不可分型流感嗜血桿菌生物膜在兒童慢性肺部感染中的作用

陳虹宇 劉梓豪 王和平 廖翠娟 李 莉 王文建 賴(lài)建威

深圳市兒童醫(yī)院（廣東深圳 518038）

流感嗜血桿菌是常見(jiàn)的機(jī)會(huì)致病菌，常在上、下呼吸道中分離到菌株[1-3]。B型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗在國(guó)內(nèi)兒童人群中的廣泛接種[4]，使不可分型流感嗜血桿菌成為兒童呼吸道感染的主要病原菌。生物膜的生成在流感嗜血桿菌抵抗抗生素治療中起重要作用，尤其是在中耳炎和慢性阻塞性肺疾病中進(jìn)行了很多生物膜生成的研究[5-7]，但是針對(duì)兒童肺部慢性感染，如支氣管擴(kuò)張、持續(xù)性細(xì)菌性支氣管炎和慢性化膿性肺疾病中生物膜的生成研究較少。本研究從健康兒童鼻咽部和住院的肺部感染患兒肺泡灌洗液中分離培養(yǎng)流感嗜血桿菌，進(jìn)行生物膜體外生成能力比較，對(duì)流感嗜血桿菌在兒童肺部感染中不易被清除造成慢性感染的原因進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 流感嗜血桿菌菌株

從深圳市兒童醫(yī)院臨床微生物室樣本庫(kù)中，選取2019年2月至2021年10月從健康兒童（健康對(duì)照組）鼻咽部和肺部感染住院兒童（肺部感染組）肺泡灌洗液中分離培養(yǎng)的流感嗜血桿菌。肺部感染組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡1 個(gè)月至14 歲；②符合肺部感染診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，肺實(shí)質(zhì)和/或肺間質(zhì)部位感染引起機(jī)體不同程度缺氧和感染癥狀，通常有發(fā)熱、咳嗽、呼吸增快、肺部濕性啰音，胸部影像學(xué)顯示斑片狀浸潤(rùn)影、葉或段實(shí)變影、磨玻璃影或間質(zhì)性改變伴或不伴胸腔積液；③行支氣管鏡檢查并灌洗；④灌洗液分離的臨床菌株經(jīng)質(zhì)譜儀（梅里埃VITEK MS，法國(guó)）鑒定為流感嗜血桿菌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①排除肺結(jié)核，肺部腫瘤，非感染性肺間質(zhì)性疾病，肺水腫，肺栓塞，肺血管炎等疾病；②無(wú)法獲取知情同意。健康對(duì)照組來(lái)自本院兒童保健科健康體檢兒童。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡3 個(gè)月至14 歲；②鼻咽部無(wú)感染；③鼻咽部分離的臨床菌株經(jīng)質(zhì)譜儀（梅里埃VITEK MS，法國(guó)）鑒定為流感嗜血桿菌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有鼻或肺部慢性基礎(chǔ)疾??；②兩周內(nèi)有呼吸道感染癥狀；③無(wú)法獲取知情同意。根據(jù)感染后病程長(zhǎng)短將肺部感染組分為急性和慢性肺部感染組，急性肺部感染為病程＜1個(gè)月，慢性肺部感染病程≥1個(gè)月[9]。

本研究獲得深圳市兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（No.2016013）。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 健康兒童和住院患兒臨床資料從醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)調(diào)取，包括年齡、性別、治療結(jié)局。

1.2.2 流感嗜血桿菌分離 肺部感染住院患兒包括急性和慢性肺部感染，因臨床需要首次進(jìn)行支氣管鏡檢查并灌洗，灌洗液進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)，包括肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌等常見(jiàn)細(xì)菌。按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》標(biāo)準(zhǔn)，送檢的肺部感染患兒灌洗液混勻后，用定量接種環(huán)分別取10 μL 接種至血平板、麥康凱平板、嗜血巧克力平板上，所有平板放入5% CO2、35 ℃孵箱培養(yǎng)，24和48 h后觀(guān)察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，在嗜血巧克力平板上觀(guān)察疑似流感嗜血桿菌菌落形態(tài)細(xì)菌。對(duì)疑似菌落進(jìn)行分純，所分離的臨床菌株均經(jīng)質(zhì)譜儀（梅里埃VITEK MS，法國(guó)）鑒定。健康兒童在適合進(jìn)行計(jì)劃疫苗接種時(shí)用鼻咽拭子采集鼻咽部分泌物接種到血平板和嗜血巧克力平板上，培養(yǎng)條件和分離鑒定與灌洗液一致。

1.2.3 流感嗜血桿菌分型 從流感嗜血桿菌提取細(xì)菌總DNA，進(jìn)行流感嗜血桿菌莢膜基因（bexA）的PCR檢測(cè)，以B型流感嗜血桿菌ATCC10211為陽(yáng)性對(duì)照，凝膠電泳觀(guān)察PCR 產(chǎn)物，對(duì)流感嗜血桿菌進(jìn)行分型。

1.2.4 不可分型流感嗜血桿菌生物膜生成檢測(cè) 按照不同人群分離培養(yǎng)的不可分型流感嗜血桿菌分組，分別在培養(yǎng)第1、2、3、4和7天的時(shí)間點(diǎn)，采用結(jié)晶紫染色方法，酶標(biāo)儀檢測(cè)生物膜的生成情況。將所有菌株懸液稀釋至2.0×107U/mL，200 μL/孔接種在96微孔板中，每組做3復(fù)孔試驗(yàn)，無(wú)菌培養(yǎng)液作空白對(duì)照，在5% CO2、37 ℃條件下孵育。在第1、2、3、4、7 天取出相應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間的標(biāo)本，用無(wú)菌超純水洗滌3次，除去雜質(zhì)和未黏附的細(xì)菌，然后用0.5%（體積/重量）結(jié)晶紫染液染色15 min，無(wú)菌蒸餾水洗滌后，90%乙醇脫去染液，酶標(biāo)儀在620 nm濾光片測(cè)量吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。非正態(tài)分布計(jì)量資料以M（P25～P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

共選取流感嗜血桿菌101株，肺泡灌洗液分離培養(yǎng)的流感嗜血桿菌排除非感染性疾病10株，健康兒童鼻咽部分離培養(yǎng)的流感嗜血桿菌排除慢性鼻竇炎2株。最終選取流感嗜血桿菌89株，其中健康對(duì)照組34株，慢性肺部感染組30株，急性肺部感染組25株。健康對(duì)照組男18例、女16例，采集樣本時(shí)中位年齡12.5（6～38）月；慢性肺部感染組男16例、女14例，中位年齡48.0（36.0～87.0）月；急性肺部感染組男14例、女11例，中位年齡36.0（12.0～60.0）月。三組間性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.06，P=0.970），年齡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.66，P＜0.001）；急性和慢性感染組年齡均高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。所有肺部感染患兒均治愈出院。

2.2 流感嗜血桿菌分型

采用流感嗜血桿菌B型標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC10211）作為陽(yáng)性對(duì)照，所有臨床菌株和標(biāo)準(zhǔn)株提取細(xì)菌總DNA后，對(duì)莢膜基因bexA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，在凝膠成像儀下觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)臨床菌株全部為不可分型流感嗜血桿菌（圖1）。

圖1 部分流感嗜血桿菌分型結(jié)果

2.3 不可分型流感嗜血桿菌生物膜在不同時(shí)間點(diǎn)體外生成情況

慢性肺部感染組在不同時(shí)間點(diǎn)（第1、2、3、4、7天）之間的吸光度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），慢性感染組在第4 天的吸光度中位數(shù)為最高。急性肺部感染組和健康對(duì)照組吸光度中位數(shù)變化不大，不同時(shí)間點(diǎn)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組不可分型流感嗜血桿菌生物膜形成情況[M(P25～P75)]

第4天，健康對(duì)照組、急性肺部感染和慢性肺部感染組之間的吸光度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），慢性肺部感染組吸光度高于健康對(duì)照組和急性肺部感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

自B 型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗推廣使用以來(lái)，不可分型流感嗜血桿菌已經(jīng)成為主要的條件致病菌之一，主要引起兒童中耳炎和社區(qū)獲得性肺炎或老年人慢性阻塞性肺病惡化[10-13]。本研究中所有從健康兒童鼻咽部或者肺部感染患兒肺泡灌洗液[14]分離到的均為不可分型流感嗜血桿菌，與國(guó)內(nèi)外研究一致[15-16]，說(shuō)明在本地區(qū)流行的主要菌株為不可分型流感嗜血桿菌。

大量研究表明，不可分型流感嗜血桿菌形成生物膜可能是此種細(xì)菌發(fā)病機(jī)制中的重要一步。本研究分析不同人群呼吸道分離的不可分型流感嗜血桿菌生物膜體外生成情況，發(fā)現(xiàn)慢性肺部感染患兒肺泡灌洗液分離菌株生成能力最強(qiáng)，與中耳炎反復(fù)感染和慢性阻塞性肺疾病患者分離菌株類(lèi)似[7,17]，考慮慢性感染中，不可分型流感嗜血桿菌在肺部長(zhǎng)期生存，部分菌株通過(guò)生物膜的生成以逃避抗生素對(duì)其的清除。另外也有研究發(fā)現(xiàn)，不可分型流感嗜血桿菌生物膜與急性感染或反復(fù)感染中耳炎的治療沒(méi)有直接關(guān)系[18]，因此不可分型流感嗜血桿菌生物膜抵抗抗生素治療的作用機(jī)制還需更深入的研究。而健康兒童鼻咽部定植菌株和急性肺部感染分離菌株生物膜體外生成能力比較一致，提示急性肺部感染時(shí)，不可分型流感嗜血桿菌可能與兒童當(dāng)時(shí)的身體狀況相關(guān)，而與菌株自身的特征如生物膜的生成關(guān)系不大，但需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究中，肺部感染特別是慢性感染患兒，臨床樣本采集時(shí)的中位年齡為48個(gè)月，可能與診斷慢性感染需要多次反復(fù)感染有關(guān)[3,12,19]，而急性感染患兒肺泡灌洗液采集時(shí)年齡為36個(gè)月，也顯著高于健康對(duì)照組，可能與不可分型流感嗜血桿菌引起急性肺部感染后重癥患兒年齡偏大有關(guān)。所有肺部感染患兒治療后均治愈出院，生物膜在兒童肺部感染中的作用還需深入研究。在兒童中耳炎和成人慢性阻塞性肺疾病中，不可分型流感嗜血桿菌生物膜的生成機(jī)制是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[7,20]，在兒童慢性肺部感染中的不可分型流感嗜血桿菌生物膜生成機(jī)制和作用機(jī)制是否與中耳炎或者慢性阻塞性肺疾病一致需進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究中對(duì)照組為健康兒童鼻咽部分離菌株，菌株分離的部位不同可能對(duì)結(jié)果有一定的影響。但是健康兒童鼻咽部分離菌株和急性肺部感染菌株，在生物膜生成上基本一致，提示急性感染可能大部分是從鼻咽部定植菌或環(huán)境中的菌株直接進(jìn)入肺部引起感染。另外，結(jié)晶紫方法檢測(cè)生物膜生成為經(jīng)典方法，與目前采用共聚焦顯微鏡方法檢測(cè)生物膜的生成可能存在一定差異[21]，有待于今后進(jìn)一步研究探討。