艾草等10種精油植物單萜合成酶生物信息學分析

景炳年　魏磊　謝曉陽　劉雨晴　周雍　王偉

摘要 ［目的］分析比較10種富含精油植物mono-TPS核苷酸和氨基酸序列。［方法］通過生物信息學相關軟件和網(wǎng)站比對和分析10種mono-TPS基因及蛋白序列，對其結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、磷酸化位點、親/疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細胞定位、二級結(jié)構(gòu)、功能域、三級結(jié)構(gòu)及進化關系進行預測和分析。［結(jié)果］10種精油植物mono-TPS氨基酸序列結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)基本一致，具有親水性，多不穩(wěn)定，不含跨膜結(jié)構(gòu)域；可能定位在質(zhì)膜、線粒體內(nèi)膜、細胞核或線粒體基質(zhì)中；二級結(jié)構(gòu)以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主要構(gòu)件，序列中包括底物結(jié)合區(qū)、鎂離子結(jié)合位點和天冬氨酸富集區(qū)，具有典型的植物萜類環(huán)化酶活性結(jié)構(gòu)域，是Isoprenoid-Biosyn-C1超級家族成員之一，是一種類異戊二烯生物合成酶。通過進化樹分析單萜合成酶，艾草與玉米進化程度相似。［結(jié)論］該研究結(jié)果可為精油植物單萜化合物的研究提供理論基礎。

關鍵詞 精油植物；單萜合成酶；生物信息學分析

中圖分類號 Q 946文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2023）15-0088-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.15.021

Bioinformatics Analysis of Monoterpene Synthase in Ten Essential Oil Plants Including Artemisia argyi

JING Bing-nian，WEI Lei，XIE Xiao-yang et al

（Henan Plant Natural Products Development Engineering Technology Center，Henan Academy of Sciences，Zhengzhou，Henan 450002）

Abstract ［Objective］To compare and analyze the nucleotide and amino acid sequences of mono-TPSs from ten essential oil rich plants.［Method］The nucleotide and amino acid sequences of ten mono-TPS genes were analyzed using bioinformatic softwares and websites，and the physical and chemical properties，secondary/tertiary structures and functional domains were predicted．［Result］Results showed that the structure and chemical properties of mono-TPSs from the ten essential oil plants were basically consistent，which were hydrophilic，unstable and did not contain transmembrane domains.The ten mono-TPSs might be located in plasma membrane，mitochondrial inner membrane，nucleus or mitochondrial matrix.The α-helix and random coil were found the main component of all the mono-TPS secondary structure.The sequence included substrate binding region，magnesium ion binding site and aspartic acid enrichment region，and had a typical plant terpene cyclase activity domain，belonging to the isoprenoid-biosyn-c1 superfamily.The phylogenetic anylysis showed Artemisia argyi was similar with Zea mays in degree of evolution.［Conclusion］These analysis results can provide a theoretical basis for the study of monoterpenes in essential oil plants.

Key words Essential oil plants;Monoterpene synthase;Bioinformatics analysis

單萜類化合物在植物中廣泛存在，種類繁多，賦予植物特殊的香氣和生物活性，是植物精油主要的組成成分，廣泛應用于食品、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)［1］。如艾草精油，以桉油精、龍腦、馬鞭草烯醇、α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、4-蒈烯、桉葉油醇、γ-松油烯、樟腦、甲酸異莰酯、4-萜烯醇（4.66%）等單萜類化合物最為豐富［2］，既是重要的香味物質(zhì)，又具有良好的抗菌抗病毒效果?；ト~白千層精油，主要成分為蒎烯、檸檬烯、1，8-桉葉素等單萜類化合物［3］，廣泛應用于化妝品和食品保鮮劑。傣藥紫色姜精油，包含α-側(cè)柏烯、β -側(cè)柏烯、α-異松油烯、檜烯、γ-松油烯等單萜類物質(zhì)［4］，在治療多種真菌皮膚疾病及其皮膚保健護理方面頗具獨特療效。

單萜類化合物在植物體內(nèi)的生物合成途徑較為復雜，由多種酶進行表達、催化及合成調(diào)控。其中，單萜合成酶（monoterpene synthase，mono-TPS）是重要的關鍵限速酶之一，調(diào)控2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途徑下游，將共同前體香葉基焦磷酸進行環(huán)化和異構(gòu)化，生成多個立體化學構(gòu)象不同的單萜類化合物［5-7］。生物信息學是一門結(jié)合現(xiàn)代生命與信息科學、數(shù)學、計算機科學等重要學科而形成的新興的交叉學科，它以計算機為工具對蛋白質(zhì)及核酸序列等生物信息進行儲存、檢索和比對分析，從而預測其分子的結(jié)構(gòu)與功能及兩者之間的相互作用關系［8］。生物信息學快速發(fā)展對生命科學影響深遠，并極大促進其他相關發(fā)展領域的進步。

筆者利用生物信息學方法對艾草、紫色姜等10種富含精油的藥用或食用植物的mono-TPS基因及編碼的氨基酸序列的一級結(jié)構(gòu)（包括組成、理化性質(zhì)、親-疏水性和亞細胞定位）、二級結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)域、三級結(jié)構(gòu)和親緣進化關系等進行分析預測，以期為今后開展mono-TPS的表達、轉(zhuǎn)化及功能鑒定等深層次研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

艾草（Artemisia argyi）mono-TPS mRNA序列來自參考文獻［9］，紫色姜（Zingiber montanum）、互葉白千層（Melaleuca alternifolia）、檀香（Santalum album）、鐵觀音茶（Camellia sinensis）、合歡（Albizia julibrissin）、蓖麻（Ricinus communis）、小果咖啡（Coffea arabica）、中華獼猴桃（Actinidia chinensis）和玉米（Zea mays）mono-TPS mRNA序列來自National Center of Biotechnology Information （NCBI）基因序列數(shù)據(jù)庫，登錄號和cDNA長度見表1。

1.2 方法

10種精油植物核苷酸和氨基酸序列通過NCBI網(wǎng)站在線分析；相對分子質(zhì)量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質(zhì)通過Protparam進行在線分析；蛋白質(zhì)磷酸化位點通過NetPhos 3.1 Server進行預測；跨膜結(jié)構(gòu)域通過TMHMM Server v.2.0進行預測；親/疏水性通過ProtScale進行預測；亞細胞定位通過PSORT Prediction進行分析。二級結(jié)構(gòu)通過SOPMA進行分析，功能域通過Conserved domains軟件進行預測；通過SWISS-MODEL完成mono-TPS蛋白高級結(jié)構(gòu)同源建模；通過MEGA7.0.26軟件構(gòu)建mono-TPS系統(tǒng)進化樹。具體網(wǎng)址見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 核苷酸及其氨基酸序列的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)

10種精油植物mono-TPS序列的理化性質(zhì)通過ProtParam在線網(wǎng)站進行分析預測（表3）?？芍猰ono-TPS核苷酸序列起始密碼子都是ATG，終止密碼子是TAG、TGA或TAA；編碼氨基酸數(shù)在527～621，平均為584.7個；各蛋白相對分子質(zhì)量在61 162.97～70 468.28 kD，平均為67 442.74 kD；理論等電點在5.42～6.01，平均為5.68，表明mono-TPS為酸性蛋白。從氨基酸組成上可知，酸性氨基酸殘基比例較堿性氨基酸殘基比例高，表明mono-TPS蛋白為酸性；10種植物mono-TPS蛋白中，亮氨酸（Leu）、天冬氨酸（Asp）、丙氨酸（Ala）、谷氨酸（Glu）、絲氨酸（Ser）和異亮氨酸（Ile）為含量最多的氨基酸殘基?？傇訑?shù)范圍在8 549～9 838，平均為9 437，消光系數(shù)為1.298～1.741，平均為1.507。檀香和蓖麻的不穩(wěn)定系數(shù)小于40，屬穩(wěn)定蛋白，其余均不穩(wěn)定。

2.2 磷酸化位點

磷酸化在蛋白質(zhì)翻譯后修飾中最為普遍，通過對底物蛋白的蘇氨酸、絲氨酸和酪氨酸進行磷酸基團轉(zhuǎn)移而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性和功能，從而調(diào)控各種細胞活動，因而磷酸化位點的確定非常關鍵，是認識蛋白質(zhì)作用分子機理的基礎［10］。該研究中10種精油植物mono-TPS蛋白磷酸化位點通過NetPhos 3.1 Server進行分析預測，個數(shù)最小的是艾草（41個），最多的是玉米（63個）。以艾草為例，共有41個磷酸化位點（圖1），其中19個絲氨酸磷酸化位點，分別是S35、S39、S54、S78、S146、S163、S184、S189、S195、S224、S234、S268、S270、S336、S387、S435、S460、S490、S515；12個蘇氨酸磷酸化位點，分別是T19、T82、T95、T193、T196、T209、T210、T313、T405、T409、T450、T475；10個酪氨酸磷酸化位點，分別是Y84、Y97、Y190、Y340、Y343、Y380、Y414、Y448、Y452、Y522。

2.3 親-疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域和亞細胞定位特征

2.3.1 蛋白親-疏水性的分析預測。

蛋白質(zhì)親-疏水作用是其折疊的主要驅(qū)動力，對親-疏水性的分析和驗證對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、構(gòu)象和功能具有重要意義［11］。筆者采用 Protscale進行預測分析，以艾草為例，多肽鏈第47位氨基酸親水性分值最低（-2.644），第396位氨基酸疏水性分值最高（2.800），親水性和疏水性氨基酸占比分別為65.8%和34.2%，推測為親水性蛋白。其余9種mono-TPS肽鏈親水性氨基酸占比在鐵觀音茶的62.8%到紫色姜的71.5%，推測均為親水性蛋白。

2.3.2 跨膜結(jié)構(gòu)域特征。

跨膜結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)與膜內(nèi)在蛋白的靜電相互作用和氫鍵鍵合相互作用與膜結(jié)合的一段氨基酸片段，一般由20個左右的疏水性氨基酸殘基組成，主要形成α螺旋，常由跨膜蛋白的效應區(qū)域所展現(xiàn)［12］。該研究中10種精油植物mono-TPS蛋白跨膜結(jié)構(gòu)通過TMHMM Server v.2.0進行分析預測，結(jié)果表明（以艾草為例），10個mono-TPS蛋白均沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，說明mono-TPS蛋白不是膜蛋白（圖2）。

2.3.3 亞細胞定位特征。

大多數(shù)在細胞質(zhì)中合成的蛋白質(zhì)會被轉(zhuǎn)運到特定的亞細胞位置中發(fā)揮生物學功能，且只有位置正確時才能正確行使功能，因此對蛋白質(zhì)亞細胞定位的分析預測能極大加速對其結(jié)構(gòu)和功能的研究［13］。該研究中10種精油植物mono-TPS蛋白亞細胞定位通過PSORT Prediction進行分析預測。結(jié)果表明（表4），10種精油植物的亞細胞定位各不相同，其中艾草mono-TPS最有可能定位在質(zhì)膜上，其肯定度為0.700；蓖麻mono-TPS最有可能定位在線粒體內(nèi)膜上，其肯定度為0.570；合歡和小果咖啡最有可能定位在細胞核上，分別為0.760、0.674；互葉白千層則在線粒體基質(zhì)中，為0.653。

2.4 10種精油植物mono-TPS蛋白二級結(jié)構(gòu)預測

在生物信息學領域，很難從蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)預測其高級結(jié)構(gòu)，因而蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測受到很多人重視。二級結(jié)構(gòu)是多肽鏈局部空間結(jié)構(gòu)，是構(gòu)成蛋白質(zhì)高級空間立體結(jié)構(gòu)的基本要素，二級結(jié)構(gòu)的預測分析對研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能有著極其深遠的意義［14］。通過SOPMA分析預測10種精油植物mono-TPS蛋白二級結(jié)構(gòu)，可知10種精油植物mono-TPS中均有4種二級結(jié)構(gòu)元件，包括α螺旋（所占比例最高）、無規(guī)則卷曲、β折疊和延伸鏈。以艾草mono-TPS為例，α螺旋占比72.30%、無規(guī)卷曲占比20.87%、β折疊占比3.80%和延伸鏈占比3.04%。其余9種mono-TPS蛋白4種結(jié)構(gòu)元件組成與艾草mono-TPS相似（表5）。由于α螺旋占比大于45%，而且β折疊占比小于5%，因此10種精油植物mono-TPS蛋白均屬于全α型蛋白。

2.5 蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域的分析預測

功能結(jié)構(gòu)域通常是由50～400個氨基酸殘基構(gòu)成的球狀實體，它在蛋白質(zhì)中可以獨立穩(wěn)定存在，并且與完成蛋白質(zhì)功能有著密切的關系［15］。該研究以艾草mono-TPS為例，其保守區(qū)和功能域通過Conserved domains進行分析預測，結(jié)果如圖3所示。艾草mono-TPS蛋白保守區(qū)域為底物結(jié)合口袋、鎂離子結(jié)合位點和2個天冬氨酸富集區(qū)，具有典型的植物萜類環(huán)化酶活性結(jié)構(gòu)域，能將無環(huán)的異戊二烯二磷酸進行環(huán)化，是Isoprenoid-Biosyn-C1超級家族成員之一。其余9種植物mono-TPS與艾草相似，均屬類異戊二烯生物合成酶。

2.6 10種精油植物mono-TPS蛋白三級結(jié)構(gòu)的預測分析 蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)分子處于天然折疊狀態(tài)的三維構(gòu)象，是在二級結(jié)構(gòu)的基礎上進一步盤繞、折疊形成的［16］，因此預測分析蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)對于認識其功能具有重要意義。筆者以艾草mono-TPS為例，其三級結(jié)構(gòu)通過SWISS-MODEL進行分析預測，同源建模匹配到的模板蛋白為來自楊柳科楊屬植物銀灰楊（Populus canescens）的異戊二烯合成酶（ACCESSION：3n0f.1.A）。2個mono-TPS蛋白序列一致性為31.73%，GMQE值為0.75，因此分析預測結(jié)果較理想。艾草mono-TPS蛋白3D結(jié)構(gòu)通過Swiss Pdb-Viewer工具進行顯示（圖4），表明其為單體蛋白結(jié)構(gòu)。

2.7 10種精油植物mono-TPS蛋白的系統(tǒng)進化樹

進化樹是描述生物體形成或進化順序的拓撲樹結(jié)構(gòu)，通常是二叉樹的形狀，一般由一系列節(jié)點分支組成，節(jié)點代表某個具體序列，節(jié)點之間的連線代表物種之間的親緣關系。進化樹可以分析不同物種之間的親緣關系遠近，有助于判斷生物體在進化過程中的地位及在遺傳本質(zhì)上探究生物體多樣性的產(chǎn)生機制［17］。用MEGA 7.0.26軟件對10種精油植物mono-TPS蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示，10個植物物種之間呈現(xiàn)明顯的親緣關系，其中紫色姜與合歡、互葉白千層與小果咖啡、艾草與玉米、檀香與中華獼猴桃這4組兩兩物種之間親緣關系最近，進化程度距離也最近（圖5）。

3 討論與結(jié)論

不同精油植物中單萜類化合物種類多、香氣特征明顯，其基本碳架由2個異戊二烯單位構(gòu)成，結(jié)構(gòu)最為簡單，其中具有花香和果香的精油或單萜化合物已經(jīng)在食品、空氣清新劑和化妝品等行業(yè)得到廣泛應用，具有生物活性的精油或單萜類化合物也在醫(yī)藥產(chǎn)品和健康產(chǎn)品領域得到廣泛應用。植物中萜類化合物的多樣性主要由于萜類合成酶種類多樣造成的，在一種植物中可能存在多種萜類合成酶［18］，單萜合成酶是單萜生物合成的關鍵酶，決定了單萜結(jié)構(gòu)的多樣性［19］。

單萜合成酶為親水性蛋白，多數(shù)不穩(wěn)定，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域；亞細胞定位預測可能定位在質(zhì)膜線粒體內(nèi)膜、細胞核或線粒體基質(zhì)中。10種精油植物的單萜合成酶的二級結(jié)構(gòu)以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主，均包括底物結(jié)合區(qū)、鎂離子結(jié)合位點和天冬氨酸富集區(qū)，具有典型的植物萜類環(huán)化酶活性結(jié)構(gòu)域，是Isoprenoid-Biosyn-C1超級家族成員之一，是一種類異戊二烯生物合成酶。三級結(jié)構(gòu)預測分析顯示，單萜合成酶為單體結(jié)構(gòu)蛋白。通過系統(tǒng)進化樹分析單萜合成酶，結(jié)果表明，艾草和玉米進化程度相似，與中華獼猴桃、檀香、鐵觀音茶進化相距較遠。

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基金項目 河南省科技攻關項目（222102110219）；河南省科學院重大科研項目聚焦專項（210113003）。

作者簡介 景炳年（1980—），男，甘肅蘭州人，助理研究員，博士，從事植物保護研究。*通信作者，副研究員，博士，從事植物化學及分子生物學研究。

收稿日期 2022-08-29；修回日期 2022-09-21