植物肉中丙烯酰胺的檢測(cè)在食品儀器分析科教融合中的應(yīng)用研究

劉高麗 吳松 谷存國(guó)

作為食品專業(yè)重要的基礎(chǔ)技能課程，儀器分析實(shí)驗(yàn)是驗(yàn)證和鞏固理論知識(shí)不可缺少的實(shí)踐教學(xué)環(huán)節(jié)。在科教融合理念背景下，儀器分析課程更是培養(yǎng)食品專業(yè)學(xué)生科研創(chuàng)新能力，與鞏固基礎(chǔ)專業(yè)知識(shí)最具有研究意義的一門(mén)學(xué)科。本文將以植物肉中丙烯酰胺測(cè)定的方法為主線，運(yùn)用儀器分析方法進(jìn)行科教融合探索。

一、研究背景

1.科研背景。近年來(lái)，植物蛋白肉以其綠色、健康及可持續(xù)發(fā)展等優(yōu)勢(shì)，被廣大科研工作者所關(guān)注。相對(duì)于國(guó)外植物肉的應(yīng)用已日漸成熟，國(guó)內(nèi)植物肉的發(fā)展剛剛起步，因此深入研究植物肉是一個(gè)非常重要的科研方向。植物肉常用大豆豆粕或大豆分離蛋白等植物性基料為原料，經(jīng)雙螺桿擠壓機(jī)制成植物拉絲蛋白坯料，再進(jìn)一步加工制成有纖維狀態(tài)、類似肉類質(zhì)感的蛋白質(zhì)。這種原料中存在蛋白質(zhì)與糖類的高溫加工過(guò)程，不可避免會(huì)產(chǎn)生美拉德反應(yīng)及其副產(chǎn)物丙烯酰胺。

丙烯酰胺是一類具有生殖毒性的物質(zhì)，而食品檢測(cè)中常用的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法在檢測(cè)過(guò)程中因?yàn)楦邷貧饣^(guò)程可能會(huì)導(dǎo)致丙烯酰胺的產(chǎn)生，所以被認(rèn)為不適合檢測(cè)丙烯酰胺。最前沿的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法為多反應(yīng)檢測(cè)方法，2022年時(shí)也被發(fā)現(xiàn)有纈氨酸、乳酸酰胺與3-氨基丙烯酰胺等干擾物，會(huì)使檢測(cè)結(jié)果偏高，因此要求檢測(cè)過(guò)程中必須證明檢測(cè)方法是可靠的，而且要進(jìn)行充分的驗(yàn)證。

2022年，Nail Altunay發(fā)現(xiàn)紫外可見(jiàn)分光光光度法檢測(cè)丙烯酰胺的檢測(cè)限可以達(dá)到0.2ng/mL-0.6ng/mL，而且相對(duì)于以上儀器對(duì)檢測(cè)環(huán)境要求高、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)操作簡(jiǎn)單、成本低，更適合新手實(shí)驗(yàn)。

2.教學(xué)背景。丙烯酰胺是美拉德反應(yīng)的副產(chǎn)物，也是食品化學(xué)課程中食品糖類這一章節(jié)的內(nèi)容。學(xué)生已經(jīng)了解丙烯酰胺具體產(chǎn)生的反應(yīng)過(guò)程及其對(duì)人體的危害等背景知識(shí)，再利用儀器分析方法進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)時(shí)已理解進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)的重要意義，對(duì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容高度重視。

二、方法設(shè)計(jì)

丙烯酰胺通常在紫外光區(qū)的吸收波長(zhǎng)為240nm或者290nm，溶液受到溶劑的影響，如將其衍生化，使其吸收波長(zhǎng)衍生至可見(jiàn)波長(zhǎng)范圍，檢測(cè)方法將變得更多樣。丙烯酰胺在堿性條件下生成的丙烯酰羥肟酸，可以在酸性條件下與三氯化鐵生成紅棕色絡(luò)合物。

衍生后的丙烯酰胺可使用儀器分析中的比色法與紫外可見(jiàn)分光光度法進(jìn)行檢測(cè)，學(xué)生在掌握各種方法的同時(shí)，還能加深各個(gè)方法之間的聯(lián)系，對(duì)儀器分析有更深刻的認(rèn)識(shí)。

三、方法檢測(cè)

1.試劑與儀器。鹽酸羥胺，NaOH，鹽酸，氯化鐵，丙烯酰胺，市售植物肉，UV-5500紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)。

2.比色法。稱取0.1000g丙烯酰胺，用蒸餾水溶解后移入1000mL容量瓶中，稀釋至刻度，并定為儲(chǔ)備液。分別移取儲(chǔ)備液0mL、0.1mL、0.5mL、1mL、2mL至10mL比色管中，添加蒸餾水至5mL，將溶液配成濃度分別0μg/mL、2μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按濃度大小編號(hào)為1、2、3、4、5。

稱取植物肉1g，于研缽中磨碎。放入20mL離心管中，加入3mL水，超聲提取2min。移取上清液至25mL的具塞量筒中，加入3mL乙腈、石油醚、2g氯化鈉。震蕩，吸取水層溶液至相同比色管中，添加蒸餾水至5mL，編號(hào)為6。

于55℃下，分別將2mL的20%鹽酸羥胺溶液與0.5mL的20%NaOH溶液加入比色管中，搖勻并繼續(xù)反應(yīng)1h。冷卻到室溫后，加入1mL的3N鹽酸與1mL的10%氯化鐵溶液，震蕩。將樣品管與標(biāo)準(zhǔn)系列試管進(jìn)行對(duì)比，對(duì)樣品中丙烯酰胺的含量進(jìn)行初步判斷。

3.薄層層析法。取標(biāo)準(zhǔn)樣品5號(hào)與6號(hào)分別在薄層層析板上進(jìn)行點(diǎn)樣，并將二者的混合點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)樣。將點(diǎn)樣完成的層析板放入展開(kāi)劑（乙酸乙酯：無(wú)水乙醇=1：1）中，展開(kāi)后觀察結(jié)果，如果斑點(diǎn)顏色過(guò)淺，可用固體碘進(jìn)行顯色。

4.紫外可見(jiàn)分光光度法。將上述1-5號(hào)樣品分別裝入玻璃比色皿中，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于510nm下檢測(cè)其吸光度，并制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同的紫外波長(zhǎng)下，檢測(cè)樣品6的吸光度。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)處理

如圖1所示，1-5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的顏色隨著丙烯酰胺的濃度增大而加深，6號(hào)樣品比所有標(biāo)準(zhǔn)樣品的顏色深，初步判斷丙烯酰胺含量大于標(biāo)準(zhǔn)溶液的最大濃度。但眾所周知，植物肉在加工過(guò)程中發(fā)生的美拉德反應(yīng)可以產(chǎn)生類黑精色素，與紅棕色絡(luò)合物顏色相近，如果只是簡(jiǎn)單地根據(jù)顏色來(lái)判斷丙烯酰胺的含量，準(zhǔn)確率較低。

接下來(lái)，使用薄層層析來(lái)判斷呈色物質(zhì)是否一致。選擇標(biāo)準(zhǔn)樣品中的5號(hào)與植物肉樣品6號(hào)進(jìn)行對(duì)比。如圖2所示，5號(hào)與6號(hào)樣品的斑點(diǎn)高度基本一致，混合點(diǎn)也證實(shí)二者為同一種物質(zhì)，說(shuō)明可以通過(guò)顏色來(lái)判斷其含量。

最后，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其具體含量。如圖3所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R值為99%，得到濃度與吸光度的方程為A=0.01301+0.01833c，R2=0.97277。由此得出植物肉的丙烯酰胺含量為1.8μg/g，換算單位為1800μg/kg，為歐盟標(biāo)準(zhǔn)基準(zhǔn)水平值（750μg/kg）的2.4倍，不適合食用。

五、結(jié)論

本文以植物肉的丙烯酰胺檢測(cè)為主線，將比色法、薄層層析法、紫外分光綜合實(shí)驗(yàn)串聯(lián)在一起。比色法讓學(xué)生理解了濃度與顏色的關(guān)系，薄層層析法充分證實(shí)了產(chǎn)生顏色的原因是同一種物質(zhì)，紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)則在兩種方法的基礎(chǔ)上，給出了植物肉中丙烯酰胺的具體含量。在此過(guò)程中，學(xué)生掌握了標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、薄層層析的使用方法、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的使用等基本實(shí)驗(yàn)技能，學(xué)會(huì)了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理的方法，利用Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并利用相關(guān)公式計(jì)算出樣品的濃度。同時(shí)，能夠在實(shí)驗(yàn)中將儀器分析中的光學(xué)分析方法與色譜分析方法結(jié)合起來(lái)，充分利用各種儀器分析方法的優(yōu)缺點(diǎn)，不僅扎實(shí)地鍛煉了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)操作技能，更培養(yǎng)了科學(xué)素養(yǎng)與創(chuàng)新意識(shí)。

總之，以“植物肉中丙烯酰胺的檢測(cè)”進(jìn)行的科教融合實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步幫助學(xué)生了解了食品儀器分析的重要性，為國(guó)家培養(yǎng)科技創(chuàng)新型人才打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，具有重要的戰(zhàn)略意義。

基金項(xiàng)目：漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校研究項(xiàng)目——豆渣復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵的資源化研究（2020-LYZKYYB023）；基于全國(guó)檢驗(yàn)技能競(jìng)賽對(duì)微生物學(xué)檢驗(yàn)實(shí)訓(xùn)項(xiàng)目的融合改進(jìn)與創(chuàng)新（2021-LYZJGYB011）；微生物學(xué)檢驗(yàn)活頁(yè)教材建設(shè)（2021-LYZJGYB016）；2020年微生物學(xué)檢驗(yàn)線上/線下混合式“金課”建設(shè)項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：劉高麗（1985-），女，講師，研究方向?yàn)榛瘜W(xué)、微生物。

*通信作者：谷存國(guó)（1967-），男，主任技師，研究方向?yàn)獒t(yī)學(xué)教育。