SIX2在骨肉瘤組織中表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞血管生成與阿霉素耐藥逆轉(zhuǎn)的影響*

王熠欣 張世才 黃海燕 陳晨 張斯 劉穎 王有南

(華北醫(yī)療健康集團(tuán)峰峰總醫(yī)院,河北 邯鄲 056201)

骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是侵襲力極強(qiáng)的惡性腫瘤之一,目前臨床上OS患者5年內(nèi)的生存率不足20%[1-2]。臨床治療骨肉瘤時(shí)化療雖能提高骨肉瘤患者生存率,且5年內(nèi)患者存活率高達(dá)80%,但大部分患者仍出現(xiàn)骨肉瘤復(fù)發(fā)[3]。在臨床上阿霉素(Doxorubicin,Dox)是化療常用的藥物,其可發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用起到治療腫瘤的作用[4-5]。有學(xué)者研究證實(shí)患者長(zhǎng)期使用阿霉素治療會(huì)出現(xiàn)耐藥性,具有高轉(zhuǎn)移和高復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[6]。因此探究骨肉瘤的耐藥機(jī)制,并尋找新的治療骨肉瘤的方法是十分必要的。同源異性蛋白家族SIX屬于轉(zhuǎn)錄因子中的一種,介導(dǎo)腫瘤的多種生物學(xué)活性[7]。目前,SIX家族中研究最多的成員為SIX1,與胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤密切相關(guān),尤其在乳腺癌中SIX1能通過介導(dǎo)糖酵解基因的表達(dá)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[8]。且有研究證實(shí),通過降低骨肉瘤細(xì)胞中SIX1高表達(dá)可有效調(diào)控其生活學(xué)活性,SIX2與SIX1為同一家族轉(zhuǎn)錄因子,相似度極高[9]。但目前對(duì)SIX2在腫瘤中的研究較少,且其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的生物活性尚不明確。因此,本研究探討骨肉瘤組織中SIX2的表達(dá)及其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞血管生成及阿霉素耐藥的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年3月—2021年12月我院行骨肉瘤手術(shù)切除的105例患者的組織標(biāo)本,將新鮮的骨肉瘤組織和癌旁組織標(biāo)本存于-80℃的冰箱中。選擇病理學(xué)診斷為骨肉瘤的患者,且患者未經(jīng)過任何治療。骨肉瘤患者組織標(biāo)本中,男性51例,女性54例;患者年齡10～45歲。

1.2 細(xì)胞系、試劑與儀器 人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)細(xì)胞中心,人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVCEs)購(gòu)自陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科實(shí)驗(yàn)室。干擾SIX2表達(dá)的特異性siRNA(si-SIX2)質(zhì)粒,合成的非特異性RNA(si-NC)質(zhì)粒、LipofectamineTM2000(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司),注射用阿霉素(北京百奧萊博科技有限公司),DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素(雙抗)(美國(guó)Gibco公司),TRIzol、MTT試劑盒(美國(guó)Sigma公司),高速低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)。

1.3 免疫組化染色觀察骨肉瘤組織及癌旁正常組織SIX2的染色情況 將骨肉瘤組織及癌旁正常組織標(biāo)本固定于10%福爾馬林溶液中,包埋組織并切成5 μm組織切片,烤箱烘干。用檸檬酸緩沖液浸泡組織薄片,修復(fù)組織3 min后孵育,15 min后將組織薄片用BSA封閉1 h,加入一抗SIX2和CD31即用型,4 ℃繼續(xù)孵育組織過夜;后將二抗加入到組織中,孵育20 min后用DAB顯色液顯色組織,用蘇木素充分染色組織,封片后于顯光鏡下觀察組織薄片變化。根據(jù)半定量積分法[10]對(duì)陽性結(jié)果判定:首先將骨肉瘤組織切片置于顯微鏡下觀察,分別計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞總數(shù)量,并計(jì)算二者間比值?？偡?jǐn)?shù)=陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)比評(píng)分和染色強(qiáng)度評(píng)分的乘積(表1)。MVD計(jì)數(shù):本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)[11]中Weidner法計(jì)數(shù)MVD,選標(biāo)本中3個(gè)微血管富集區(qū)域,用顯微鏡觀察標(biāo)本中微血管的數(shù)量,MVD值為平均值。

表1 分?jǐn)?shù)評(píng)分表

1.4 RT-PCR檢測(cè)SIX2基因表達(dá)水平 將凍存于-80 ℃冰箱中的骨肉瘤組織標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本取出,各100 mg。將組織標(biāo)本充分剪碎,于冰上裂解組織并提取RNA。根據(jù)試劑盒中的反轉(zhuǎn)錄法操作,得到cDNA模板后進(jìn)行熒光反應(yīng)實(shí)驗(yàn),內(nèi)參為GAPDH。在95 ℃ 3 min,95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s的反應(yīng)條件下,對(duì)SIX2基因進(jìn)行擴(kuò)增。2-△△CT法計(jì)算組織匯總SIX2表達(dá)。引物序列見表2。

表2 引物序列表

1.5 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇MG-63和HUVECs細(xì)胞,均接種于6孔板中,分別加入含雙抗的DMEM培養(yǎng)基和ECM培養(yǎng)基,均培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。

1.6 阿霉素耐藥細(xì)胞株建立 將處于對(duì)數(shù)期的MG-63細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)基中,先在培養(yǎng)基中加入0.1 μg/mL的阿霉素48 h,棄掉培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞于不含阿霉素的培養(yǎng)基中,細(xì)胞傳代后,將MG-63細(xì)胞培養(yǎng)于含濃度為0.2 μg/mL的阿霉素培養(yǎng)基中48 h;根據(jù)以上方法逐漸增加阿霉素濃度,直至阿霉素濃度為5 μg/mL時(shí)MG-63細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)停止誘導(dǎo),得到的細(xì)胞即為骨肉瘤阿霉素耐藥細(xì)胞株MG-63/R。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 胰蛋白酶消化骨肉瘤細(xì)胞株MG-63和阿霉素耐藥細(xì)胞株MG-63/R,培養(yǎng)細(xì)胞于6孔板中24 h,當(dāng)細(xì)胞融合度為80%以上時(shí)加入無血清的培養(yǎng)基終止消化,根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染并分組。將MG-63細(xì)胞分為MG-63組(不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒)、si-NC A組(MG-63細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-NC空病毒載體)、si-SIX2 A組(MG-63細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-SIX2慢病毒)。將MG-63/R細(xì)胞分為MG-63/R組(不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒)、si-NC B組(MG-63/R細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA-NC空病毒載體)、si-SIX2 B組(MG-63/R細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA-SIX2慢病毒)。培養(yǎng)各組細(xì)胞24 h后用于實(shí)驗(yàn)。

1.8 MG-63細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備 取處于對(duì)數(shù)期的MG-63細(xì)胞,消化細(xì)胞為懸液,將細(xì)胞懸液接種于含DMEM培養(yǎng)基中的6孔板內(nèi),孵育細(xì)胞懸液24 h,在孔板的每孔中分別加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)液,離心機(jī)離心后沉淀,收集上清液即為培養(yǎng)基,于-20 ℃冰箱保存。

1.9 HUVCEs小管形成試驗(yàn) 在96孔板內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞,在孔板內(nèi)加入Matrigel基質(zhì)膠和無血清DMEN培養(yǎng)基,充分混勻后孵育培養(yǎng)板30 min,待基質(zhì)膠成半固體且基質(zhì)膠表面無殘留的液體。在交替凝固時(shí),取出HUVECs細(xì)胞并消化,加入1.8中各組培養(yǎng)基,按照1∶1的比例和內(nèi)皮細(xì)胞充分混合至培養(yǎng)液,重懸后加入到孔板中的每孔中,8 h后用顯微鏡觀察小管的形成能力。

1.10 MTT檢測(cè)MG-63/R細(xì)胞耐藥敏感性 取各組MG-63/R細(xì)胞接種于96孔板中,培養(yǎng)貼壁,加入終濃度為5 μg/mL的阿霉培養(yǎng)48 h,在孔板內(nèi)加入MTT溶液,孵育細(xì)胞4 h,將孔板內(nèi)MTT溶液替換成DMSO溶液,檢測(cè)各孔吸光度值(OD),并計(jì)算IC50和耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(FR)。

1.11 克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 取各組MG-63/R細(xì)胞,消化細(xì)胞并培養(yǎng)于常規(guī)培養(yǎng)箱。梯度稀釋懸液,在恒溫的培養(yǎng)皿中降細(xì)胞懸液稀釋,孵育懸液14 d,后結(jié)晶紫染色細(xì)胞。洗滌后將培養(yǎng)皿倒置并覆蓋在透明網(wǎng)格上,在顯微鏡下(低倍率)計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆,后計(jì)算集落形成率。

1.12 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 消化各組MG-63/R細(xì)胞至懸液。取Transwell小室,在上室中加入懸液300 μL,下室加入含血清培養(yǎng)基,孵育小室24 h。將小室取出置于甲醛中,25 min后加入結(jié)晶紫,讓細(xì)胞均勻染色。用顯微鏡觀察細(xì)胞穿模數(shù)量。

1.13 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡能力 用96孔板培養(yǎng)MG-63/R細(xì)胞24 h,加入1× binding buffer,10 μL Annexin V和20 μL PI于孔板內(nèi),配置Annexin V/PI 染色工作液后將原有的培養(yǎng)基全部棄掉。將細(xì)胞置于孵育箱中,加入胰蛋白酶裂解細(xì)胞,后離心取上清液,孵育15 min后檢測(cè)凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤組織和癌旁正常組織中SIX2免疫組化染色情況比較 與癌旁正常組織相比,骨肉瘤組織SIX2陽性表達(dá)率明顯升高(P<0.001),見圖1和表3。

圖1 骨肉瘤組織和癌旁正常組織中SIX2免疫組化染色(200×)

表3 骨肉瘤組織和癌旁正常組織中SIX2陽性率比較[n(×10-2)]

2.2 SIX2表達(dá)與骨肉瘤MVD的相關(guān)性 骨肉瘤組織中SIX2陽性表達(dá)患者M(jìn)VD值明顯高于骨肉瘤組織中SIX2呈陰性患者(P<0.05),見表4、圖2。提示骨肉瘤組織微血管生成與SIX2高表達(dá)相關(guān)。

圖2 CD31染色微血管密度變化(200×)

表4 骨肉瘤組織中SIX2表達(dá)與MVD相關(guān)性

2.3 骨肉瘤組織中SIX2 mRNA表達(dá)比較 骨肉瘤組織中SIX2 mRNA表達(dá)較癌旁正常組織中表達(dá)增加(P<0.05),見圖3。

圖3 骨肉瘤腫瘤組織和癌旁正常組織中SIX2 mRNA表達(dá)比較

2.4 骨肉瘤腫瘤組織中SIX2表達(dá)水平與臨床病理特征比較 骨肉瘤組織中SIX2表達(dá)與TNM、軟組織浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)。Ⅲ～Ⅳ骨肉瘤組織中SIX2水平高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05);有組織浸潤(rùn)和淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織中SIX2表達(dá)高于無組織浸潤(rùn)和淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織(P<0.05)。見表5。

2.5 敲低SIX2表達(dá)對(duì)HUVECs小管生成的影響 各組細(xì)胞由CM誘導(dǎo)HUVECs形成小管樣結(jié)構(gòu)的能力相比,si-SIX2 A組顯著低于MG-63組(P<0.05),且si-NC A組和MG-63組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖4。

圖4 敲低SIX2表達(dá)對(duì)HUVECs小管生成的影響

2.6 敲低SIX2表達(dá)對(duì)MG-63/R耐藥、增殖、凋亡、侵襲能力的影響 和MG-63/R組相比,si-SIX2 B組細(xì)胞IC50、細(xì)胞克隆數(shù)和細(xì)胞侵襲能力均顯著降低,細(xì)胞凋亡能力明顯增加,細(xì)胞耐藥指數(shù)逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.51倍(P<0.05);MG-63/R組和si-NC B組細(xì)胞IC50、細(xì)胞克隆數(shù)、細(xì)胞侵襲能力、細(xì)胞凋亡能力相比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖5。

圖5 敲低SIX2表達(dá)對(duì)MG-63/R耐藥、增殖、凋亡、侵襲能力的影響

3 討論

目前,臨床采用手術(shù)切除來治療低級(jí)別的髓內(nèi)型、表面型骨肉瘤,但對(duì)于高級(jí)別骨肉瘤或轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者的治療需先化療,再進(jìn)行其他治療,因此化療骨肉瘤患者的治療尤為重要。文獻(xiàn)顯示,臨床化療骨肉瘤的一線藥物為阿霉素[12]。阿霉素雖然顯著提高骨肉瘤患者的生存率和保肢率,但阿霉素耐藥仍會(huì)影響骨肉瘤的治療效果[13]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),骨肉瘤化療失敗的因素之一為腫瘤轉(zhuǎn)移[14]。文獻(xiàn)顯示,腫瘤中新生的血管會(huì)為腫瘤轉(zhuǎn)移提供條件[15-16]。就理論而言,手術(shù)、化療聯(lián)合抗血管生成治療可有效抑制晚期骨肉瘤轉(zhuǎn)移患者腫瘤轉(zhuǎn)移。但目前晚期骨肉瘤的分子機(jī)制尚不明確,血管靶向治療的臨床研究均未取得有效療效。因此,尋找抗骨肉瘤血管生成和逆轉(zhuǎn)骨肉瘤阿霉素耐藥的靶點(diǎn)是目前學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。

SIX1是SIX家族成員之一其通過在多種惡性腫瘤,包括骨肉瘤細(xì)胞中的促癌作用介導(dǎo)細(xì)胞的分化、增殖和侵襲。SIX2和SIX1高度同源,有研究證實(shí)SIX1在腎母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)顯著升高,因此推測(cè)二者具有相似性[9]。有研究發(fā)現(xiàn),敲除腫瘤細(xì)胞中SIX1的表達(dá)不能抑制腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)活性,但卻檢測(cè)出了SIX2呈高表達(dá),提示SIX2可能彌補(bǔ)SIX1在腫瘤中的作用[17]。有文獻(xiàn)顯示,SIX1在卵巢癌中的表達(dá)明顯高于正常卵巢組織,進(jìn)一步證明了SIX1能夠促進(jìn)卵巢癌腫瘤細(xì)胞的增殖[18]。本研究結(jié)果顯示,SIX2在骨肉瘤組織中高表達(dá),且患者M(jìn)VD值也顯著高于骨肉瘤組織中SIX2陰性患者,提示SIX2介導(dǎo)骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展。且骨肉瘤患者的TNM分期、軟組織浸潤(rùn)和淋巴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均影響骨肉瘤組織中SIX2表達(dá),進(jìn)一步證明了SIX2對(duì)骨肉瘤的進(jìn)展有促進(jìn)作用。隨后本研究通過體外實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)了敲除SIX2能抑制腫瘤細(xì)胞的血管生成能力。丁帥等[19]研究證實(shí),通過敲除骨肉瘤組織中SIX1基因表達(dá),可有效調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)活性。

SIX2是一種發(fā)育調(diào)節(jié)的同源蛋白,在大多數(shù)正常成人組織中表達(dá)有限,在多種惡性腫瘤中經(jīng)常錯(cuò)誤表達(dá),由SIX2誘導(dǎo)的腫瘤病變表現(xiàn)出不同的分化,并表現(xiàn)出腫瘤進(jìn)展為侵襲性的惡性腫瘤[20]。本研究驗(yàn)證了SIX2對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生物活性的調(diào)控作用,為驗(yàn)證SIX2為骨肉瘤阿霉素耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)影響,本研究通過敲低SIX2表達(dá)發(fā)現(xiàn),MG-63/R細(xì)胞株阿霉素耐藥得到了有效的逆轉(zhuǎn),同時(shí)能有效調(diào)控MG-63/R細(xì)胞生物學(xué)活性。

4 結(jié)論

SIX2在骨肉瘤組織高表達(dá)和血管生成密切相關(guān),可通過抑制SIX2表達(dá)抑制骨肉瘤血管生成能力,逆轉(zhuǎn)骨肉瘤細(xì)胞阿霉素耐藥。