管理水平較好。調(diào)查方法：本試驗(yàn)小區(qū)面積為15 m2，每小區(qū)用藥量為 1.25 L；以噴施等量清水處理作為空白對(duì)照，共設(shè)置 9個(gè)處理，3次重復(fù)，每隔 7 d 用藥1次，連續(xù)用藥3次。末次藥后7 d調(diào)查發(fā)病情況，記載每張葉片的病級(jí)。嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為0級(jí)：整張葉片無病斑；1級(jí)：病斑面積占葉片面積的1%～5%；3級(jí)：病斑面積占葉片面積的6%～10%；5級(jí)：病斑面積占葉片面積的11%～25%；7級(jí)：病斑面積占葉片面積的26%～50%；9級(jí)：病斑面積占葉片面積的51%以上。計(jì)算病情指數(shù)及防治效果。

病情指數(shù)=［∑（各級(jí)病葉數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）/調(diào)查總?cè)~數(shù)×9】×100；

防治效果=［（對(duì)照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/對(duì)照區(qū)病情指數(shù)】×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序得到的原始序列進(jìn)行拼接、去除嵌合體后得到高質(zhì)量序列，根據(jù)序列97%的相似度，使用Usearch軟件對(duì)有效序列進(jìn)行聚類分析、劃分多個(gè)OTU，進(jìn)而進(jìn)行序列比對(duì)并獲得真菌組成。最后構(gòu)建物種豐度表、繪制群落結(jié)構(gòu)圖及層次聚類樹（QIIME軟件）。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌（LF17）對(duì)藜麥的促生作用

2.1.1 對(duì)藜麥苗莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量及干質(zhì)量的影響

根施枯草芽孢桿菌（LF17）30 d后，對(duì)照組、處理1、處理2的莖長(zhǎng)分別為12.26、13.46、15.23 cm，處理組和對(duì)照組之間差異顯著，處理2比對(duì)照提高24.2%（圖 1-A）。對(duì)照、處理1、處理2的鮮質(zhì)量分別為0.55、0.60、0.85 g，處理2與處理1、對(duì)照差異顯著，處理2比對(duì)照提高54.5%；對(duì)照、處理1、處理2干質(zhì)量分別為0.05、0.07、0.08 g，處理和對(duì)照差異不顯著（圖1-B）。

2.1.2 對(duì)藜麥穗長(zhǎng)和千粒質(zhì)量的影響

菌劑LF17施用120 d后，對(duì)照、處理1、處理2穗長(zhǎng)分別為98.00、105.33、118.00 cm，處理2和對(duì)照相比差異顯著，處理2比對(duì)照提高20.4%（圖2-A）。對(duì)照、處理1、處理2千粒質(zhì)量分別為78.01、85.34、100.65 g，三者之間差異顯著，處理2比對(duì)照提高29.0%（圖2-B）。

2.2 枯草芽孢桿菌（LF17）對(duì)藜麥田土壤真菌群落的影響

由圖3可知，本試驗(yàn)的測(cè)序量超過40 000讀長(zhǎng)時(shí)曲線趨于平緩，表明取樣合理、置信度高，測(cè)序深度可反映樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)。

本研究的3個(gè)處理（對(duì)照、處理A、處理B）共產(chǎn)生751個(gè)OTU，其中共有的OTU為148個(gè)，占OTU總數(shù)的19.71%。3個(gè)處理的OTU數(shù)分別為366、478、412個(gè)，特有OTU數(shù)依次為84、183、127個(gè)。兩兩共有（對(duì)照與處理A、對(duì)照與處理B、處理A與處理B）的OTU數(shù)依次為為220、210、223個(gè)，處理A與處理B的共有OTU數(shù)最高（圖4）。說明施用LF17后豐富了土壤中真菌的群落結(jié)構(gòu)。

不同處理土壤真菌群落在科水平上不同，豐度前5的科分別為織球殼科（Plectosphaerellaceae）、糞繡傘科（Bolbitiaceae）、毛球殼科（Lasiosphaeriaceae）、火絲菌科（Pyronemataceae）、被孢霉科（Mortierellaceae），在處理A、處理B和對(duì)照中這5類菌群所占比例分別為47.15%、15.38%、54.47%，其中Plectosphaerellaceae是藜麥田土壤中的主要優(yōu)勢(shì)菌群。結(jié)果表明施用生物菌劑LF17顯著降低了Bolbitiaceae、Lasiosphaeriaceae、莢胞腔菌科（Sporormiaceae）、從赤殼科（Nectriaceae）的相對(duì)豐度（圖5）。

不同處理土壤真菌群落在屬水平上不同，結(jié)果表明施用生物菌劑LF17顯著降低了錐蓋傘屬（Conocybe）、柄孢殼屬（Podospora）、光黑殼屬（Preussia）、輪枝菌屬（Gibellulopsis）、束梗孢屬（Stilbella）、鐮刀菌屬（Fusarium）、枝頂孢霉屬（Acremonium）、裂殼屬（Schizothecium）、赤霉菌屬（Gibberella）的相對(duì)豐度；其中Conocybe、Preussia、Stilbella降幅最大，分別為26.40%～26.66%、9.08%～9.11%、7.06%～7.18%。同時(shí)，施用生物菌劑LF17顯著提高了油壺菌屬（Olpidium）、枝孢屬（Cladosporium）、短柄霉屬（Aureobasidium）的相對(duì)豐度（圖6）。

結(jié)果表明，不同處理的土壤真菌群落分為2支，A與B的真菌群落間遺傳距離較近，群落組成相似度高，而對(duì)照則獨(dú)立為一支。說明生物菌劑LF17可改變藜麥田土壤中真菌的群落結(jié)構(gòu)，而添加生物菌劑LF17可使藜麥田土壤中的真菌群落向穩(wěn)定和多樣化方向發(fā)展（圖7）。

2.3 枯草芽孢桿菌（LF17）和化學(xué)藥劑對(duì)藜麥霜霉病的防治效果

供試8種藥劑對(duì)藜麥霜霉病田間防效為33.23%～59.59%，其中枯草芽孢桿菌LF17（60 mL）和甲霜霜霉威的防效較高，分別為59.59%和50.28%，二者無顯著差異；枯草芽孢桿菌LF17（60 mL）與其他6種藥劑相比差異顯著；枯草芽孢桿菌LF17（30 mL）和枯草芽孢桿菌可濕性粉劑防效較低，分別為33.23%、33.33%，二者無顯著差異（圖8）。

3 結(jié)論與討論

生物量是評(píng)價(jià)植株健康狀況最直觀的指標(biāo)之一。2022年，李迪秦等的研究表明枯草芽孢桿菌可增強(qiáng)煙草根系體積和根系活力，提高煙草株高、莖圍、葉面積等農(nóng)藝性狀指標(biāo)［12］。本研究表明根施菌劑LF17后，處理2的藜麥苗鮮質(zhì)量和莖長(zhǎng)比對(duì)照提高54.5%和24.2%，說明菌劑LF17對(duì)藜麥有促生作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)處理2的穗長(zhǎng)和千粒質(zhì)量分別比對(duì)照提高20.4%、29.1%；表明枯草芽孢桿菌能促進(jìn)藜麥的生長(zhǎng)。

土壤真菌在農(nóng)業(yè)植物病害的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要角色。董艷輝等的研究表明，重茬使根際土壤微生物降低、病菌數(shù)量增多，導(dǎo)致藜麥病害逐年加重［13］。因此，調(diào)節(jié)土壤真菌群落，是控制藜麥病害的方法之一。李迪秦等發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可提高土壤細(xì)菌和放線菌的種群數(shù)量，降低真菌的種群數(shù)量［12］。本研究通過根施菌劑LF17，減少了土壤中病原菌（Fusarium、Acremonium等）基數(shù)，進(jìn)而控制藜麥病害發(fā)生［14］。此外，施用菌劑LF17可增加藜麥田土壤中真菌的種類和數(shù)量，使真菌群落多樣化。

生產(chǎn)上主要使用化學(xué)藥劑防治霜霉病，防治措施單一化容易導(dǎo)致病菌抗藥性出現(xiàn)。利用生物菌劑來防治霜霉病安全有效，且不易產(chǎn)生抗藥性。目前生物菌劑已被應(yīng)用于黃瓜、葡萄等作物。張淑梅等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌 ZH-8菌劑對(duì)黃瓜霜霉病的防效為69.12%［15］；申紅妙等發(fā)現(xiàn)，噴霧枯草芽孢桿菌JL4菌懸液3 d后對(duì)葡萄霜霉病的防效為88.0%［16］；李戌彥等報(bào)道噴施枯草芽孢桿菌生物菌劑能夠降低葡萄葉片的SOD和CAT活性，提高葉片對(duì)霜霉病的防治效果［17］。本研究發(fā)現(xiàn)菌劑LF17對(duì)藜麥霜霉病的防治效果為59.59%，說明可以用菌劑LF17防治藜麥霜霉病。

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收稿日期：2022-09-13

基金項(xiàng)目：山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院優(yōu)秀青年基金（編號(hào)：YCX2020YQ22）；山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2022ZDYF117）；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)“特”“優(yōu)”農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展科技支撐工程課題（編號(hào)：TYGC-23）；山西省基礎(chǔ)研究計(jì)劃面上項(xiàng)目（編號(hào)：20210302123419）。

作者簡(jiǎn)介：秦 楠（1987—），男，山西長(zhǎng)治人，碩士，助理研究員，從事雜糧作物病害綠色防控研究。E-mail：372909027@qq.com。

通信作者：趙曉軍，博士，研究員，從事果蔬、雜糧作物病害病原學(xué)、病原菌抗藥性及綜合治理研究，E-mail：zhaoxiaojun0218@163.com；殷 輝，碩士，副研究員，從事雜糧作物病害研究，E-mail：yinhui0806@ 163.com。