2型糖尿病患者LCN2、OPG/RANKL信號(hào)通路關(guān)鍵因子相關(guān)性及對(duì)骨質(zhì)疏松的預(yù)測(cè)效能

徐云,白立煒,王迪,耿銳娜,劉北彥

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科,河南 新鄉(xiāng) 453100)

2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)屬全身代謝內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病,長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)可破壞正常骨代謝平衡,誘發(fā)骨質(zhì)疏松。據(jù)統(tǒng)計(jì),T2DM患者骨質(zhì)疏松發(fā)病率為37.80%,隨著時(shí)間推移可引起骨質(zhì)疏松骨折,增加殘疾及死亡風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。資料顯示,成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞間失衡是引起骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]。脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-2(lipocalin-2,LCN2)主要由成骨細(xì)胞合成,除參與糖脂代謝過程外,還可抑制干細(xì)胞骨化,參與骨質(zhì)疏松發(fā)病過程[4]。護(hù)骨素/核因子κB受體活化因子配體(osteoprotegerin/receptoractivator of nuclear factor-κB ligand,OPG/RANKL)信號(hào)通路是迄今發(fā)現(xiàn)的最重要的骨代謝調(diào)節(jié)機(jī)制,其中OPG可抑制骨吸收,RANKL可刺激破骨細(xì)胞分化、成熟,抑制破骨細(xì)胞凋亡。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),OPG/RANKL信號(hào)通路可通過調(diào)控骨代謝參與骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展過程[5]。本研究通過檢測(cè)T2DM患者LCN2、OPG/RANKL信號(hào)通路關(guān)鍵因子表達(dá),分析其間關(guān)系,指導(dǎo)臨床防治。

1 對(duì)象與方法

1.1 臨床資料

選取2020年1月至2022年12月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的140例T2DM患者作為研究組,男80例,女60例;年齡60～85(72.51±3.38)歲;另按照1∶1比例納入140例同期健康體檢者作為對(duì)照組,男75例,女65例;年齡60～83(71.68±3.76)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(審批號(hào)2023312)。

1.2 選取標(biāo)準(zhǔn)

(1)納入標(biāo)準(zhǔn):符合T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)[6],表現(xiàn)為多食、多飲、多尿、原因不明的體重下降,任意時(shí)間隨機(jī)血糖≥11.1 mmol·L-1;簽署知情同意書。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):肝、腎異常;伴影響骨代謝疾病;近3個(gè)月內(nèi)骨折;1型糖尿病;近3個(gè)月內(nèi)服用骨代謝藥物。

1.3 研究方法

1.3.1LCN2、OPG/RANKL信號(hào)通路關(guān)鍵因子

(1)兩組患者至少禁食8 h,采集入院當(dāng)天清晨空腹肘靜脈血4 mL,均分為2份(各2 mL)。(2)LCN2測(cè)定:取2 mL血液標(biāo)本行離心處理(2 500 r·min-1,15 min),采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清LCN2水平。(3)OPG/RANKL信號(hào)通路關(guān)鍵因子測(cè)定:取2 mL血液標(biāo)本行離心處理(1 500 r·min-1,10 min),取上清液,加入等體積磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)及淋巴細(xì)胞分離液,低溫離心20 min,吸出單個(gè)核細(xì)胞層,置于離心管,加3倍體積PBS洗滌,離心取上清液,加入PBS懸浮沉淀,獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞,提取RNA,配置反應(yīng)體系,以GAPDH作內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),反應(yīng)體系:cDNA 2 μL,上游和下游引物各0.8 μL,滅菌蒸餾水6.4 μL,SYBR Green Master Mix 10 μL。引物序列:OPG上游5’GCTGTTCCTACCAAGATTATAC-3’,下游5’GAATCAGAACACAAGTCAGT-3’;RANKL上游5’GCGTACCTACAGACTATC-3’,下游5’GGACACCTGAATGCTAAT-3’;GAPDH上游5’AGGCCGGTGTGAGTATGTC-3’,下游5’TGCCTGCTTCACCACCTTGT-3’。反應(yīng)條件:95 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s,共40個(gè)循環(huán),重復(fù)3次后取OPG和RANKLmRNA均值,繪制熔曲線。采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定OPG和RANKL蛋白水平。

1.3.2分組標(biāo)準(zhǔn)[7]

根據(jù)雙能X線骨密度儀測(cè)定骨密度T值,當(dāng)骨密度T值≥-1提示骨量正常,-2.5<骨密度T值<-1提示骨量減少,骨密度T值≤-2.5提示骨質(zhì)疏松。

1.3.3試劑與儀器

Microfuge 16臺(tái)式微量離心機(jī)購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾特國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司,酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒購(gòu)自北京力波生物科技有限公司,雙能X線骨密度儀購(gòu)自淮安辛宇弘醫(yī)療科技有限公司,離心管購(gòu)自美國(guó)Corning公司,RT-PCR試劑盒購(gòu)自上海西格生物科技有限公司,PCR儀購(gòu)自南京貝登醫(yī)療股份有限公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 LCN2、OPG/RANKL信號(hào)通路關(guān)鍵因子

骨質(zhì)疏松亞組LCN2、RANKLmRNA和LCN2、RANKL蛋白>骨量減少亞組>骨量正常亞組>對(duì)照組,OPGmRNA和OPG蛋白<骨量減少亞組<骨量正常亞組<對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組LCN2、OPG/RANKL信號(hào)通路關(guān)鍵因子

2.2 LCN2與OPG/RANKL信號(hào)通路關(guān)鍵因子相關(guān)性

Pearson結(jié)果顯示,T2DM骨質(zhì)疏松患者LCN2、RANKLmRNA和LCN2、RANKL蛋白呈正相關(guān),與OPGmRNA和OPG蛋白呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 LCN2與OPG/RANKL信號(hào)通路關(guān)鍵因子相關(guān)性(r)

2.3 LCN2與OPG/RANKL信號(hào)通路關(guān)鍵因子交互作用

參照2.1中各指標(biāo)平均值分層,LCN2、RANKLmRNA和LCN2、RANKL蛋白≥平均值、OPGmRNA和OPG蛋白≤平均值為暴露(﹢),反之為非暴露(-)。當(dāng)LCN2、RANKLmRNA和LCN2、RANKL蛋白同時(shí)暴露,T2DM患者骨質(zhì)疏松發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是非暴露的4.875、1.462倍;當(dāng)LCN2、OPGmRNA和LCN2、OPG蛋白同時(shí)暴露,T2DM患者骨質(zhì)疏松發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是非暴露的4.643、6.734倍。見表3。

表3 LCN2與OPG/RANKL信號(hào)通路關(guān)鍵因子交互作用

2.4 LCN2、OPG/RANKL信號(hào)通路關(guān)鍵因子聯(lián)合預(yù)測(cè)T2DM骨質(zhì)疏松效能

以T2DM骨質(zhì)疏松為陽(yáng)性標(biāo)本,骨量減少為陰性標(biāo)本繪制ROC曲線,結(jié)果顯示LCN2聯(lián)合OPG/RANKL信號(hào)通路關(guān)鍵因子預(yù)測(cè)T2DM患者繼發(fā)骨質(zhì)疏松的AUC為0.943(95% CI:0.877～0.980),優(yōu)于單純LCN2、OPGmRNA及OPG蛋白、RANKLmRNA、RANKL蛋白預(yù)測(cè)效能[AUC=0.753(95% CI:0.655～0.834),AUC=0.733(95% CI:0.634～0.817),AUC=0.750(95% CI:0.652～0.832),AUC=0.830(95% CI:0.741～0.898),AUC=0.747(95% CI:0.649～0.829)]。見表4。

表4 LCN2、OPG/RANKL信號(hào)通路關(guān)鍵因子預(yù)測(cè)T2DM骨質(zhì)疏松效能比較

3 討論

T2DM患者受糖代謝異常、高齡因素雙重影響,骨質(zhì)量受損,骨折風(fēng)險(xiǎn)高。文獻(xiàn)報(bào)道,相同骨密度下,T2DM患者骨折風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于非T2DM人群,給其正常生活與工作帶來嚴(yán)重困擾[8-9]。骨密度測(cè)定是骨質(zhì)疏松診斷的金標(biāo)準(zhǔn),但骨密度數(shù)值僅能反映一種病理狀態(tài),臨床醫(yī)生需綜合分析全身狀況方能確診,在此基礎(chǔ)上尋求特異性強(qiáng)、靈敏度高的血清學(xué)指標(biāo)更具現(xiàn)實(shí)意義。

3.1 LCN2與T2DM骨質(zhì)疏松關(guān)系

研究證實(shí)T2DM患者血清LCN2表達(dá)高于健康體檢者[10-11],與本研究觀點(diǎn)相符,考慮原因與T2DM患者存在糖脂代謝異常、胰島素抵抗、肥胖、微炎癥狀態(tài)有關(guān),下調(diào)LCN2有望維持葡萄糖穩(wěn)定,控制T2DM病情。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),小鼠成骨細(xì)胞中LCN2表達(dá)量高于其他組織數(shù)倍,可通過影響骨吸收與骨形成之間平衡誘發(fā)骨質(zhì)疏松[12]。國(guó)外研究表明,上調(diào)破骨細(xì)胞中LCN2表達(dá)可負(fù)向調(diào)控破骨細(xì)胞增殖、分化,增加骨質(zhì)疏松發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[13]。吳靜等[14]研究發(fā)現(xiàn),高LCN2是老年T2DM合并骨質(zhì)疏松的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果顯示,骨質(zhì)疏松亞組血清LCN2水平>骨量減少亞組>骨量正常亞組,且與骨密度呈正相關(guān)。可能機(jī)制為:高LCN2可通過下丘腦調(diào)控?cái)z食行為,影響能量代謝和脂肪增長(zhǎng),間接激活成骨細(xì)胞分化成熟;高LCN2可削弱巨噬細(xì)胞集落刺激因子作用,加快骨鈣磷丟失,增加骨質(zhì)疏松發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。ROC曲線顯示,LCN2單獨(dú)預(yù)測(cè)T2DM骨質(zhì)疏松的AUC為0.75,說明LCN2在T2DM骨質(zhì)疏松預(yù)測(cè)方面具有一定價(jià)值。需注意的是,不同生理病理狀態(tài)下,LCN2表達(dá)和功能存在一定差異,可能會(huì)引起部分?jǐn)?shù)據(jù)偏倚,故建議與其他指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用。

3.2 OPG/RANKL信號(hào)通路關(guān)鍵因子與T2DMG骨質(zhì)疏松關(guān)系

隨著分子生物學(xué)技術(shù)不斷提高,越來越多研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路途徑參與T2DM、骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展[15]。證據(jù)表明,OPG/RANKL信號(hào)通路與Notch信號(hào)通路交叉作用可共同影響胰島β細(xì)胞活性與功能,增加血糖水平,促進(jìn)T2DM病情進(jìn)展[16]。以往研究指出,糖尿病患者血清OPG、RANKL表達(dá)異常,且與胰島素抵抗指數(shù)、糖化血紅蛋白相關(guān)[17]?；诖?本研究初步分析T2DM患者和健康體檢人群外周血單個(gè)核細(xì)胞中OPG、RANKLmRNA和OPG、RANKL蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)研究組RANKLmRNA和RANKL蛋白高于對(duì)照組,OPGmRNA和OPG蛋白低于對(duì)照組,這一結(jié)果提示T2DM發(fā)生與OPG/RANKL信號(hào)通路激活密切相關(guān)。另有研究表明,OPG/RANKL信號(hào)通路激活是骨質(zhì)疏松發(fā)生的重要分子生物學(xué)機(jī)制[18]。RANKL是迄今唯一能直接刺激破骨細(xì)胞發(fā)育的細(xì)胞因子,OPG是RANKL天然誘導(dǎo)受體,生理狀態(tài)下呈動(dòng)態(tài)平衡,一旦兩者間平衡被打破,可造成進(jìn)行性骨量丟失、骨強(qiáng)度降低,從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。研究證實(shí),高糖狀態(tài)可下調(diào)OPG,上調(diào)RANKL,影響骨化,但當(dāng)前研究集中于小鼠實(shí)驗(yàn)[19-20],鮮見其在T2DM骨質(zhì)疏松患者中研究報(bào)道。本研究對(duì)此展開討論分析發(fā)現(xiàn),骨質(zhì)疏松亞組RANKLmRNA和RANKL蛋白>骨量減少亞組>骨量正常亞組,OPGmRNA和OPG蛋白<骨量減少亞組<骨量正常亞組,這一結(jié)果為解釋OPG/RANKL信號(hào)通路可能存在的調(diào)控機(jī)制提供依據(jù),有利于深入研究T2DM骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制。長(zhǎng)期高血糖及老齡化可引起免疫系統(tǒng)功能持續(xù)低度活化,生成過量炎癥細(xì)胞,增加RANKL含量,刺激OPG/RANKL信號(hào)通路,作用于破骨細(xì)胞,減少骨形成,最終形成骨質(zhì)疏松。ROC曲線顯示,RANKL、OPGmRNA和RANKL、OPG蛋白均具有T2DM骨質(zhì)疏松預(yù)測(cè)效能,但仍存在提升空間。

3.3 LCN2、OPG/RANKL信號(hào)通路關(guān)鍵因子聯(lián)合預(yù)測(cè)T2DM骨質(zhì)疏松效能

本研究擬分析LCN2、RANKLmRNA和LCN2、RANKL蛋白、OPGmRNA和OPG蛋白聯(lián)合預(yù)測(cè)T2DM骨質(zhì)疏松效能,AUC為0.943,高于單一指標(biāo)預(yù)測(cè)效能,可幫助準(zhǔn)確有效識(shí)別T2DM骨質(zhì)疏松,指導(dǎo)臨床防治,延緩病情進(jìn)展。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),LCN2不僅與OPG/RANKL信號(hào)通路關(guān)鍵因子存在相關(guān)性,還存在交互作用,該結(jié)果說明兩者存在協(xié)同效應(yīng),可共同促進(jìn)骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展,密切監(jiān)測(cè)LCN2及OPG/RANKL信號(hào)通路關(guān)鍵因子變化有助于協(xié)同預(yù)防骨質(zhì)疏松發(fā)生,提高骨質(zhì)疏松防治水平。

4 結(jié)論

T2DM患者LCN2、OPG、RANKLmRNA和LCN2、OPG、RANKL蛋白呈異常表達(dá),且LCN2與OPG、RANKLmRNA和OPG、RANKL蛋白存在交互作用,聯(lián)合檢測(cè)有助于提高T2DM骨質(zhì)疏松預(yù)測(cè)效能,為臨床診治提供有利依據(jù)。但本研究屬單中心、小樣本量研究,可能限制研究結(jié)果泛化,仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。