棉花窄卷苞葉基因fg 的精細(xì)定位

王康文，王雪平，王軍，梁雨，裴小雨，任翔,3，王星星，張先亮,3*，彭云玲，臧新山,3,4*，馬雄風(fēng),3,4*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/ 甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室/ 甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，蘭州730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 棉花生物育種與綜合利用全國重點實驗室/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部棉花生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，河南 安陽 455000；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院西部農(nóng)業(yè)研究中心，新疆 昌吉 831100；4.鄭州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，鄭州 450000）

棉花是重要的天然纖維作物，也是重要的油料作物，在我國國民經(jīng)濟(jì)中處于戰(zhàn)略地位。新疆是我國主要的商品棉生產(chǎn)基地。目前，新疆北疆地區(qū)已基本實現(xiàn)棉花機(jī)械化采摘，南疆地區(qū)機(jī)采棉面積占比逐年增加。機(jī)采棉技術(shù)的推廣運用對全國棉花產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要的推動作用[1]。棉花在機(jī)械收獲時混入的雜質(zhì)較多一直是困擾紡織工業(yè)的主要難題。目前，我國的機(jī)采棉含雜率普遍較高，一般在12%～16%，最高達(dá)到20%[2]，導(dǎo)致后續(xù)籽棉加工清理工序增多、纖維品質(zhì)顯著下降。

棉花一般有3 片苞葉，呈心臟形，緊貼蕾鈴，苞葉與蕾鈴發(fā)育、光合產(chǎn)物積累、病蟲害防治和紡紗品質(zhì)密切相關(guān)[3]。已發(fā)現(xiàn)的棉花苞葉變異類型主要包括窄卷苞葉[4-5]、凋萎苞片[6]和狹薄卷苞葉[7]。1940 年，美國阿肯色州棉農(nóng)Frego 首次發(fā)現(xiàn)棉花窄卷苞葉突變株，窄卷苞葉狹長、扭曲翻轉(zhuǎn)生長，與絮鈴貼合不緊密；窄卷苞葉突變體在吐絮期苞葉自然下卷，至采收期干枯苞葉與籽棉分離，且處在鈴殼之下，因此可以降低機(jī)采棉含雜率[7]。

1955 年，Green[5]證明棉花窄卷苞葉的遺傳受1 對隱性基因控制。2010 年，Li 等[4]利用陸地棉（Gossypium hirsutum）T582（含fg基因）和海島棉（G.barbadense）Hai7124 的F2群體，將窄卷苞葉基因fg定位在A03 染色體長臂上簡單序列重復(fù)（simple sequence repeat,SSR）標(biāo)記NAU3016 和NAU3172 之間，fg與NAU3016 和NAU3172 的遺傳距離分別為0.3 cM （centiMorgan，厘摩）和4.7 cM，對應(yīng)的物理區(qū)間為1.87～3.85 Mb（million base pair,百萬堿基對），物理距離為1.98 Mb。2017 年，Zhu 等[8]利用混合分組分析測序法（bulked segregate analysis-sequencing, BSA-Seq）將fg基因定位在A03 染色體上物理位置0.00～4.50 Mb 區(qū)間內(nèi)。

本研究以陸地棉T582 為母本，分別與父本陸地棉TM-1、海島棉3-79 雜交構(gòu)建2 個F2分離群體，開發(fā)插入缺失（insertion-deletion, Indel）分子標(biāo)記對窄卷苞葉基因fg進(jìn)行精細(xì)定位，為該基因的圖位克隆和育種利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

配制雜交組合所用的親本材料為陸地棉T582、陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1 和海島棉品種3-79，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所國家棉花種質(zhì)中期庫提供，本課題進(jìn)行多年連續(xù)自交保存。

親本苞葉性狀穩(wěn)定，3-79 和TM-1 為正常苞葉，T582 為窄卷苞葉。以陸地棉T582 為母本，分別與父本陸地棉TM-1、海島棉3-79 雜交構(gòu)建2個F2分離群體。群體1（T582×TM-1）F2群體包含370 個單株；群體2（T582×3-79）F2群體包含2 667 個單株。2021 年4 月28 日，將親本、F1及F2種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所東場試驗基地（河南省安陽縣）。3 個親本分別種植3 行，群體1 種植約10 行，群體2 種植約70 行，行長均為8 m，行距為0.80 m，株距為0.25 m。田間管理措施同當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)棉田。

1.2 苞葉表型調(diào)查

開花后（7 月中旬至8 月底），調(diào)查棉花苞葉表型。與T582 表型一致的記為窄卷苞葉，與TM-1 或3-79 表型一致的記為正常苞葉，并進(jìn)行卡方（χ2）適合性檢驗，以確定F2群體的苞葉性狀是否符合3∶1 的分離比。

1.3 分子標(biāo)記的開發(fā)

根據(jù)Li 等[4]的定位結(jié)果，窄卷苞葉目標(biāo)基因被定位在A03 染色體長臂上分子標(biāo)記NAU3016和NAU3172 之間，目標(biāo)基因與這2 個分子標(biāo)記的遺傳距離分別為0.3 cM 和4.7 cM?；诖耍狙芯拷Y(jié)合海島棉3-79[9]和陸地棉TM-1[10]參考基因組數(shù)據(jù)，利用IGV（integrative genomics viewer）軟件來查找Indel 位點，選取插入或缺失10 bp 以上的位點，共設(shè)計了20 對Indel 分子標(biāo)記引物。所有引物序列均由DNAMAN 軟件設(shè)計獲得，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（引物序列見表1）。

采用十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethylammonium bromide,CTAB）法提取T582 和3-79親本的基因組DNA。采用TaqDNA 聚合酶（購自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司）進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR），PCR 反應(yīng)體系：緩沖液10 μL，模板DNA 1 μL，10 μmol·L—1正反向引物各1 μL，加ddH2O 至20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，35 個循環(huán)；72 ℃5 min 。將PCR 產(chǎn)物在3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的瓊脂糖凝膠中電泳分離，以篩選出在親本間有多態(tài)性的Indel 分子標(biāo)記。

1.4 精細(xì)定位

利用篩選出的多態(tài)性Indel 分子標(biāo)記，以提取的親本及群體2 單株的基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，利用瓊脂糖凝膠電泳分析親本及F2各個單株的擴(kuò)增條帶類型，統(tǒng)計交換單株數(shù)量，精細(xì)定位目的基因候選區(qū)間。DNA 提取、PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳方法同1.3。

1.5 定位區(qū)間內(nèi)候選基因預(yù)測

根據(jù)精細(xì)定位結(jié)果得到候選區(qū)間，在棉花功能基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫（https://cottonfgd.net/）中根據(jù)陸地棉TM-1 參考基因組[10]獲得候選區(qū)間內(nèi)功能基因的注釋信息。從棉花多組學(xué)數(shù)據(jù)庫（http://cotton.zju.edu.cn/）獲取候選區(qū)間內(nèi)的基因在TM-1 不同組織器官（根、莖、葉、花托、花瓣、花藥、雌蕊、花萼、副萼、發(fā)育的胚珠和纖維）中的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，基于FPKM （fragments per kilobase of exon model per million mapped reads，每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段）對基因表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2(FPKM+1)標(biāo)準(zhǔn)化處理，使用R軟件pheatmap 包繪制基因表達(dá)量的熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 苞葉性狀調(diào)查及遺傳分析

對2 個F2群體進(jìn)行田間性狀調(diào)查，選取開花后15 天（15 days post anthesis,15 DPA）和30 DPA苞葉進(jìn)行表型統(tǒng)計分析（圖1）。群體1 中正常苞葉單株有285 株，窄卷苞葉單株有85 株，卡方適合性檢驗結(jié)果顯示，分離群體的性狀分離比為3∶1（χ2＝0.86＜χ20.053.84），符合孟德爾遺傳分離定律。群體2 中正常苞葉單株2 015 株，窄卷苞葉單株652 株，卡方適合性檢驗結(jié)果顯示，分離群體的性狀分離比為3∶1（χ2＝0.45＜χ20.05＝3.84），符合孟德爾遺傳分離定律（表2）。因此，棉花窄卷苞葉基因fg為隱性單基因調(diào)控，與前人的研究結(jié)果[5]一致。

圖1 正常苞葉和窄卷苞葉形態(tài)對比Fig.1 Morphology comparison of normal bract and frego bract

表2 F2 作圖群體中窄卷苞葉和正常苞葉分離比Table 2 Segregation ratio of frego bract and normal bract in the F2 mapping populations

2.2 Indel 標(biāo)記的開發(fā)與篩選

根據(jù)Li 等[4]對fg的定位結(jié)果，本研究在A03染色體上物理區(qū)間1.87～3.85 Mb 內(nèi)，開發(fā)了20對Indel 分子標(biāo)記，在親本T582 和3-79 之間進(jìn)行多態(tài)性篩選，共篩選到6 對具有多態(tài)性的Indel分子標(biāo)記，分別為M1、M2、M3、M4、M5 和M6（引物序列信息參見表1）。

2.3 窄卷苞葉基因fg 的精細(xì)定位

利用篩選出的6 對多態(tài)性Indel 分子標(biāo)記，首先對群體2 的300 個單株（其中正常苞葉單株237 株，窄卷苞葉單株63 株）的基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增檢測，將候選區(qū)間縮小在分子標(biāo)記M1 與M4 之間，物理距離為861 kb（圖2）。

圖2 fg 基因的定位Fig.2 Mapping of fg gene

利用M1、M2、M3、M4 分子標(biāo)記對群體2 中2 667 個單株的基因組DNA 進(jìn)行檢測，根據(jù)重組數(shù)據(jù)，進(jìn)一步將候選區(qū)間縮小至分子標(biāo)記M3 與M4 之間，分子標(biāo)記序列被錨定到陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1 基因組[10]A03 染色體2 757 376～2 946 245 bp，物理距離為188 kb（圖2）。

2.4 候選區(qū)間基因預(yù)測

結(jié)合基因組注釋結(jié)果，188 kb 定位區(qū)間內(nèi)存在14 個功能注釋基因（表3）。其中，Gh_A03G021400、Gh_A03G021500編碼乙醛酸/ 羥基丙酮酸還原酶HPR3；Gh_A03G021600編碼RALF-like 26 蛋白；Gh_A03G021700編碼STAY-GREEN 1 蛋白（葉綠體）；Gh_A03G021800編碼 Agamous-like MADS-box 蛋白 AGL19；Gh_A03G021900編碼同源異型盒蛋白knotted-1-like 7；Gh_A03G022000、Gh_A03G022100、Gh_A03G022200、Gh_A03G022300、Gh_A03G022400、Gh_A03G022500均編碼抗病蛋白；Gh_A03G022600編碼雙功能dTDP-4-脫氫鼠李糖-3,5-差向異構(gòu)酶/dTDP-4-脫氫鼠李糖還原酶；Gh_A03G022700編碼羥甲基戊二酰輔酶A 合酶。

表3 定位區(qū)間內(nèi)候選基因的注釋信息Table 3 Annotation information of candidate genes in the mapping interval

根據(jù)這14 個功能注釋基因在棉花不同組織器官中的相對表達(dá)量數(shù)據(jù)，在花萼和副萼中Gh_A03G021700、Gh_A03G021900、Gh_A03G022600、Gh_A03G022700基因的表達(dá)量較高；Gh_A03G021500、Gh_A03G022600、Gh_A03G022700基因在3DPA、5DPA 胚珠和10DPA纖維中高表達(dá)；Gh_A03G021900基因在花藥、雌蕊、10 DPA 胚珠和20 DPA 的纖維中高表達(dá)；Gh_A03G021400、Gh_A03G021600、Gh_A03G021800、Gh_A03G022000、Gh_A03G022100、Gh_A03G022200、Gh_A03G022300、Gh_A03G022400、Gh_A03G022500基因在不同組織器官（根、莖、葉、花托、花瓣、花藥、雌蕊、花萼、副萼、發(fā)育的胚珠和纖維）中的表達(dá)量均較低（圖3）。

圖3 定位區(qū)間內(nèi)14 個注釋基因的表達(dá)模式分析Fig.3 Expression pattern analysis of 14 annotated genes in the mapping interval

3 討論

新疆是我國最大的機(jī)采棉生產(chǎn)基地。機(jī)采技術(shù)減少了勞動力投入，降低了棉花生產(chǎn)成本，大大提高了棉農(nóng)的植棉經(jīng)濟(jì)收益，但機(jī)采棉普遍含雜率較高，給棉花的后續(xù)加工帶來了一定的困難。原棉雜質(zhì)主要包括干枯葉片、干枯苞葉和異性纖維等；其中干枯葉片和異性纖維能夠通過及時采摘吐絮籽棉，嚴(yán)格遵守采收加工規(guī)定等方法得到有效控制；而干枯苞葉難以剔除，原因在于苞葉緊貼棉鈴，吐絮后苞葉雖然枯死但仍緊貼在籽棉上不能自行脫落，在機(jī)械采摘時易將其混入籽棉[11]。棉花窄卷苞葉突變體在吐絮期表現(xiàn)為苞葉自然下卷，至采收期干枯苞葉與籽棉分離，且處在鈴殼之下，因此可以降低機(jī)采棉的含雜率，利于提高棉花纖維品質(zhì)。

棉花窄卷苞葉突變體表現(xiàn)為苞葉狹長、扭曲翻轉(zhuǎn)生長，花蕾和棉鈴裸露，植株對棉鈴象甲、棉鈴蟲、棉紅鈴蟲、金剛鉆等害蟲具有一定抗性[4,12]。殺蟲劑對窄卷苞葉棉株的使用效果更好，研究表明，噴灑藥劑后附著在此類花苞和棉鈴上的殺蟲藥劑量是正常苞葉的7 倍[13]。本研究對棉花窄卷苞葉基因fg進(jìn)行了精細(xì)定位，并對定位區(qū)間內(nèi)的14 個候選基因進(jìn)行了功能注釋，發(fā)現(xiàn)有6個基因被注釋為抗病蛋白，但其具體的作用機(jī)制尚不清楚。另外，有研究表明窄卷苞葉基因?qū)γ藁ㄉ?、產(chǎn)量、衣分、單株果枝數(shù)、蕾鈴脫落率和纖維品質(zhì)均無明顯不良效應(yīng)[14-16]。綜上，棉花窄卷苞葉突變體具有降低機(jī)采棉含雜率、增強(qiáng)植株抗蟲性等優(yōu)勢，且對棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)無顯著不利影響，具有一定的育種利用價值。

近年來，棉花基因組學(xué)的快速發(fā)展為棉花功能基因的定位及克隆奠定了堅實的基礎(chǔ)[10,17-20]，混合分組分析法[21]、全基因組關(guān)聯(lián)分析[22]（genomewide association study, GWAS）等方法也逐漸成為挖掘功能基因的重要手段，有效促進(jìn)了棉花功能基因的研究進(jìn)程。在前人研究基礎(chǔ)上，本研究將棉花fg基因定位在A03 染色體上分子標(biāo)記M3和M4 之間，區(qū)間大小為188 kb；區(qū)間內(nèi)有14 個注釋的功能基因，其中Gh_A03G021700、Gh_A03G021900、Gh_A03G022600、Gh_A03G022700基因在花萼、副萼中高表達(dá)，因此推測這4 個基因為可能的窄卷苞葉候選基因。未來將通過進(jìn)一步的精細(xì)定位、圖位克隆、功能驗證等方式確定棉花窄卷苞葉的調(diào)控基因并解析其作用機(jī)制。

4 結(jié)論

棉花窄卷苞葉由隱性單基因調(diào)控。在前人工作基礎(chǔ)上，利用陸地棉T582 和海島棉3-79 構(gòu)建F2分離群體，將窄卷苞葉基因fg精細(xì)定位在A03 染色體上分子標(biāo)記M3 與M4 之間，物理距離為188 kb。該區(qū)間內(nèi)存在14 個功能注釋基因，其中Gh_A03G021700、Gh_A03G021900、Gh_A03G022600和Gh_A03G022700基因在花萼和副萼中高表達(dá)。本研究為棉花窄卷苞葉基因fg的圖位克隆和育種利用奠定了基礎(chǔ)。