SSR分子標(biāo)記在紫薇屬植物中的應(yīng)用研究進(jìn)展

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摘要 紫薇屬植物約60種，由于其花色艷麗，花期長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月，且枝葉具有凈化空氣的能力，是著名的園林花卉物種。近年來(lái)，由于紫薇屬新品種較多，難以分析其親緣關(guān)系，而SSR分子標(biāo)記技術(shù)憑借穩(wěn)定性好、多態(tài)性高的特點(diǎn)，在紫薇屬品種間展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景。介紹了SSR標(biāo)記的基本原理、特點(diǎn)和開(kāi)發(fā)方法，綜述了SSR標(biāo)記在紫薇屬遺傳多樣性及親緣關(guān)系、雜種純度鑒定、遺傳連鎖圖譜與DNA指紋圖譜中的應(yīng)用。分析SSR標(biāo)記的特點(diǎn)和基本原理，旨在更全面分析SSR分子標(biāo)記的優(yōu)劣勢(shì)，為今后SSR應(yīng)用于紫薇屬其他品種中提供參考，同時(shí)也為SSR分子標(biāo)記在紫薇屬中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 紫薇屬植物；SSR標(biāo)記；遺傳多樣性；雜種純度鑒定；遺傳圖譜

中圖分類號(hào) S 685.99文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2023）15-0014-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.15.004

Advances in the Application of SSR Molecular Markers in Lagerstroemia

HUANG Jian-rui， MIAO Shen-yu

（School of Life Sciences， Guangzhou University， Guangzhou， Guangdong 510006）

Abstract There are about 60 species of Lagerstroemia， which is a famous garden flower species because of its bright color， flowering period of up to 3 months， and its branches and leaves have the ability to purify the air. In recent years， due to the majority of new varieties of Lagerstroemia， it is difficult to analyze their genetic relationship， and SSR molecular marker technology has shown a broad application prospect among varieties of Lagerstroemia with its good stability and high polymorphism. This paper briefly introduces the principle， characteristics and development methods of SSR molecular markers， and summarizes the applications of SSR markers in Lagerstroemia genetic diversity and kinship， hybrid purity identification， genetic linkage map and DNA fingerprinting. The purpose of analyzing the characteristics and basic principles of SSR markers is to analyze the advantages and disadvantages of SSR molecular markers more comprehensively， so as to provide a reference for the application of SSR in other varieties of Lagerstroemia in the future， and also provide a theoretical basis for the application of SSR molecular markers in Lagerstroemia.

Key words Lagerstroemia；SSR markers；Genetic diversity；Hybrid purity identification；Genetic map

紫薇屬（Lagerstroemia L.）為千屈菜科（Lythraceae），全球約60種，多為落葉或常綠灌木或喬木，分布于亞洲東部、東南部、南部的熱帶、亞熱帶等地區(qū)［1］。目前我國(guó)紫薇屬共有25種，除中國(guó)植物志記載的18種外，還包括安徽紫薇（L.anhuiensis）、小果紫薇（L.minuticarpa）、小葉紫薇（L.parviflora）、勐臘紫薇（L.menglaensis）、菱萼紫薇（L.turbinata）、密毛紫薇（L.densa）和屋久島紫薇（L.fauriei）［2-6］。目前，世界上已培育出500多個(gè)品種［7］。紫薇屬植物花色艷麗，花期長(zhǎng)達(dá)100 d，具優(yōu)良的觀賞價(jià)值，因此其在園藝和園林應(yīng)用中有重要價(jià)值，常被用作行道樹(shù)或盆栽。紫薇屬植物樹(shù)干較為平滑、堅(jiān)硬，且防腐性高，可在家居建材中使用［8］。葉片能夠吸收一定量的有毒氣體，具有凈化空氣的能力，可改善城市或園林中的空氣質(zhì)量［9］。此外，紫薇屬植物有一定的藥用價(jià)值。Judy等［10-11］發(fā)現(xiàn)大花紫薇（L.speciosa）中含有的萜類物質(zhì)可用于治療糖尿病。縱偉等［12］發(fā)現(xiàn)大花紫薇種子油是一種值得開(kāi)發(fā)的保健油脂。憑借優(yōu)良的觀賞價(jià)值、生態(tài)價(jià)值及藥用價(jià)值，紫薇（L.indica）已被12座城市列為市花［13］。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）是指簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列，由1～6個(gè)堿基組成，又稱微衛(wèi)星DNA。SSR長(zhǎng)度為100～300 bp，其廣泛分布于真核生物基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)，有重復(fù)性高、分布均勻、多態(tài)性好的特點(diǎn)［14］。DNA分子標(biāo)記是指在不同生物個(gè)體或種群基因組之間直接反映出不同生物個(gè)體或種基因組之間的差異特征的 DNA片段，它是利用 DNA分子的多態(tài)性來(lái)識(shí)別各種物種的生物技術(shù)。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展，現(xiàn)階段已開(kāi)發(fā)多種分子標(biāo)記手段，如單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（single nucleotide polymorphism，SNP）、限制性片段多態(tài)性標(biāo)記（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（amplified fragment length polymorphism，AFLP）和微衛(wèi)星標(biāo)記（SSR）［15］。SSR由于豐富的多態(tài)性已成為繼單核苷酸多態(tài)性之后用于分析物種遺傳多樣性最有力的生物技術(shù)手段之一［16］。SSR具有重復(fù)次數(shù)多的特點(diǎn)，在同一物種的不同個(gè)體基因型間差異很大，呈現(xiàn)高度多態(tài)性，且穩(wěn)定性好，是用于分析種下居群遺傳多樣性的有力工具［17-20］。微衛(wèi)星已被證實(shí)在植物中具有較高的信息量，并且?guī)в形稽c(diǎn)特異的分子標(biāo)記［21-22］。SSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于群體遺傳學(xué)、分子育種和親緣關(guān)系鑒定研究［23］。

該研究從SSR分子標(biāo)記的特性和原理入手，綜述了SSR分子標(biāo)記在紫薇屬植物中的遺傳多樣性、雜種純度研究、遺傳連鎖譜圖中的應(yīng)用，為今后在紫薇屬中SSR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供理論支撐。

1 SSR分子標(biāo)記的特性

1.1 SSR分子標(biāo)記的基本原理

SSR分子標(biāo)記是一種利用直接分析遺傳材料的多態(tài)性來(lái)識(shí)別其核苷酸排法和外部狀態(tài)表達(dá)法則的技術(shù)。簡(jiǎn)單重復(fù)序列的高度變異表現(xiàn)為SSR數(shù)目的整體或部分變異，同時(shí)Schltterer等［24］研究發(fā)現(xiàn)，DNA復(fù)制過(guò)程中的“鏈滑”（strand slippage）造成同一基因座在特定物種的群體中能有很多等位基因，呈現(xiàn)多個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性。SSR在種間或個(gè)體間的多態(tài)性與這些特異區(qū)域息息相關(guān)。

SSR分子標(biāo)記在設(shè)計(jì)引物時(shí)是以微衛(wèi)星序列兩端的保守序列為依據(jù)，對(duì)含有SSR的基因組DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳可檢測(cè)染色顯帶、分析微衛(wèi)星序列多態(tài)性。根據(jù)分離片段的大小確定基因排布序列及表型并計(jì)算等位基因數(shù)目，最終達(dá)到鑒定目的［25］。

1.2 SSR分子標(biāo)記的特點(diǎn)

SSR分子標(biāo)記在植物鑒定中得到廣泛應(yīng)用是由于其具有以下特征：①?gòu)V泛均勻地分布于真核生物基因組中。Beckman等［26］發(fā)現(xiàn)，人類基因組中大約每6 kb就存在1個(gè)SSR位點(diǎn)，且SSR既存在編碼區(qū)也存在非編碼區(qū)。②SSR兩側(cè)的序列較保守，有利于設(shè)計(jì)特異引物；③大部分重復(fù)序列無(wú)特殊功能，重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)變動(dòng)不影響生物的正常功能，因而在品種間的變異位點(diǎn)位置不受限制，更具多態(tài)性；④根據(jù)SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)出特異引物后，受不定因素影響的可能性較小，結(jié)果是穩(wěn)定的［27］。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列在應(yīng)用中也展現(xiàn)出一些缺陷，在開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記前，必須針對(duì)微衛(wèi)星兩端的保守序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，耗時(shí)長(zhǎng)、花費(fèi)大；且SSR位點(diǎn)可能出現(xiàn)DNA替換、插入、缺失等突變，導(dǎo)致非等位基因的出現(xiàn)［28］。

2 SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)方法

SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)方法有構(gòu)建基因組文庫(kù)篩選法、濾膜富集法、磁珠富集法、基于PCR技術(shù)開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記法、數(shù)據(jù)庫(kù)篩選法等。

構(gòu)建基因組文庫(kù)篩選法簡(jiǎn)單易掌握，是最傳統(tǒng)的獲取SSR位點(diǎn)的方法。該方法是利用提取的DNA片段連接載體后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（Escherichia coli）中構(gòu)建基因組文庫(kù)，再使用SSR探針與文庫(kù)中克隆的DNA雜交，檢測(cè)基因組文庫(kù)中的陽(yáng)性克隆，再依據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)SSR引物［29］。隨后，為解決試驗(yàn)操作繁雜的問(wèn)題，人們采取富集步驟的SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)法，即濾膜富集法、磁珠富集法［30］。該方法通過(guò)SSR探針雜交技術(shù)對(duì)基因片段進(jìn)行富集，再進(jìn)行基因文庫(kù)富集。Malausa等［31］研究表明，富集文庫(kù)測(cè)序能夠有效提高SSR分離效率，比不富集方法的提取效率提高300%，與傳統(tǒng)方法相比能夠有效節(jié)省開(kāi)發(fā)成本。但富集法同樣需要構(gòu)建基因組文庫(kù)，操作較基于PCR技術(shù)開(kāi)發(fā)的方法仍較煩瑣。

為更簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程，基于PCR技術(shù)開(kāi)發(fā)SSR的方法可省去基因文庫(kù)構(gòu)建和磁珠富集，僅需在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增和電泳檢測(cè)擴(kuò)增就能獲得SSR標(biāo)記。其中包括PAPD-SSR法、PCR-SSR法。Cifarelli等［32］嘗試?yán)瞄_(kāi)發(fā)的SSR引物與PCR產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，并成功分離出SSR。

隨著生物信息技術(shù)的提高，利用數(shù)據(jù)庫(kù)篩選法可以避免一系列的復(fù)雜實(shí)驗(yàn)操作，研究者可在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索相關(guān)物種的SSR信息［33-34］。雖然通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索SSR位點(diǎn)方便快捷，但是SSR多態(tài)性不如構(gòu)建基因組文庫(kù)獲得的SSR多態(tài)性豐富。

綜上可知，SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)方法各有優(yōu)劣，在研究過(guò)程中需根據(jù)自身?xiàng)l件合理選擇開(kāi)發(fā)SSR的方法?；赑CR的SSR標(biāo)記由于其高度的多態(tài)性質(zhì)和可轉(zhuǎn)移性，已被證明是研究遺傳多樣性和生物親緣關(guān)系的有效工具［35-36］。

3 SSR標(biāo)記在紫薇屬中的應(yīng)用

遺傳多樣性是指種內(nèi)個(gè)體之間或單一群體內(nèi)不同個(gè)體的遺傳變異總和，遺傳多樣性為種質(zhì)資源保護(hù)和植物利用工作提供理論依據(jù)。紫薇屬植物品種多樣，來(lái)源復(fù)雜，品種鑒定分類較為困難，通常選擇對(duì)品種進(jìn)行聚類分析（unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA），從分子角度將品種歸類，進(jìn)而了解物種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系［37］。由于近親繁殖衰退，遺傳多樣性評(píng)估對(duì)于野生紫薇的育種、種質(zhì)資源管理和保護(hù)策略至關(guān)重要［38］。

3.1 遺傳多樣性與親緣關(guān)系分析

紫薇150年前被引種到美國(guó)南部后，采取雜交育種與生物工程育種手段相結(jié)合，首次進(jìn)行紫薇屬植物在國(guó)外的育種研究［39］。在國(guó)內(nèi)紫薇品種的基礎(chǔ)上，研究人員也對(duì)國(guó)外不同花色性狀的紫薇的遺傳多樣性作出了評(píng)價(jià)，進(jìn)一步建立了更加完善的紫薇品種鑒定體系。喬中全等［40］對(duì)30個(gè)國(guó)外紫薇品種和8個(gè)國(guó)內(nèi)品種的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，開(kāi)發(fā)出70個(gè)具有多態(tài)性的SSR引物，聚類結(jié)果顯示，在遺傳相似性系數(shù)0.736處，將38個(gè)紫薇品種分為3個(gè)類群，在0.760處可進(jìn)一步將38個(gè)品種分為7個(gè)亞群。遺傳距離和遺傳一致度可評(píng)價(jià)品種的遺傳多樣性及親緣關(guān)系，“淮南速生”和“淮南紅葉”之間的遺傳相似性系數(shù)最大則表明兩者親緣關(guān)系最近。徐靜靜等［41］分析了國(guó)內(nèi)不同花色的4個(gè)紫薇群體共48個(gè)樣品，篩選出23個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，Shannons信息指數(shù)和基因多樣性顯示紫薇群體豐富的遺傳多樣性。研究推測(cè)紫薇具有較高的遺傳多樣性的原因可能為：紫薇地理分布較廣，通常分布范圍廣泛的物種的遺傳多樣性高于分布范圍較窄的物種；紫薇的異花傳粉的繁殖方式可能導(dǎo)致紫薇出現(xiàn)遺傳漂變。冷嘉文等［42］針對(duì)30個(gè)來(lái)源美國(guó)的紫薇品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，開(kāi)發(fā)出的10對(duì)引物檢測(cè)到10個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)百分率為100%，并利用聚類分析將紫薇品種歸為4類，該試驗(yàn)充分驗(yàn)證了SSR可用于分析紫薇品種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系。SSR在瀕危物種保護(hù)中也有良好的應(yīng)用價(jià)值。尾葉紫薇（L.caudata）是紫薇屬中僅有的具有花香的物種，其也是培育具花香的紫薇屬新品種的重要育種親本［43-44］。由于人類活動(dòng)已呈瀕危狀態(tài)，此前沒(méi)有針對(duì)尾葉紫薇開(kāi)發(fā)的SSR位點(diǎn)，Cai等［45］第一次從尾葉紫薇中開(kāi)發(fā)了17個(gè)SSR標(biāo)記，并利用這17個(gè)位點(diǎn)在其他紫薇屬物種中擴(kuò)增，大部分位點(diǎn)都能實(shí)現(xiàn)擴(kuò)種擴(kuò)增，這項(xiàng)研究有助于尾葉紫薇的遺傳多樣性和可持續(xù)保護(hù)，第一次實(shí)現(xiàn)了SSR在紫薇屬瀕危物種中的應(yīng)用。隨后，Ye等［46-48］先后獲得尾葉紫薇與地徑、株高性狀、葉片外形連鎖的SSR位點(diǎn)，并補(bǔ)全尾葉紫薇的遺傳多樣性信息。綜上可知，SSR分子標(biāo)記能有效應(yīng)用于紫薇屬遺傳多樣性研究，為其他品種的遺傳多樣性研究提供理論支撐。

3.2 雜交種純度鑒定

雜交育種是將親本雜交，子代獲得不同的遺傳多樣性，再通過(guò)對(duì)雜交后代的篩選，獲得具有雙親優(yōu)良性狀的新品種的育種方式。雜交育種范圍多在種內(nèi)不同品種間，利用SSR從分子層面檢驗(yàn)品種純度，具有準(zhǔn)確性高，在植物各部位、各個(gè)發(fā)育階段均可檢測(cè)，不受環(huán)境影響的優(yōu)點(diǎn)，在其他物種如棉花（Gossypium hirsutum）［49］、綠豆（Vigna radiata）［50］、粟（Setaria italica var.germanica）［51］中的運(yùn)用均取得了較好的鑒定結(jié)果。對(duì)雜交種純度鑒定，能有效確保雜交后代獲得雙親的優(yōu)良基因，成功達(dá)到改良品種的目的。目前紫薇屬新品種篩選主要從花色、抗性、株型等方面篩選。

Pounders等［52］對(duì)大花紫薇和紫薇的雜種后代“Princess”“Monia”通過(guò)SSR標(biāo)記進(jìn)行雜種純度鑒定，得出僅“Princess”為真雜種。Rinehart等［53］采用SSR標(biāo)記檢驗(yàn)出多個(gè)假雜種，Ju等［54］利用SSR標(biāo)記鑒定出紫薇和大花紫薇的真雜種。彭嬋等［55］利用大花紫薇和福建紫薇（Lagerstroemia limii）作為父本分別與紫薇品種進(jìn)行雜交，篩選出15對(duì)在親本間具有多態(tài)性的引物對(duì)51株雜交子代進(jìn)行雜種純度測(cè)試，結(jié)果表明，雜交后代中有38株為真雜種。該試驗(yàn)還將鑒定為真雜種的植株從葉形、株高等形態(tài)方面與雙親進(jìn)行比較，大部分后代的單株表型介于雙親之間。可見(jiàn)，SSR標(biāo)記能夠有效地對(duì)紫薇屬后代雜種純度進(jìn)行檢驗(yàn)。

3.3 遺傳連鎖圖譜與指紋圖譜構(gòu)建

遺傳連鎖圖譜是由遺傳重組后的基因在染色體上的相對(duì)位置來(lái)排列的圖表［56］。遺傳連鎖圖譜由3個(gè)步驟構(gòu)成：選擇作圖群體、對(duì)群體的遺傳標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行分析、構(gòu)建圖譜。利用SSR位點(diǎn)在染色體上的相對(duì)位置組成的圖譜，可以幫助利用分子標(biāo)記所得的遺傳信息來(lái)定位基因，從而為基因定位、育種篩選、縮短育種年限提供了理論基礎(chǔ)。SSR標(biāo)記由于其穩(wěn)定性高、多態(tài)性廣泛等特點(diǎn)，有利于不同連鎖群、圖譜連鎖群的整合，當(dāng)SSR標(biāo)記數(shù)量足夠多時(shí)，構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜能覆蓋整個(gè)基因組［57-58］。

劉陽(yáng)等［59］以屋久島紫薇和3個(gè)具有優(yōu)良觀賞性狀的紫薇品種“Pocomoke”“Creole”“Dallas Red”為親本，選擇100個(gè)子代分別采用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行基因型檢測(cè)，結(jié)果表明，90%的基因型與孟德?tīng)栠z傳定律相吻合，可用于構(gòu)建紫薇遺傳連鎖圖譜。紫薇F1群體的構(gòu)建為紫薇屬遺傳圖譜的構(gòu)建、QTL數(shù)量性狀定位的研究奠定了基礎(chǔ)。隨后，劉陽(yáng)［48］還從35個(gè)紫薇品種中開(kāi)發(fā)了10對(duì)具多態(tài)性的引物，繪制出35個(gè)紫薇品種的DNA指紋圖譜。擴(kuò)增產(chǎn)物的等位基因大小與96個(gè)基因型的預(yù)期等位基因大小一致，表明來(lái)自近緣種的SSR可以用于擴(kuò)增紫薇。

在此之前，Cai等［60］已利用13對(duì)SSR引物針對(duì)中國(guó)紫薇種質(zhì)構(gòu)建了50份SSR指紋圖譜，說(shuō)明SSR標(biāo)記能有效鑒定紫薇屬品種。遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建為今后紫薇在觀賞性狀遺傳規(guī)律的分析研究中奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，SSR標(biāo)記能夠應(yīng)用在部分紫薇品種遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系分析、種子資源鑒定、遺傳連鎖圖譜和指紋圖譜構(gòu)建中，為今后在紫薇屬中的SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

SSR標(biāo)記具有穩(wěn)定性好、重復(fù)性高的特點(diǎn)，在紫薇品種遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系分析、種質(zhì)資源鑒定等方面具有重要應(yīng)用價(jià)值，且其在新品種育種方面便于揭示表型與基因之間的關(guān)系。但SSR標(biāo)記也有開(kāi)發(fā)耗時(shí)長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)煩瑣等缺點(diǎn)，使用SSR引物鑒定需針對(duì)每個(gè)微衛(wèi)星兩端的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物。近年來(lái)，EST-SSR序列得到廣泛應(yīng)用，該方法絕大多數(shù)標(biāo)記均只產(chǎn)生一個(gè)位點(diǎn)，這與其他可產(chǎn)生多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的分子標(biāo)記相比，降低了標(biāo)記效率。目前，從轉(zhuǎn)錄組中提取SSR位點(diǎn)彌補(bǔ)了從基因組中提取成本大的缺點(diǎn)，目前已證明基于轉(zhuǎn)錄組能成功在紫薇屬植物中獲得SSR位點(diǎn)［61-63］。

聚類分析表明，來(lái)自相同地理區(qū)域的品種傾向于聚在一起［64］。多項(xiàng)研究表明，分子標(biāo)記對(duì)紫薇屬植物是適用的，長(zhǎng)期的地理隔離似乎導(dǎo)致了紫薇種質(zhì)資源之間的顯著遺傳分化。紫薇種質(zhì)資源的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和遺傳變異為選擇合適的親本進(jìn)行育種提供了豐富的材料來(lái)源，開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記能夠?yàn)樽限睂贅?gòu)建DNA指紋圖譜、基因定位及克隆等研究奠定基礎(chǔ)。同時(shí)SSR標(biāo)記也展現(xiàn)了在紫薇屬遺傳育種中的巨大潛力和應(yīng)用前景。

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作者簡(jiǎn)介 黃建睿（1997—），女，廣東翁源人，碩士研究生，研究方向：植物資源利用。*通信作者，教授，博士，從事植物多樣性及其保護(hù)研究。

收稿日期 2022-07-21